專利名稱：癌毒方在制備調控肝癌細胞TLRs／NF-κB信號轉導藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域的細胞生物學、分子生物學技術，具體地說是涉及癌毒方藥物的新用途，即在制備調控肝癌細胞信號轉導藥物中的應用。背景技術：
肝癌是嚴重危害人類生命健康的重 大疾病之一，是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來死亡率增加了 41. 17%，其發病率和死亡率還正在逐年升高。肝癌具有發現晚、發展快、治療難、預后差等特點，被稱為“癌中之王”，由于其早期癥狀隱匿，多數患者就診時已屬中晚期，能手術切除者甚少，即使手術切除，術后5年復發率仍高達60%以上，小肝癌復發率也高達40%-50%。西醫治療肝癌以直接對抗某一病理環節發揮作用，而許多患者或為彌漫性肝癌、或伴有腹水、腎功能不全，難以接受手術、肝動脈栓塞化療、冷凍等治療。以中醫理論為基礎治療肝癌則是對機體整體調節，發揮多層次、多環節、多靶點的綜合作用，無論是在抑制、殺傷癌細胞，調節機體免疫功能，還是改善癥狀、提高生存質量、延長生命上都顯示出獨特的優勢。長期以來，中醫藥在治療肝癌方面取得了一定的臨床療效，尤其以中醫理論為基礎形成的中藥復方治療肝癌更能充分發揮辨證論治和對機體整體調節的優勢，中醫藥抗肝癌作用越來越得到國際社會的關注和承認，但中醫藥治療肝癌存在的核心問題是其作用機理不清，尤其是對創新性理論指導下形成的名老中醫抗肝癌效驗方的現代機制研究還不夠。我國著名中醫藥專家周仲瑛教授根據近六十年的臨床實踐，提出了“癌毒”學說，他認為癌毒是腫瘤發生發展的關鍵，是在腫瘤發病過程中體內產生的一種特殊的病理因素，癌毒是腫瘤患者在正虛的基礎上，因體內邪盛而生毒，癌毒與痰濁、瘀血、濕濁、熱毒等病理因素同時膠結存在、互為因果，亦可兼夾轉化、共同為病。癌毒一旦形成，阻滯體內，則病變乖戾，一方面大量耗傷人體氣血津液，一方面導致臟腑氣血功能失調,誘生痰濁、瘀血、濕濁、熱毒等多種病理因素，并耗氣傷陰，發生各種復雜證候，表現出邪毒囂張、難以消除、易于傳變、病情篤重、病勢兇險、正氣虛敗、預后極差等證候特點。癌毒方正是在“癌毒”理論指導下確立的中醫藥治療惡性腫瘤的基本方。本方主要由白花蛇舌草、僵蠶、太子參、麥冬、山慈菇、蜈蚣、八月扎等組成，全方共奏清熱化痰、祛瘀散結、消癌解毒之功效，在臨床上治療惡性腫瘤患者顯示出很好的療效。在繼承名老中醫經驗的基礎上，如何將其有效驗方進一步總結與驗證，是名老中醫傳承工作一項重要的課題。本研究以人肝癌SMMC-7721細胞株作為研究對象，探討癌毒方的抗肝癌作用機制。近年來，隨著Toll樣受體(TLRs)的發現及其豐富生物學功能的進一步揭示，以及Toll樣受體/核因子-KB (TLRs / NF-kB)信號通路的部分闡明，為探討中醫藥抗癌機制開啟了新的思路與方法。本研究以TLRs / NF-K B通路為切入點進行癌毒方抗癌機制研究。TLRs是新近發現的存在于生物機體中的一大類非常重要的模式識別受體(PRR)，可表達于多種免疫細胞及上皮細胞，機體多種免疫防御反應(包括腫瘤免疫)均需要不同TLRs的參與。根據TLRs的信號傳遞是否包含髓樣分化因子88 (MyD88)，TLRs信號通路又分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性兩種途徑，再通過一系列反應,激活核因子-K B(NF-k B)，激活的NF-κ B進入細胞核內，調控多種重要的細胞因子、粘附分子和趨化因子的表達，在機體的免疫應答、炎癥反應、細胞增殖、分化及凋亡調控等方面發揮重要的作用。目前研究比較多的是TLRs / NF-κ B通路對炎癥性疾病、自身免疫性疾病、肝臟疾病、哮喘、冠狀動脈粥樣硬化等的影響。近年來，人們發現多種腫瘤細胞表面也表達TLRs，它們可被存在于局部的配體激活，刺激腫瘤細胞分泌過量腫瘤相關蛋白及細胞因子，這些因子可刺激腫瘤細胞生長、血管和淋巴管生成、腫瘤的浸潤轉移、導致T細胞和NK細胞功能失調等，即腫瘤細胞表面表達的TLRs可能與腫瘤細胞生長、免疫逃逸及化療耐藥相關。如在人類部分黑色素瘤細胞中，透明質烷碎片能夠通過TLR4誘導產生細胞因子和MMP，這些物質恰能促進腫瘤生長，而產生的MMP又能溶解細胞間質產生透明質烷，這種正反饋調節形成惡性循環，加速腫瘤惡化；Kelly等研究發現卵巢癌能通過TLR4-MyD88通路激活NF-κ B，誘導致炎細胞因子產生，促進腫瘤生長，同時在試驗中還發現卵巢癌可能通過TLR4-MyD88-NF- κ B通路抵抗抗腫瘤藥物紫杉醇誘導的凋亡。 研究表明，TLRs / NF-KB通路有雙重作用，既可能通過增強宿主免疫功能而發揮抗腫瘤作用，又可能起保護腫瘤細胞，逃脫免疫監視的作用。一些研究發現中藥可通過影響免疫細胞中TLRs / NF-κ B通路而發揮抗腫瘤作用，而中藥直接對腫瘤細胞此通路影響的研究，目前國內外未見報導。
發明內容
本發明的目的在于提供癌毒方在制備調控肝癌細胞信號轉導藥物中的應用。本發明是以人肝癌SMMC-7721細胞株為材料，觀察癌毒方的抗肝癌作用機制，本研究以TLRs / NF-κ B通路作為新靶點，從細胞因子表達的源頭TLRs入手，觀察癌毒方對肝癌模型鼠細胞TLRs/NF- κ B通路關鍵環節TLR4、NF- κ B、髓樣分化因子88 (MyD88)的影響探討抗癌作用機制。具體實驗如下
I材料與方法 含藥血清制備
將家兔分為中藥組和對照組，每組3只。中藥組分別以低、中、高劑量消癌解毒中藥灌胃，對照組以生理鹽水灌胃，各組每日I次連續3d，于最后一次灌胃后2h無菌取血，離心分離血清，用O. 2um微孔濾膜抽濾滅菌，經56°C、30 min滅活以去除血清中補體，為含藥血清，置-20°C保存備用。細胞培養及分組
人SMMC-7721肝癌細胞株在含10%新生小牛血清的DMEM/High培養液中，37°C，5% 二氧化碳的孵箱中培養，隔天換培養液，細胞復蘇時每天換一次培養液，細胞生長滿單層細胞瓶后，以O. 25%胰蛋白酶消化傳代I 2min后，待倒置顯微鏡下細胞圓縮時，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培養液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細胞，吹打均勻后分至新細胞培養瓶，加培養液，放入37°C，5% 二氧化碳的孵箱中培養；分為空白對照組、空白血清+激動劑組、空白+阻斷劑組、低濃度含藥血清組、低+激動劑組、低+阻斷劑組、中濃度含藥血清組、中+激動劑組、中+阻斷劑組、高濃度含藥血清組、高+激動劑組、高+阻斷劑組12組。法觀測
MTT篩選藥物濃度的預實驗將LPS終濃度設定為2. 5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml 五個濃度梯度，0)284 終濃度設定為 O. 25ug/ml、0. 5ug/ml、lug/ml、2ug/ml、4ug/ml五個濃度梯度，分別于第12、24、48、72h進行四甲基偶氮噻唑藍(MTT)實驗，計算增殖率。在無菌條件下，將細胞培養瓶中貼壁生長滿的人SMMC-7721肝癌細胞株以O. 25%胰蛋白酶消化，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培養液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細胞，吹打成均勻的單細胞懸液，將細胞濃度調整為lX104/ml，接種于96孔培養板，陰性空白對照組每孔加入180ul細胞懸液+20ul過濾純水，實驗組中LPS及⑶284組加入不同 濃度的藥物(終濃度擴大10倍之濃度)，每組每種濃度設6個復孔，加藥后分別培養12、24、48、72h，之后，加入20ul/孔濃度為5mg/ml的MTT，培養4h，棄去上清液，每孔加入150ul的DMSO,輕輕震蕩約IOmin使其完全溶解，酶標儀檢測490nm波長處的OD值，計算抑制率，細胞生長抑制率(IR) = (1_用藥組OD/對照組OD) X 100%，本實驗重復四次。初步確定LPS終濃度40ng/ml，⑶284終濃度4ug/ml作用24h時細胞增殖抑制率測定并經統計學處理有顯著差異(P〈0. 05)。正式MTT實驗分為激動劑組和阻斷劑組，每組分別設陰性空白對照組，在無菌條件下，將細胞培養瓶中貼壁生長滿的人SMMC-7721肝癌細胞株以O. 25%胰蛋白酶消化，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培養液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細胞，吹打成均勻的單細胞懸液，分裝至IOml尖底離心管，離心1000轉X6min，棄上清液后加入單培，將細胞濃度調整為IX 104/ml，接種于96孔培養板，陰性空白對照組及低、中、高濃度含藥血清組每孔加入160ul細胞懸液+20ul PBS+20ul空白、低、中、高濃度含藥血清，實驗組中LPS及⑶284組加入不同濃度的藥物(終濃度擴大10倍之濃度)160ul細胞懸液+20ulLPS或⑶284+20ul空白、低、中、高濃度含藥血清，每組每種濃度設6個復孔，加藥后分別培養24h，之后酶標儀檢測490nm波長處的OD值，計算抑制率，細胞生長抑制率(IR)=(I-用藥組OD/對照組OD) X 100%,本實驗重復三次。法檢測癌毒方對TLR4、MyD88及NF- κ B蛋白表達的影響
蛋白免疫印跡雜交(Western Blot、WB)是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜(blot)上，然后通過一抗/ 二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。其中的步驟包括蛋白樣本提取制備，蛋白定量，電泳，轉膜與顯色。依據MTT篩選藥物濃度的預實驗、正式試驗及流式細胞術(單、雙染)，取LPS終濃度40ng/ml，CD284終濃度4ug/ml及最佳藥物作用時間為24h，制定WB方案為陰性空白對照組、空白血清+激動劑組、空白+阻斷劑組、低+激動劑組、中+激動劑組、中+阻斷劑組、高+激動劑組、高+阻斷劑組8組。經過蛋白樣本提取制備，Western Blotting,①SDS-PAG的制備,②樣本準備和上樣電泳，將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為70ug，并于95-100°C 5min后冰上冷卻上樣。電泳條件濃縮膠恒壓60V約20min，分離膠80V約80min。③濕電轉移，轉膜準備取出凝膠，置于轉移緩沖液中平衡15min。準備濾紙及NC膜，分別置入轉移緩沖液及去離子水中。濕電轉移平放底部電極(陽極)，在上面分別放置濾紙、NC膜、凝膠和濾紙，排除各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流200mA通電，電轉移lh。④封閉，NC膜在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(室溫，2h)，棄去封閉液，不洗。⑤抗體與靶蛋白結合，按約O. lml/cm2的量加入封閉液和適量一抗NFKB-P65 (1:1000), TLR2/TLR4/TRAF6 (1:500) 搖床搖蕩孵育(4°C，過夜)。PBST 漂洗濾膜4次，每次lOmin。將膜與HRP結合的二抗(辣根過氧化酶標記羊抗兔，二抗用封閉液稀釋)(1:5000)室溫下搖蕩孵育2h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次lOmin。⑥顯影和圖像分析，按O. lml/cm2顯影液計算用量，將顯影液加于NC膜上，室溫放置lmin。用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機中顯影、洗像。調整曝光時間，直至出現最佳條帶。統計學方法
實驗數據以 ±s表示，采用SPSSI7. O統計軟件，根據方差齊性采用單因素方差分析和q檢驗比較各組間差異，以P〈0. 05或P〈0. 01為差異有統計學意義。結果
在信號通路阻斷劑、激動劑存在的情況下，觀察癌毒方對人肝癌細胞株SMMC-7721的抑制作用如表1、2所示
表I MTT結果(I)
權利要求
1.癌毒方在制備調控肝癌細胞TLRs / NF-K B信號轉導藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及癌毒方制藥中調控肝癌細胞信號轉導通路的用途。癌毒方依據國醫大師周仲瑛教授癌毒理論，由蛇舌草3-20g；僵蠶3-10g；蜈蚣1-3條；八月扎3-12g；太子參3-15g；麥冬3-12g；山慈菇3-10g制成，全方以驅邪消癌解毒為主，輔以扶正，經臨床應用，顯示出較好的抗腫瘤療效。本發明以人肝癌細胞株SMMC-7721為材料，觀察該方體外抗癌作用，結果表明:癌毒方具有良好的抑制人肝癌細胞SMMC-7721增殖的作用，該方與TLRs/NF-KB信號轉導通路的阻斷劑CD284有協同作用，能阻斷TLR4表達，抑制下游NF-кB蛋白表達，促進腫瘤細胞凋亡。
文檔編號A61P35/00GK102652802SQ20121011401
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者吳勉華, 周紅光, 李棟, 王明艷, 程海波, 陳海彬 申請人:南京中醫藥大學