骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應用。具體地，外源骨形成蛋白（BMPs）具有誘導肝癌干細胞分化的作用，BMP4可使肝癌細胞系的CD133蛋白表達下調，促進肝癌細胞系CD133+肝癌干細胞分化；BMP4還能夠抑制肝癌細胞系的體外增殖和自我更新，抑制免疫缺陷小鼠的成瘤能力。本發明還提供了BMP4誘導肝癌干細胞分化的作用機制。
【專利說明】骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域，具體地，本發明涉及骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應用。
【背景技術】
[0002]肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范圍內第五大高發腫瘤，也是第三大的腫瘤致死病因。隨著對腫瘤研究不斷進展，手術治療、放射治療和化學治療都成功使腫瘤瘤體縮小，但是肝癌術后復發和轉移仍然十分普遍，常常導致肝癌患者的最終死亡。近年來，針對腫瘤易于復發與轉移的特性，研究者發現了腫瘤干細胞(Cancer StemCells, CSCs),并認為腫瘤干細胞的發生和發展對肝癌發揮了重要作用。
[0003]腫瘤干細胞(CSCs)是一群存在于腫瘤細胞系或腫瘤組織中為數不多、但具有低分化、高耐藥性和高抗放射治療的特性的特殊腫瘤細胞，它們可以在體內或體外成為分化程度更高的腫瘤細胞，對其進行分選和分離，并接種于免疫缺陷小鼠體內后，CSCs可以形成與其來源腫瘤細胞分化層級一致的腫瘤組織。雖然臨床治療可以殺死大部分的腫瘤細胞，但治療過程中CSCs的殘存，經常導致腫瘤的復發甚至轉移。CSCs在體外除具有干細胞的基本特征(自我更新和分化潛能)，還具有如下特征:(I) CSCs可以通過特定細胞表面標志物來分離；(2)多數CSCs可以在懸浮培養條件下形成球形克隆,或稱腫瘤球(tumorspheres);
[3]CSCs對化療藥物和放射線具有很強的耐受性。大多數的腫瘤的進展都與癌干細胞有關。在肝癌研究中，多種細胞標志物都被認為能夠有效富集肝癌干細胞群，包括EpCAM、CD133、0V6、⑶90和SP細胞。跨膜蛋白⑶133可以作為肝癌CSCs的一種表面標志物，⑶133+的肝癌CSCs在體外具有更高的克隆形成能力，并且在免疫缺陷小鼠體內更容易形成腫瘤。
[0004]⑶133是prominin-Ι基因編碼的蛋白，基因定位于染色體4ρ15.32，編碼含865個氨基酸的蛋白，其相對分子質量120kD，是一種5次跨膜糖蛋白。CD133的mRNA在許多正常組織細胞中表達，但CD133蛋白的表達僅限于未分化細胞中，如內皮祖細胞、造血干細胞、胎兒腦干細胞與前列腺上皮干細胞等。在腫瘤研究中，CD133主要用于標記腫瘤細胞中CSC群，100個⑶133+腦腫瘤CSCs在裸鼠體內6個月即可形成腫瘤，而10萬個⑶133—腫瘤細胞在相同時間內未在裸鼠體內形成腫瘤。
[0005]但迄今為止，研究者對⑶133+肝癌CSC的分化及其調控機制并不十分清楚。因此本領域迫切需要開發能夠影響肝癌干細胞分化的藥物。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是提供一種誘導肝癌干細胞分化的藥物及其應用。
[0007]在本發明的第一方面，提供了一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述用途為選自下組的一種或多種的用途:
[0008](a)用于制備治療肝癌的藥物；
[0009](b)用于制備促進肝癌干細胞的分化的組合物；。[0010](C)用于制備抑制肝癌體外增殖和/或自我更新的組合物；
[0011](d)用于制備抑制肝癌的成瘤能力的組合物；
[0012](e)用于制備提高肝癌細胞對抗腫瘤劑敏感性的組合物；
[0013](f)用于制備降低肝癌細胞耐藥性的組合物。
[0014]在另一優選例中，所述的治療是分化治療肝癌。
[0015]在另一優選例中，所述的組合物為藥物組合物。
[0016]在另一優選例中，所述的肝癌干細胞是人或非人哺乳動物的肝癌干細胞。
[0017]在另一優選例中，所述的非人哺乳動物包括靈長目動物、嚙齒動物(如小鼠、大鼠)等ο
[0018]在另一優選例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳動物的BMP4蛋白、或其具有相同誘導肝癌干細胞分化功能的同源蛋白、突變蛋白或衍生蛋白。
[0019]在本發明的第二方面，提供了一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述的用途為選自下組的一種或多種用途:
[0020](a)用于制備治療癌癥的藥物；
[0021](b)用于制備促進癌癥干細胞的分化的組合物；
[0022](c)用于制備抑制癌癥的體外增殖和/或自我更新的組合物；
[0023](d)用于制備抑制癌癥的成瘤能力的組合物；
[0024](e)用于制備提高癌癥細胞對抗腫瘤劑的敏感性的組合物；
[0025](f)用于制備降低癌癥細胞的耐藥性的組合物。
[0026]在另一優選例中，所述的癌癥是實體瘤，或所述的癌癥細胞來源于實體瘤。
[0027]在另一優選例中，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地，為肝癌。
[0028]在本發明的第三方面，提供了一種體外非治療性的誘導肝癌干細胞分化的方法，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養肝癌干細胞，從而誘導肝癌干細胞的分化。
[0029]在另一優選例中，將肝癌干細胞與含BMP4蛋白的溶液進行接觸或混合，然后進行培養。
[0030]在另一優選例中，培養體系中BMP4蛋白的濃度≥30ng/ml，較佳地≥50ng/ml，更佳地 > 100ng/mlo
[0031]在另一優選例中，所述的BMP4蛋白為BMP4單體、或BMP4同二聚體，或BMP4異二聚體、或BMP4的融合蛋白(保留BMP4活性)，較佳地為BMP4同二聚體。
[0032]在另一優選例中，所述方法還包括步驟:在步驟(I)之前、之中或之后，在培養體系中添加額外的抗腫瘤劑。
[0033]在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑包括化療藥、腫瘤抗體等。
[0034]在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑包括(但并不限于):阿霉素、長春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU、或其組合。
[0035]在本發明的第四方面，提供了一種提高腫瘤細胞對抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細胞的耐藥性的方法，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養腫瘤細胞，從而提高腫瘤細胞對抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細胞的耐藥性。
[0036]在另一優選例中，所述的腫瘤細胞包括選自下組癌癥的腫瘤細胞:肝癌、肺癌、胃癌，更佳地為肝癌。
[0037]在本發明的第五方面，提供了一種緩釋藥物組合物，所述的藥物組合物包括藥學上可接受的載體和作為活性成分的BMP4蛋白，且組合物為緩釋劑型。
[0038]在另一優選例中，所述組合物包括緩釋顆粒以及吸附于緩釋顆粒的BMP4蛋白。
[0039]在另一優選例中，所述的緩釋顆粒由生物可降解材料(如聚乳酸，聚丙烯酸)制成。
[0040]在另一優選例中，所述的緩釋藥物組合物為注射劑。
[0041]在另一優選例中，所述的緩釋藥物組合物的給藥方式為局部給藥或瘤內給藥。
[0042]在另一優選例中，所述的BMP4蛋白包括BMP4單體、或BMP4同二聚體，或BMP4異二聚體、或BMP4的融合蛋白(保留BMP4活性)。
[0043]在另一優選例中，所述的BMP4蛋白單體是由Genbank數據庫中登錄號為NM_001202.3、NM_130850.2、或NM_130851.2所示的核苷酸序列編碼的。
[0044]在另一優選例中，所述的緩釋藥物組合物還包括額外的抗腫瘤劑。
[0045]在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑包括化療藥、腫瘤抗體等。
[0046]在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑包括(但并不限于):阿霉素、長春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU或其組合。
[0047]在本發明的第六方面，提供了一種用于治療腫瘤的藥盒，所述藥盒包括:
[0048](a)第一治療劑，所述第一治療劑是含BMP4作為活性的藥物制劑；
[0049](b)第二治療劑，所述第二治療劑是抗腫瘤劑，所述的抗腫瘤劑含有不同于BMP4的活性成分；和
[0050](C)使用說明書。
[0051]在本發明的第七方面，提供了一種治療腫瘤或誘導腫瘤細胞分化的方法，包括步驟:給需要的對象施用BMP4蛋白或第五方面所述的緩釋藥物組合物。
[0052]在另一優選例中，所述的癌癥是實體瘤；較佳地，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地為肝癌。
[0053]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
[0055]圖1顯示⑶133是PLC/PRF/5細胞系的CSC表面標志物；其中，圖1A顯示不同肝癌細胞系中⑶133+細胞率；圖1B顯示PLC/PRF/5細胞中，⑶133+細胞％約為52%，通過流式分選后得到的⑶133+/⑶133-肝癌細胞群的分選純度達到90%以上；圖1C顯示，PLC/PRF/5⑶133+細胞群腫瘤球形成的數目和大小均大于⑶133-細胞群；圖1D顯示，多種干細胞相關基因在PLC/PRF/5CD133+細胞群中表達上調。
[0056]圖2顯示，高濃度外源性BMP4處理肝癌細胞后其⑶133+細胞比例下降；其中，圖2A顯示采用流式細胞分析法分析PLC/PRF/5 (PLC)和Huh7細胞中CD133+細胞率，結果顯示高濃度外源性BMP4處理6天后兩種細胞系中的CD133+細胞率分別有原來的約52.1 %下降至32.9%，和約73.0%下降至47.5%。
[0057]圖3顯示，外源性BMP4可以降低肝細胞癌細胞中⑶133蛋白表達；其中，圖3A顯示用0-100ng/ml不同濃度的外源性BMP4處理PLC/PRF/5CD133+/CD133-細胞中CD133蛋白的表達情況；圖3B顯示50ng/ml BMP4處理不同時間后PLC/PRF/5細胞中CD133蛋白的表達情況；圖3C顯示采用Western Blot法分析50ng/ml BMP4處理6天后，Huh7細胞中⑶133蛋白表達情況。
[0058]圖4顯示，外源性高濃度BMP4抑制PLC/PRF/5細胞增殖但不引起凋亡，其中，圖4A顯示BrdU-ELISA法檢測0-100ng/ml不同濃度BMP4處理3天對PLC/PRF/5細胞增殖能力的影響；圖4B顯示Annexin V/7-AAD雙標法檢測50ng/mlBMP4處理后PLC/PRF/5細胞凋亡率的變化。
[0059]圖5顯示，高濃度外源性BMP4誘導肝癌CSCs的分化，其中，圖5A顯示通過Real-time PCR檢測分別在CDM懸浮培養或在50ng/ml BMP4處理單層貼壁3天的PLC/PRF/5CD133+/-肝癌細胞干性相關基因表達情況；圖5B顯示Western Blot檢測顯示BMP4處理在⑶133+PLC/PRF/5細胞中呈時間依賴性上調CK8/18蛋白并下調CK19蛋白表達；圖5C顯示免疫細胞化學檢測CD133+PLC/PRF/5細胞中CK8/18和CK19在BMP4處理前后表達的變化。
[0060]圖6顯示BMP4處理對Huh7和MHCC-97L細胞CK8/18和CK19蛋白表達的影響；其中，圖6A顯示BMP4處理Huh7細胞0-6天后CK8/18和CK19蛋白的表達；圖6B顯示BMP4處理6天后MHCC-97L細胞CK8/18和CK19蛋白的表達。
[0061 ] 圖7顯示高濃度外源性BMP4處理抑制肝CSCs自我更新；圖7A和圖7B顯示將分選得到的⑶133+/-PLC/PRF/5細胞用BMP4預處理6天后，在24孔細胞培養板中進行軟瓊脂克隆形成實驗并計算克隆形成率(colony formation efficiency, CFE) (n=3);圖7C顯示將分選得到的CD133+PLC/PRF/5細胞用BMP4預處理6天后，種入超低黏附板中觀察腫瘤球形成情況，培養液 為無血清CDM。
[0062]圖8顯示BMP4抑制⑶133+肝癌CSCs在體內的成瘤能力，其中，圖8A和圖8B顯示，CD133+/-PLC/PRF/5 (PLC)和MHCC-97L (97L)細胞在裸鼠體內肝原位注射形成移植瘤的重量；圖8C顯示，PLC/PRF/5與MHCC-97L CD133+/-細胞與BMP4包被beads共同注射時的成瘤性。
[0063]圖9顯示⑶133+/-肝癌細胞與BMP4包被beads共同接種的成瘤性；其中，圖9A為PLC/PRF/5 (PLC)肝癌細胞；圖9B為MHCC-97L (97L)肝癌細胞。
[0064]圖10顯示BMP4提高了肝癌CSCs的化療藥物敏感性；其中，圖1OA和圖10B顯示，⑶133+/-PLC/PRF/5細胞經過BMP4預處理后，經MTT試驗檢測計算每種細胞對阿霉素(Doxorubicin)和長春新喊(Vincristine)的 IC50 值;圖 10C 顯不 BMP4 處理降低了 PLC/PRF/5細胞中ABCG2蛋白的表達；圖10D顯示BMP4處理降低了 MHCC-97L細胞中ABCG2蛋白的表達；圖10E顯示流式細胞術檢測分析BMP4處理前后MHCC-97L細胞中SP細胞比例。
[0065]圖11顯示BMP受體在肝癌細胞中的表達和激活；其中，圖1lA顯示PLC/PRF/5和 Huh7 細胞用 50ng/ml BMP4 處理 0_90min，Western Blot 結果顯示 BMPRIa、BMPRIb 和SMAD4在這些細胞中持續表達，并且SMADl出現BMP4濃度依賴性磷酸化激活；圖1lB顯示，Western Blot分析BMPRIa、BMPRIb在BMP4處理3天后的SMMC-7721細胞中的表達和激活情況；圖11(:顯示BMPRla在0)133+/0)133-肝癌細胞表達的 Western Blot檢測；圖1lD顯示，Western Blot分析SMAD4siRNA干擾片段在PLC/PRF/5細胞中的干擾效率；圖1lE顯示SMAD4干擾阻斷了 BMP4在PLC/PRF/5細胞中的促分化作用。
[0066]圖12顯示BMP受體在人原發性肝癌組織中的蛋白表達，免疫組化法檢測BMPRIa和BMPRIb蛋白在236例人原發性肝癌組織樣品中的表達。
【具體實施方式】
[0067]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次在眾多的生長因子中，意外地發現，外源性骨形成蛋白(BMPs)具有誘導肝癌干細胞分化的作用，具體地，外源性BMP4處理可使肝癌細胞系PLC/PRF/5和Huh7細胞中CD133蛋白表達下調，這種下調作用具有時間依賴性和濃度依賴性；BMP4能夠促進PLC/PRF/5、Huh7和MHCC-97L細胞系中CD133+肝癌干細胞分化，并且肝系上皮細胞特異性標志物的表達呈時間依賴性增多；抑制PLC/PRF/5細胞體外增殖，抑制其CD133+肝癌干細胞的自我更新以及在免疫缺陷小鼠體內的成瘤能力；BMP4通過下調ABCG2蛋白表達等途徑增強PLC/PRF/5和MHCC-97L CD133+腫瘤干細胞對化療藥物的敏感性；BMP4激活⑶133+腫瘤干細胞中的BMP經典信號通路，干擾經典通路關鍵分子SMAD4，使BMP4失去促⑶133蛋白表達下降作用。在此基礎上完成了本發明。
[0068]術語
[0069]BMP4
[0070]如本文所用，術語“BMP4”,“BMP4 蛋白，” “Bone morphogenetic protein 4” “骨形成蛋白4”或“成骨蛋白4”可以互換使用。BMP4是一種廣泛分布于哺乳動物細胞中的生長因子，屬于TGF-β家族。ΒΜΡ4可以是Genbank登錄號為ΝΡ_001193.2、ΝΡ_570911.2、或ΝΡ_570912.2所示的任一氨基酸序列；所述的ΒΜΡ4蛋白也可以是由Genbank數據庫中登錄號為ΝΜ_001202.3、ΝΜ_130850.2、或ΝΜ_130851.2所示的核苷酸序列編碼的。
[0071]該所述的ΒΜΡ4蛋白為ΒΜΡ4單體、或ΒΜΡ4同二聚體，或ΒΜΡ4異二聚體、或ΒΜΡ4的融合蛋白(保留ΒΜΡ4活性)，較佳地為ΒΜΡ4同二聚體。
[0072]該術語還包括ΒΜΡ4在藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。如本文所用，術語“藥學上可接受的鹽”指ΒΜΡ4與酸或堿所形成的適合用作藥物的鹽。藥學上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽。優選的鹽是ΒΜΡ4與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于:鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有機酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
[0073]制備方法
[0074]本領域的普通技術人員可以使用常規的方法，如生物合成或全化學合成法制備ΒΜΡ4。在一個優選例中，生物合成ΒΜΡ4的步驟如下:
[0075]I)提供編碼ΒΜΡ4的核酸序列；
[0076]2)將I)的核酸序列插入到合適的表達載體，獲得重組表達載體；
[0077]3)將2)的重組表達載體導入合適的宿主細胞；
[0078]4)在適合表達的條件下培養轉化宿主細胞；
[0079]5)收集上清液，并純化ΒΜΡ4。[0080]根據BMP4的核苷酸序列，本【技術領域】人員可方便地用各種已知方法制得所述的編碼核酸。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。作為本發明的一種實施方式，可通過分段合成核苷酸序列再進行重疊延伸PCR的方法來構建所述核酸序列。編碼BMP4的核苷酸序列可以與表達調控序列操作性相連。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調節或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0081]表達載體可采用市售的例如但不限于:pIRES、pDR，pUC18等可用于真核細胞系統表達的載體。本領域技術人員可以根據宿主細胞來選擇合適的表達載體。根據已知空載表達載體的酶切圖譜，本領域技術人員可按照常規方法通過限制性酶剪切與拼接，將BMP4的編碼序列插入合適的限制性位點，制得重組表達載體。
[0082]宿主細胞優選的是真核細胞，例如但不限于CHO，COS細胞，293細胞，RSF細胞等。作為優選方式，所述的細胞是CHO細胞，其可良好地表達BMP4蛋白。將所述編碼序列導入宿主細胞可采用本領域的多種已知技術，例如但不限于:磷酸鈣沉淀，原生質體融合，脂質體轉染，電穿孔，微注射，反轉錄法，噬菌體轉導法，堿金屬離子法。有關宿主細胞的培養和表達可參見Olander RM Dev Biol Stand 1996;86:338。可通過離心去除懸浮液中的細胞和殘渣，收集清液。可通過瓊脂糖凝膠電泳技術進行鑒定。
[0083]可將上述制備獲得的BMP4純化為基本均一的性質，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當所述蛋白為分泌表達時，可以采用商品化的超濾膜來分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產品，首先將表達上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進一步加以純化，或采用離子 交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質。Q-或SP-基團是較為理想的離子交換基團。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產物進一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達到基本均一。
[0084]可利用含有所述BMP4蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱進行蛋白純化。根據所使用的親和柱的特性，可利用常規的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結合在親和柱上的融合性多肽。可選擇地，所述蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個或多個多肽片段，作為蛋白標簽。任何合適的標簽都可以用于本發明。例如，所述的標簽可以是FLAG, HA, HAl，c-Myc，6_His或8_His等。這些標簽可用于對BMP4蛋白進行純化。
[0085]此外，BMP4蛋白還可以從例如Sigma公司等公司購得。
[0086]BMP4 的用途
[0087]本發明還提供了 BMP4用途，它被用于制備治療肝癌的藥物；用于制備促進肝癌干細胞的分化的組合物；用于制備抑制肝癌體外增殖和/或自我更新的組合物；)用于制備抑制肝癌的成瘤能力的組合物；用于制備提高肝癌細胞對抗腫瘤劑敏感性的組合物；用于制備降低肝癌細胞耐藥性的組合物。在另一優選例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳動物的BMP4蛋白、或其具有相同誘導肝癌干細胞分化功能的同源蛋白、突變蛋白或衍生蛋白。
[0088]藥物組合物和施用方法[0089]本發明提供了能誘導肝癌干細胞分化的藥物組合物，包括藥學上可接受的載體和有效量的作為活性成分的BMP4蛋白，且組合物為緩釋劑型。所述組合物包括緩釋顆粒以及吸附于緩釋顆粒的BMP4蛋白。所述的緩釋顆粒由生物可降解材料(如聚乳酸，聚丙烯酸)制成。所述的緩釋藥物組合物為注射劑。給藥方式為局部給藥或瘤內給藥。
[0090]所述的緩釋藥物組合物，還包括額外的抗腫瘤劑。所述的抗腫瘤劑包括化療藥、腫瘤抗體等。在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑包括(但并不限于):阿霉素、長春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU或其組合。
[0091]如本文所用，術語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。
[0092]“藥學上可以接受的載體”指的是:一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合于人或動物使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能和藥物中的活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低藥效。
[0093]藥學上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫? )、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調味劑、穩定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。
[0094]本發明化合物或藥物組合物的施用方式沒有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于):局部給藥，瘤旁，瘤內，腹膜內、或靜脈內等。
[0095]組合物中活性化合 物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內的某一部分中釋放。可采用的包埋組分的實例是聚合物質和蠟類物質。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
[0096]除了活性化合物外，液體劑型可包含本領域中常規采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質的混合物等。
[0097]除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑和香料。
[0098]除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質的混合物等。
[0099]一種優選的劑型是注射劑。用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0100]一種優選的劑型是緩釋劑型。用于本發明的緩釋劑沒有特別選擇，可以是本領域采用的各類緩釋劑或材料，尤其是生物可降解材料(如PLA等)。
[0101]藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物優選被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約I微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，BMP4還可與其他治療劑(如抗腫瘤劑)一起使用(包括之前、之中或之后使用)。
[0102]使用藥物組合物時，是將安全有效量的藥物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約I毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
[0103]藥盒及其應用
[0104]本發明提供一種藥盒，所述藥盒包括:(a)第一治療劑，所述第一治療劑是含BMP4作為活性的藥物制劑；(b)第二治療劑，所述第二治療劑是抗腫瘤劑，所述的抗腫瘤劑含有不同于BMP4的活性成分；和((3)使用說明書。
[0105]所述的含BMP4作為活性的藥物制劑為將BMP4在溶劑中溶解獲得，所述的溶劑包括水，醇類(甲醇和乙醇)，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有機溶劑。
[0106]所述的抗腫瘤劑優選為含有阿霉素和/或長春新堿的制劑，將阿霉素和/或長春新堿在溶劑中溶解獲得，所述的溶劑包括水，醇類(甲醇和乙醇)，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有機溶劑，優選乙酸乙酯和丙酮等中等極性溶劑。
[0107]所述的含有BMP4的制劑選自針劑、片劑、膠囊、或栓劑等，優選針劑。
[0108]所述的含有阿霉素和/或長春新堿的制劑選自針劑、片劑、膠囊、或栓劑等，優選針劑。
[0109]所述含有B MP4的制劑可以是含有BMP4的單元劑型，所述含有阿霉素和/或長春新堿的制劑可以是含有阿霉素和/或長春新堿的單元劑型。
[0110]如本文所用，術語“單元劑型”是指為了服用方便，將組合物制備成單次使用所需的劑型，包括但不限于各種液體劑、固體劑(如片劑)、膠囊劑、緩釋劑、靶向劑。
[0111]本發明提供的藥盒通過下述步驟制備得到:將含有BMP4的制劑和含有阿霉素和/或長春新堿的制劑，以及說明書一起放置，形成藥盒。
[0112]本發明提供的藥盒用于治療腫瘤，所述的腫瘤包括肝癌，肺癌，胃癌等；優選肝癌。
[0113]本發明的主要優點包括:
[0114](I)外源BMP4可使肝癌細胞系中CD133蛋白表達下調，這種下調作用具有時間依賴性和濃度依賴性；
[0115](2)BMP4促進肝癌干細胞分化，抑制PLC/PRF/5細胞體外增殖，抑制肝癌干細胞的自我更新；
[0116](3) BMP4抑制免疫缺陷小鼠體的成瘤能力；
[0117](4) BMP4通過下調ABCG2蛋白表達等途徑增強PLC/PRF/5和MHCC-97LCD133+腫瘤干細胞對化療藥物的敏感性；
[0118](5)BMP4激活⑶133+腫瘤干細胞中的BMP經典信號通路，干擾經典通路關鍵分子SMAD4，使BMP4失去促CD 133蛋白表達下降作用。
[0119]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0120]實驗材料
[0121]1.蛋白電泳及免疫印跡實驗材料
[0122]分子生物學級Tris base,丙烯酰胺及N, N-亞甲雙丙烯酰胺均購Sigma-Aldrich公司；細胞裂解用T-PER組織蛋白抽提試劑購自Pierce公司；蛋白酶抑制劑Cocktail購自Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Sigma-Aldrich公司。
[0123]5 X蛋白上樣緩沖液、20 X DTT還原劑和PageRuler?預染蛋白質分子量Marker購自Fermentas公司。脫脂奶粉購自Santa Cruz公司。
[0124]本研究所用抗體信息詳見表1 ;
[0125]化學發光顯色劑SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate 購自Pierce公司；X_光醫用膠片購自Kodak公司。
[0126]表1
【權利要求】
1.一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，其特征在于，所述用途為選自下組的一種或多種的用途: (a)用于制備治療肝癌的藥物； (b)用于制備促進肝癌干細胞的分化的組合物； (C)用于制備抑制肝癌體外增殖和/或自我更新的組合物； (d)用于制備抑制肝癌的成瘤能力的組合物； (e)用于制備提高肝癌細胞對抗腫瘤劑敏感性的組合物； (f)用于制備降低肝癌細胞耐藥性的組合物。
2.一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，其特征在于，所述的用途為選自下組的一種或多種用途: (a)用于制備治療癌癥的藥物； (b)用于制備促進癌癥干細胞的分化的組合物； (C)用于制備抑制癌癥的體外增殖和/或自我更新的組合物； (d)用于制備抑制癌癥的成瘤能力的組合物； (e)用于制備提高癌癥細胞對抗腫瘤劑的敏感性的組合物； (f)用于制備降低癌癥細胞的耐藥性的組合物。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的癌癥是實體瘤，或所述的癌癥細胞來源于實體瘤。
4.一種體外非治療性的誘導肝癌干細胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養肝癌干細胞，從而誘導肝癌干細胞的分化。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，還包括步驟:在步驟(I)之前、之中、或之后，在培養體系中添加額外的抗腫瘤劑。
6.一種提高腫瘤細胞對抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細胞的耐藥性的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養腫瘤細胞，從而提高腫瘤細胞對抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細胞的耐藥性。
7.一種緩釋藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括藥學上可接受的載體和作為活性成分的BMP4蛋白，且組合物為緩釋劑型。
8.如權利要求7所述的緩釋藥物組合物，其特征在于，所述的BMP4蛋白包括BMP4單體、或BMP4同二聚體，或BMP4異二聚體、或保留BMP4活性的BMP4融合蛋白。
9.如權利要求7所述的緩釋藥物組合物，其特征在于，還包括額外的抗腫瘤劑。
10.一種用于治療腫瘤的藥盒，其特征在于，所述藥盒包括: (a)第一治療劑，所述第一治療劑是含BMP4作為活性的藥物制劑； (b)第二治療劑，所述第二治療劑是抗腫瘤劑，所述的抗腫瘤劑含有不同于BMP4的活性成分；和 (c)使用說明書。
11.一種治療腫瘤或誘導腫瘤細胞分化的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對象施用BMP4蛋白或權利要求7所述的緩釋藥物組合物。
【文檔編號】A61P1/16GK103463619SQ201210189643
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月8日 優先權日:2012年6月8日
【發明者】李錦軍, 張立行 申請人:上海市腫瘤研究所