專利名稱：功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及功能化納米硒的應用，特別涉及功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
癌癥已經成為威脅人類生命健康的頭號殺手，世界各國高度重視癌癥的預防與治療，開發高效、低毒、廣譜、高選擇性的抗癌藥物成為長期的戰略目標。腫瘤的生長、惡化、浸潤和轉移與新血管生成密切相關，新血管生成與腫瘤的生長兩者之間存在著相互促進的關系。一方面，腫瘤細胞通過分泌某些特異性促血管生成因子，誘發新的毛細血管從周圍組織內的宿主血管壁長出，并朝向腫瘤生長，進一步深入到腫瘤 組織內部；另一方面，新形成的血管為腫瘤的生長、轉移和惡化提供必需的營養、氧氣以及代謝產物排除的通道，同時也為腫瘤轉移提供通路，起到了促進腫瘤生長、轉移的作用。因此，新血管生成與腫瘤生長是互為依賴、互為因果的關系，兩者結合使腫瘤組織不斷向前發展。近年來，抑制腫瘤血管形成的藥物得到了廣泛的關注和高度重視，人們希望尋找到高效的治療腫瘤藥物，即在抑制腫瘤的同時阻斷腫瘤血管的形成，從而切斷腫瘤的來源，發揮最有效的抗腫瘤效果。腫瘤血管靶向治療成為腫瘤治療的主攻方向之一，并為臨床提供了新的治療途徑和有效藥物，是腫瘤治療研究上的一個重大突破。納米藥物作為抗腫瘤藥物和基因輸運載體，由于其緩釋作用從而延長藥物作用時間，可達到靶向輸送藥物的目的，進而增強藥物效應，減輕不良反應，提高藥物穩定性，納米藥物還可采取一些新的給藥途徑等，因而在醫藥領域得到廣泛應用。硒具有提高人體免疫力、抗氧化、延緩衰老和防癌、抗癌的作用，功能化納米硒在生物活性方面具有更多的優勢，我們通過對納米硒進行功能上的修飾，發揮了納米硒的抗腫瘤活性和抑制腫瘤血管形成的雙重功能。最近已有研究報道了金納米粒子通過占據VEGF165與肝素結合區域的位點而抑制VEGF165誘導HUVEC細胞的增殖，銀納米粒子能夠靶向激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制VEGF介導的血管生成。至今未發現有關納米硒用于制備抑制腫瘤和腫瘤血管生成藥物的報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其中功能化納米硒為活性成分，其具有抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物的作用；所述的功能化納米硒優選為Y-轉鐵蛋白修飾的納米硒，Y為雜多酸(雜多藍)、沒食子酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C或半胱氨酸；所述的雜多酸的結構式為HXM12O4tl或HX2M18O62 ;其中，X = Si、P或B ;M = Mo、W或V；所述的Y為雜多酸時，所述的功能化納米硒，即雜多酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒，優選通過如下方法制備得到(I)將雜多酸溶于水配制成lmol/L的溶液，用濃度為lmol/L的HAc-NaAc緩沖溶液調節溶液pH為3. 5 5. 5，在惰性氣體保護下進行電解還原，當電解達到兩電子還原時，停止電解，將電解液置于真空干燥環境中，使其晶體析出，對析出的晶體進行2 3次重結晶，得到雜多藍化合物；(2)將步驟(I)制備的雜多藍化合物配制成0. 5mmol/L的溶液，將其滴加至0. 5 lmmol/L的含硒溶液中混合均勻，其中雜多酸溶液與含硒溶液的摩爾比在3 : I 8 : I;加熱至70 80°C反應24h，得到雜多藍修飾的納米硒；(3)取雜多藍修飾的納米硒配制成0. 5mmol/mL溶液,取5mL,用0. ImmoI/mL的雜多酸溶液調節其pH在2. 3 5. 0，得到溶液A ;將轉鐵蛋白用三乙醇胺配制成0. 2mmol/mL的溶液，在不斷攪拌下滴加到溶液A中，過程中始終保持pH值為2. 3 5. 0 ;繼續攪拌4 24h，4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗漆，干燥，得到雜多酸(藍)-轉鐵蛋白修飾的納米硒。步驟(I)中所述的惰性氣體優選為氮氣；步驟(I)中所述的電解還原優選為采用恒電位儀進行反應；步驟(I)中所述的還原的程度通過銅庫侖計指示；步驟(2)中所述的水優選為超純水或是蒸餾水；步驟(2)中所述的含硒溶液優選為亞硒酸鈉溶液或二氧化硒溶液；步驟(2)中所述的加熱可于帶有聚四氟乙烯內襯的反應釜中加熱或是通過微波加熱；步驟(3)中所述的洗滌優選為使用PBS緩沖液洗滌；步驟(3)中所述的干燥的條件優選為于70°C干燥2天；所述的Y為沒食子酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C或半胱氨酸時，所述的功能化納米硒，優選通過如下方法制備得到(I)將Y與亞硒酸鈉或二氧化硒混合形成均一的水溶液，調水溶液的pH值為
2.5 3. 0，Y與亞硒酸鈉或二氧化硒的摩爾為5 : I 7 : I ;于70 80°C水浴中加熱至溶劑揮發至干，得到橙紅色的Y修飾的納米硒，將此樣品加蒸餾水溶解、定容，得到ImM納米硒溶膠；(2)取納米硒溶膠配制成0. 5mmol/mL溶液，取5mL，調節其pH在2. 3 5. 0，得到溶液A ;將轉鐵蛋白用三乙醇胺配制成0. 2mmol/mL的溶液，在不斷攪拌下滴加到溶液A中， 過程中始終保持PH值為2. 3 5. 0 ;繼續攪拌4 24h，4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，干燥，得到功能化納米硒；步驟(2)中所述的pH優選通過鹽酸調節，更優選通過0. lmol/L鹽酸調節；步驟(2)中所述的洗滌優選為使用超純水洗滌；步驟⑵中所述的干燥的條件優選為于70°C干燥2天。
本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(I)本發明提供功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用。本發明人發現納米硒不僅具有抗腫瘤的作用，而且具有抑制腫瘤血管生成的作用。(2)本發明制備的雜多酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒或沒食子酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒，直接以過量的雜多酸或沒食子酸與單質納米硒耦合，制備過程無需添加其它輔助試劑、產物體系簡單，產品可直接保存和使用。(3)本發明采用的修飾劑提高了功能化納米硒的靶向性以及在細胞中的轉運和跨膜吸收，能夠增加細胞的藥物攝取量，減少外排，從而保證細胞內藥物維持在較高水平。


圖I是十二鎢磷酸修飾的納米硒形貌圖。 圖2是十二鎢磷酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒形貌圖。圖3是沒食子酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒的透視電鏡(TEM)圖。圖4是功能化納米硒對血管內皮細胞遷移的影響結果圖。圖5是功能化納米硒對雞胚尿囊膜血管抑制作用結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。本發明所用原料的純度只要達到化學純以上即可，來源均可從市場購得。實施例I雜多酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒的制備(I)稱取L 5g十二鶴磷酸溶于2mL蒸懼水中配制成0. 5mol/L儲存液,用lmol/L的HAc-NaAc緩沖溶液調節pH = 3. 5 5. 5，在凡氣氛圍下，采用恒電位儀進行控制電位電解還原，還原程度通過銅庫侖計指示，當電解達到兩電子還原時，停止電解，將電解液置于真空干燥器內，使其晶體析出，對析出的晶體進行2 3次重結晶，得到處理后的雜多藍化合物。(2)將十二鎢磷酸雜多藍配制成0. 5mmol/L的溶液，在不斷攪拌下，將其滴加至加0. 5 lmmol/L的亞硒酸鈉溶液中混合均勻，最終十二鎢磷酸雜多藍與亞硒酸鈉的摩爾比為2 I 4 I，然后將混合溶液放入帶有聚四氟乙烯內襯的反應釜中，加熱至80 90°C反應4 24小時，或者將混合溶液放入微波反應器中加熱至70 80°C反應4 24小時；至形成紅色的十二鎢磷酸修飾的納米硒溶膠。通過TEANAI-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖I所示。得到納米粒子的分散體系，其粒徑在20 40nm。該納米粒子能在室溫下穩定存在，容易保存。(3)取上述納米硒配制成5mL 0. 5mmol/mL溶液,用0. Immol/mL的雜多酸溶液調節其pH在2. 3 5. 0之間，將轉鐵蛋白用三乙醇胺配制成0. 2mmol/mL的溶液，在不斷攪拌下滴加到上述納米硒溶液中，過程中始終保持溶液pH在2. 3 5. 0之間，繼續攪拌12 48h，4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，用PBS緩沖液洗滌3次，產物于70°C條件下干燥2d，得到雜多酸(藍)_轉鐵蛋白修飾的納米硒。其形貌通過TEANAI-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖2所示。得到納米粒子的分散體系，其粒徑在30 lOOnm。該納米粒子能在室溫下穩定存在，容易保存。實施例2沒食子酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒的制備將Na2SeO3用蒸懼水配制成5mmol/L的溶液,沒食子酸用蒸懼水配制成5mmol/L的溶液，在不斷攪拌下將沒食子酸溶液滴加到亞硒酸鈉溶液中，用0. lmol/L的鹽酸溶液調pH為2. 8 3. 5，70°C水浴中加熱至溶劑揮發至干得橙紅色納米硒樣品。 (2)取上述納米硒配制成0. 5mmol/mL溶液,用0. Immol/mL的鹽酸溶液調節其pH在2. 3 5. 0之間，將轉鐵蛋白用三乙醇胺配制成0. 2mmol/mL的溶液，在不斷攪拌下滴加到上述納米硒溶液中，過程中始終保持溶液pH在2. 3 5. 0之間，繼續攪拌12 24h，4°C下放置12h，離心分離，超純水洗滌，產物于70°C條件下干燥2d，得到沒食子酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒。其形貌通過TEANAI-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖3所示。其粒徑在30 lOOnm。該納米粒子能在室溫下穩定存在，各易保存。實施例3作為抗腫瘤藥物的體外實驗本實驗選擇多種購自ATCC公司的腫瘤細胞株，人惡性黑色素瘤細胞(A375)、人肝癌細胞(HepG2)、人結腸癌細胞(SW480)、人前列腺癌(PC-3)、人乳腺癌細胞(MCF-7)、人肺腺癌細胞(A549)。所試樣品編號為a(十二鎢磷酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒)、b(十二鎢磷酸修飾的納米硒溶膠)、c (沒食子酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒)、d(沒食子酸修飾的納米硒溶膠)和順鉬。(I)MTT測試方法取處于對數生長期的腫瘤細胞，調整活細胞濃度為2X 104/ml加于96孔培養板，每孔100 Ii 1，在培養箱中培養24h待貼壁后，再分別加入不同濃度受試樣品100 V- I,陰性對照為等體積生理鹽水，陽性對照為順鉬，加樣組和對照組均設4個復孔，置37°C，5 % C02培養72h，然后加入MTT (5mg/ml) 20 U I/孔，5h后離心棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO) IOOu I/孔，振蕩IOmin左右，用酶標儀在570nm波長下測定OD值。計算細胞存活率，通過軟件計算其半數抑制濃度IC50。細胞存活率)=加藥孔的實際OD值/陰性對照孔的OD值；細胞抑制率(％ ) = 100% -細胞存活率；實驗結果見表I。可見，本發明提供的十二鎢磷酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒或是沒食子酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒具有一定的脂溶性和水溶性，易為人體吸收，在體外試驗中對腫瘤細胞具有很強的抑制作用，比順鉬的療效要好，且具有廣譜的抗腫瘤作用。顯示良好的應用價值，特別適合制備成抗腫瘤藥物。表I.納米硒體外抗腫瘤活性
權利要求
1.功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用。
2.根據權利要求I所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的功能化納米硒為Y-轉鐵蛋白修飾的納米硒，Y為雜多酸、沒食子酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C或半胱氨酸。
3.根據權利要求2所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的雜多酸的結構式為HXM12O4tl或HX2M18O62 ;其中，X = Si、P或B ;M = Mo、W或V。
4.根據權利要求2所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的Y為雜多酸時，所述的功能化納米硒為雜多酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒，其通過如下方法制備得到 (1)將雜多酸溶于水配制成lmol/L的溶液，用濃度為lmol/L的HAc-NaAc緩沖溶液調節溶液pH為3. 5 5. 5，在惰性氣體保護下進行電解還原，當電解達到兩電子還原時，停止電解，將電解液置于真空干燥環境中，使其晶體析出，對析出的晶體進行2 3次重結晶，得到雜多藍化合物； (2)將步驟(I)制備的雜多藍化合物配制成O.5mmol/L的溶液，將其滴加至O. 5 lmmol/L的含硒溶液中混合均勻，其中雜多酸溶液與含硒溶液的摩爾比在3 : I 8 : I;加熱至70 80°C反應24h，得到雜多藍修飾的納米硒； (3)取雜多藍修飾的納米硒配制成O.5mmol/mL溶液,取5mL,用O. Immo I/mL的雜多酸溶液調節其pH在2. 3 5. 0，得到溶液A ;將轉鐵蛋白用三乙醇胺配制成O. 2mmol/mL的溶液，在不斷攪拌下滴加到溶液A中，過程中始終保持pH值為2. 3 5. O ;繼續攪拌4 24h，4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，干燥，得到雜多酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒。
5.根據權利要求4所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于步驟(I)中所述的惰性氣體為氮氣； 步驟(I)中所述的電解還原為采用恒電位儀進行反應； 步驟(I)中所述的還原的程度通過銅庫侖計指示。
6.根據權利要求4所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于步驟(2)中所述的水為超純水或是蒸餾水； 步驟(2)中所述的含硒溶液為亞硒酸鈉溶液或二氧化硒溶液； 步驟(2)中所述的加熱為于帶有聚四氟乙烯內襯的反應釜中加熱或是通過微波加熱。
7.根據權利要求4所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于步驟(3)中所述的洗滌為使用PBS緩沖液洗滌； 步驟(3)中所述的干燥的條件為于70°C干燥2天。
8.根據權利要求2所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的Y為沒食子酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C或半胱氨酸時，所述的功能化納米硒通過如下方法制備得到 (I)將Y與亞硒酸鈉或二氧化硒混合形成均一的水溶液，調水溶液的pH值為2. 5 、3.0，Y與亞硒酸鈉或二氧化硒的摩爾為5 : I 7 : I ;于70 80°C水浴中加熱至溶劑揮發至干，得到橙紅色的Y修飾的納米硒，將此樣品加蒸餾水溶解、定容，得到ImM納米硒溶膠；(2)取納米硒溶膠配制成O. 5mmol/mL溶液，取5mL，調節其pH在2. 3 5. O，得到溶液A ;將轉鐵蛋白用三乙醇胺配制成O. 2mmol/mL的溶液，在不斷攪拌下滴加到溶液A中，過程中始終保持PH值為2. 3 5. O ;繼續攪拌4 24h，4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，干燥，得到功能化納米硒。
9.根據權利要求8所述的功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于步驟(2)中所述的pH為通過鹽酸調節； 步驟(2)中所述的洗滌為使用超純水洗滌； 步驟(2)中所述的干燥的條件為于70°C干燥2天。
全文摘要
本發明公開了功能化納米硒在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物中的應用。本發明人發現功能化納米硒不僅具有抗腫瘤的作用，而且具有抑制腫瘤血管生成的作用。因此，功能化納米硒能作為活性成分在抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤藥物進行應用。本發明制備的功能化納米硒，如雜多酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒或沒食子酸-轉鐵蛋白修飾的納米硒，直接以過量的雜多酸或沒食子酸與單質納米硒耦合，制備過程無需添加其它輔助試劑、產物體系簡單，產品可直接保存和使用。本發明采用的修飾劑提高了功能化納米硒的靶向性以及在細胞中的轉運和跨膜吸收，能夠增加細胞的藥物攝取量，減少外排，從而保證細胞內藥物維持在較高水平。
文檔編號A61P35/00GK102631683SQ201210101200
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者劉亞楠, 劉杰, 周艷暉, 孫冬冬, 張蓉 申請人:暨南大學