專利名稱：胞壁酰二肽-抗cd20免疫偶聯物制備方法及應用的制作方法
技術領域：
:本發明涉及ー種具有靶向結合抗原且具有通過刺激免疫活性細胞發揮抗腫瘤作用的胞壁酰ニ肽-抗CD20免疫偶聯物(MDP-Rituximab)，本發明公開了其制備方法，及其在淋巴瘤治療的作用。
背景技術：
:據世界衛生組織統計，淋巴瘤發病率毎年增長7.5%，是目前發病率增長最快的惡心腫瘤之一。我國淋巴瘤的發病率大約為2/10萬人ロ，毎年新發病例2.5萬人，死亡2萬人，兒童占全國人口的30%，因此，毎年大約有近萬新例新發患兒。其死亡率占兒童惡性腫瘤的首位。提高兒童淋巴瘤的診治水平是廣大血液工作者急需解決的問題。90%以上為B細胞淋巴瘤中均有⑶20表達，就目前國內外的治療狀況，兒童惡性淋巴瘤(NHL)的治療首選仍以聯合化療為主，其治療效果主要取決于治療反應。盡管兒童惡性淋巴瘤是可治愈性疾病，但是仍有大約50%以上的NHL患兒發生耐藥，導致治療無效或復發。因此，完全緩解后抗復發治療或停藥后清除耐藥腫瘤細胞是治療NHL急需解決的問題。采用單克隆抗體(MAb)的治療方法具有有效治療腫瘤的潛力，且已被用于某些腫瘤的治療。Maloney等首次將抗⑶20抗體(Rituximab,美羅華)單獨應用于I期臨床試驗治療復發或低度惡性的B細胞淋巴瘤，1997年美國食品藥物管理局(FDA)和1998年在歐洲批準美羅華用于⑶20陽性的復發性或難治性低度惡性或濾泡性B細胞NHL。(Maloney DG,Liies TM, Czerw inski DK, Waldichuk C, Rosenberg J, Grillo-Lopez A, Levy R.PhaseI clinical trial using escalating single-dose infusion of chimeric anti_CD20monoclonal antibody (IDEC-C2B8)in patients with recurrent B-cell lymphoma.Blood1994 ；1584 (8):2457-66.Marcus R,Hagenbeek A.The therapeutic use of Rituximab innon-HodgkinJ s lymphoma.Eur J Haematol Supp1.2007 ； (67):5-14)。B細胞NHL表達的膜抗原有⑶19、⑶20、⑶22、⑶33、⑶37、⑶52等，其中⑶20抗原的表達率達90%以上。⑶20是非糖基化的III型跨膜蛋白，分子量35KD具有高度的保守性，人與鼠的⑶20同源性可達73%，其功能類似于鈣離子通道，參與調解B淋巴細胞的生長與分化，是常用于診斷B細胞淋巴瘤的ー種指標。抗體導向治療具有高效、低毒和靶向性等特點，在惡性血液疾病的治療中越來越受到關注，Rituximab (美羅華)是第一個被FDA批準用于治療腫瘤的單克隆抗體，該抗體為人鼠嵌合型IgG抗體。能特異性識別表達⑶20的惡性B淋巴細胞和正常成熟B淋巴細胞，對其它正常細胞并無殺傷作用，因此由最早用于治療復發及難治性B細胞淋巴瘤，逐漸作為一線藥物用于治療分化差的淋巴瘤和淋巴細胞白血病。其主要通過誘導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)、誘導補體介導的溶細胞作用(CDC)、誘導細胞凋亡等機制發揮抗腫瘤作用，目前Rituximab已治療了 30多萬例病人,單藥治療總反應率約50%,聯合化療有效率高達80%以上。盡管Rituximab治療B細胞淋巴瘤有明顯的療效，但經過長期治療后發現，約半數以上病人產生耐藥，耐藥出現的原因除了腫瘤細胞自身產生耐藥性外，還可能存在腫瘤細胞周圍免疫環境改變等因素(Rezvani AR, Maloney DG.Rituximab resistance.Best Pract Res Clin Haematol.2011 ;24 (2):203-16.),其中可能涉及:(I)月中瘤本身細胞中⑶20抗原分子減少、集體的FcyRIII受體基因效應細胞的多態性(Cartron G，Dacheux L, balles G, Solal—Celigny P, Bardos P, Colombat P, ffatier H.Therapeuticactivity of numanized anti_CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgbFe receptor FcgammaRIIIa gene.Blood.2002 ;99 (3):754-8) ; (2) ADCC 作用的效應細胞耗竭:Rituximab通過其Fe段招募效應細胞集介導ADCC效應，其中主要起作用的是NK細胞，目前研究顯示Rituximab的ADCC作用主要限制因素是NK細胞的耗竭(Bhat R，Watzlし.beriai killing of tumor cells by human natural killer cells-ennancement bytherapeutic antibodies.PLoS One.2007 ；2 (3):e326) ； (3)有關補體調節蛋白異常；(4)抗細胞凋亡基因表達增強有關=Rituximab可與⑶20交叉偶聯促進caspases的激活而引起B細胞系死亡，但Bcl-2的過表達傾向于阻礙單抗導致的細胞死亡。雖然⑶20單抗在治療上還存在這些局限性，且單獨應用Rituximab治療腫瘤的抗體需要量極大，生產價格非常昂貴，半衰期較短決定需反復用藥，會増加了患者及其家庭痛苦，但它的高度特異性與低免疫源性決定了其在腫瘤生物靶向治療中的重要地位，并且隨著深入的臨床研究，結果表明其在自身免疫疾病的治療中也發揮著重要作用，因此，目前越來越多的學者致力于探索完善其效能的方法，目前傾向于通過蛋白重組構建結合型抗體(如抗⑶20 與抗 0)22 抗體的重組)(Gupta P, Goldenberg DM, Rossi EA, ChangCH.Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecmc, ant1-CD20and hexavalent, bispecific, anti_CD20/CD22 humanized antibodies correlatewith enhanced toxicity to B_ce丄丄 lymphomas and leukemias.Blood.2010 ;丄Ib(17):3258-67.)及通過將放免制劑與抗體偶聯而增強療效(如131I/90Y-Rituximab) (Illidge T，Morschnauser F.Radioimmunotherapy in follicular lympnoma.Best Pract Res ClinHaematol.2011 ；24 (2):279-93.)。
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抗腫瘤免疫主要以細胞免疫為主。由于腫瘤細胞缺乏特異性抗原或因特異性抗原的免疫源性差，因此腫瘤的非特異性免疫治療被廣泛地應用于臨床。同時，淋巴瘤患兒隨著化療時間的延長，機體的免疫功能進ー步損傷，難以識別或清除殘留的腫瘤細胞。因此對長期完全緩解的患兒提高機體的免疫功能是爭取治愈的關鍵。國內外已有大量研究 BRM 如卡介苗(BCG) (Ludwig AT, Moore JM, Luo Y, et al.Tumor necrosislactor-related apoptosis-1nduemg ligand:a novel mechanism for Baci丄IusCalmette-Guerin(BCG)-1nduced antitumor activity.Cancer Res,2004,64 (10):3386-3390.)、細胞因子、胸腺肽、轉移因子、寡脫氧核酸(Lee Kff, Jung J，Lce Y，etal.1mmunostimulatory oligodeoxynucleotide isolated from genome wide screeningof Mycobacterium bovis chromosomal DNA.Mol Immunol,2006,43(13):2107-2118)等可改善腫瘤患者機體的免疫狀態。Torisu等人對實體瘤患者采用BCG免疫治療，進行了長達18年的隨訪觀察，發現BCG能明顯提高晚期腫瘤患者的免疫功能和生存時間。瘤內注射治療黑色素瘤，可使50%的瘤體縮小，減少腫瘤轉移、延長緩解期，提高生存率。成人粒細胞性白血病經化療緩解后，加用BCG可維持療效，可延長生存期。膀胱內注射BCG可降低膀胱癌手術后復發率，延長生存期。1974年Ellouz等發現，結核桿菌細胞壁骨架中的N-こ酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(胞壁酰ニ肽，muramyl dipeptide, MDP)是小分子強效免疫佐劑的最小結構。研究結果表明，MDP及其類似物對免疫系統具有廣泛的生理功能，它能激活T細胞、B細胞和巨噬細胞，促進白細胞介素-1的產生，増加體液和細胞的免疫功能，是ー種強有力的免疫佐劑，對抗體、補體的生成和激活都有促進作用。同吋，它還具有抗細菌、真菌、抑制腫瘤等活性(Tanabe T, Chamaillard M, Ogura Y, Zhu L, QiuS, Masumoto J, Ghosh P, Moran A, Predergast MM, Tromp G, Williams CJ, Inohara N,Nunez G.Regulatory regions and critical residues of N0D2 involved in muramy丄dipeptide recognition.EMBO J 2004 ；23 (7):1587-97.)
發明內容
:基于以上研究狀況，如對腫瘤細胞的免疫治療如能像BCG預防結核菌感染一祥，使機體產生特異性的T細胞免疫應答，是免疫治療最可靠的方法。要實現此方法，本研究以疫苗接種所產生的特異性細胞免疫和單克隆抗體的免疫導向作用為理論依據，將BCG的有效成分MDP與抗淋巴瘤細胞的單克隆抗體Rituximab結合制備成MDP-Rituximab偶聯物，了解經BCG免疫后的免疫活性細胞，在MDP-Rituximab偶聯物的介導下的體內外的抗腫瘤效果。MDP-Rituximab偶聯物并不是通過Rituximab發揮ADCC或Q)C發揮抗腫瘤作用，而是該偶聯物保持了 MDP的免疫原性，能刺激機體產生特異性的T細胞免疫應答，借助Rituximab抗體與淋巴瘤細胞膜表面CD20分子結合的免疫導向作用，將MDP帶到殘留的淋巴瘤細胞周圍，通過MDP誘導的T細胞介導的免疫應答達到清除殘存腫瘤的最終目的，這樣該方法不僅克服了單用Rituximab藥物抗性，而且減少了抗體用量，預示其在惡性淋巴瘤中的應用前景。


圖1、化合物結構式及制備路線圖(nl = 3 ；n2 = 5 ；n3 = 3 ；n4 = 2)圖2、各組裸鼠腫瘤大體形態學變化圖3、各組裸鼠病理組織變化，1.肝臟(*400) ；2.脾臟(*200) ；3.腫瘤組織(*200) ；4.MDP-Rituximab組；5.LPS組腫瘤組織；(組織內可見散在核固縮、碎裂及溶解，胞衆內有空泡)；6.MDP-Rituximab+LPS組腫瘤組織(組織內可見大量核固縮、碎裂及溶解，胞漿內有空泡)
具體實施方式
:實施例1化合物I 5的制備化合物I的制備以含三個碳原子的連接臂為例。氬氣保護下，在IOml燒瓶中，加入Boc保護的連接臂 N-Boc-1，3-丙ニ胺鹽酸鹽(20mg，0. 12mmol, CAS 號:127346-48-9，Sigma-Aldrich 公司)，用3ml ニ甲基甲酰胺溶解，加入過量的三こ胺，然后加入N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酉旨(SPDP，74mg，0.24mmol, CAS 號:68181-17-9，Sigma-Aldrich 公司)，室溫攪拌反應lh，點板檢測反應結束，后經過硅膠柱(こ酸こ酯:石油醚=I: I)分離，真空蒸干，得產物化合物 I (19.8mg)。ES1-MS m/z 372.1 [M+H]+.
化合物2的制備
氬氣保護下，在10ml反應瓶中，加入化合物l(10mg，0.02mmol)加入1.5ml ニ氯甲烷，冰浴下攪拌lOmin，緩慢加入1.5ml三氟こ酸，冰浴條件下攪拌反應20min，點板檢測反應結束，減壓濃縮蒸干，并加入適量純甲醇，再次蒸干，得到化合物2(8.4mg)。ESI/MS m/z271.1[M+H] +化合物3的制備氬氣保護下，在IOml反應瓶中，加入胞壁酰ニ肽(MDP，5mg，0.0lmmol，CAS號:53678-77-6, Sigma-Aldrich 公司)、化合物 2 (3mg, CL Ollmmol),用 2ml ニ 甲基甲酸胺和四氫呋喃溶解，冰浴條件下加入1-輕基-7-偶氮苯并三氮唑(1.66mg,0.012mmol, CAS號:39968_33_7)及 N- (3_ _.甲基氣基丙基)_N’ 乙基-碳 二亞胺(2.34mg, 0.012mmoI，CAS號:25952-53-8)攪拌15min，恢復至室溫，繼續反應2 3h，點板檢測反應完全，經硅膠柱(ニ氯甲燒:甲醇=3: I)分離得化合物3,真空蒸干,得化合物3(7.5mg)。ES1-MS m/z746.4[M+H]+.
化合物4的制備IS氣保護下，在25ml反應瓶中，加入鼠抗人⑶20單克隆抗體(Rituximab, IOOmg,
0.0Olmmol，Roche/Genetech,美國)，用含有 EDTA(2mmol/l)的 PBS 液(0.lmol/L, PH =8)溶解調整濃度為8mg/ml，然后加入2-亞氨基四氫噻吩(2_IT，1.38mg，0.0lmmol，CAS號:78853-38-0, Sigma-Aldrich公司)，2-1T約對CD20抗體10倍過量，攪拌且室溫反應lh，經S^hacryl S-100丙烯葡聚糖凝膠柱分離純化(水:甲醇=1: 1)，得到化合物4(67.lmg) o ES1-MSm/z 144KD[M+H] +。采用 El Iman ’ s 試劑(IOmM DTNB，CAS 號:69-78-3，Sigma-Aldrich公司)，參照Sigma公司的相關操作說明，25 °C條件下，用Tris緩沖液稀釋半胱氨酸標準液配成梯度的稀釋液(5.0ml)，其濃度分別為:0.00mM、0.025mM、0.05mM、
0.lmM、0.15mM、0.2mM，于波長 412nm 處測定吸光度值(A)，分別為:0.152,0.172,0.186、
0.224,0.304,0.392,0.42,0.517，繪制半胱氨酸標準曲線。同樣條件下測定化合物4 (0.1g/ml)的吸光度為0.36，進而了解化合物4中巰基(-SH)數量，分析得化合物4中巰基數量為5。化合物5的制備氬氣條件下，在IOml反應瓶中，加入化合物4(67mg，0.0007mmol)，用2mlPBS (0.lmmol/L, PH = 8)溶液溶解，然后加入化合物3 (1.5mg，0.0021mmol)攪拌，4°C下反應18_24h,點板檢測反應完全,經Sephacryl S-100丙烯葡聚糖凝膠柱分離純化(水:甲醇=I: I)，得到化合物5 (57.lmg)。采用電噴霧電離質譜(ES1-MS)與紫外線吸光度分析MDP-Rituximab偶聯物的分子量及其分子比。根據MDP、Rituximab抗體分別在200nm、280nm有最大特征吸收，采用PBS稀釋成一定比例，分別測定兩者于200nm與280nm的吸收，繪制標準曲線，求出吸光系數e值。同時，將免疫偶聯物稀釋到一定濃度后檢測其吸收，根據光吸收加合性(Hamblett KJ, Senter PD, Chace DF, et al.Effects of loading onthe antItumor activity of a monoclonal antioody drug conjugate[J].Clm LancerRes, 2004，10:7063-7070 ;Dai Y, Liu XJ, Zhen YS.Anti tumor effect of the novelimmunoconjugate compose of pinyangmycin and ant1-type collagenase monoclonalantibody [J].Acta Pharm Sin (藥學學報)，2006,41:41-46),偶聯物在 200nm 及 280nm 的吸收度分別為「00991 A = p 280r + p 280p^tn)
LV八^1ム」A20O — c CD20(lmg/ml)しCD2〇t c MDP(lmg/ml)しMDP、丄ノ
「00 1 A = p 200C + p 200C("TT、
LV幾^o」 八280 — c.CD20(lmg/ml)しCD20丁 じ MDP(lmg/ml)しMDP、丄丄ノ將(II)式除以(I)式，即
權利要求
1.一種胞壁酰ニ肽(MDP)-抗CD20 (Rituximab)免疫偶聯物，其特征在于其為式I所示的化合物或其鹽，其中
2.按權利要求1所述的MDP-抗⑶20免疫偶聯物，其特征在于n3= 3，n4 = 2，叫=3。
3.一種藥物組合物，其中包含權利要求1或2所述的MDP-抗⑶20免疫偶聯物和可藥用的載體。
4.一種藥物制劑，其特征包含權利要求1或2所述的MDP-抗CD20免疫偶聯物和可藥用的載體。
5.按權利要求4所述的藥物制劑，其特征在于制劑形式為:片劑、膠囊劑、緩釋劑、注射齊U、液體制劑、顆粒劑、丸剤。
6.權利要求1或2中所述的MDP-抗CD20免疫偶聯物在制備治療惡性淋巴瘤中的應用。
7.權利要求1或2中所述的MDP-抗CD20免疫偶聯物在制備治療表達CD20的腫瘤藥物中得應用。
8.按權利要求7中所述的應用，其特征在于所述的腫瘤，具體為:白血病及乳腺癌、前列腺癌。
9.權利要求1或2中所述的MDP-抗CD20免疫偶聯物在制備治療由B淋巴細胞活化介導的自身免疫疾病藥物中得應用。
10.按權利要求9所述的應用，其特征在于自身免疫性疾病為:系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎或特發性血小板減少性紫癜。
11.一種制備權利要求1或2中MDP-抗⑶20免疫偶聯物的方法，其特征在于: 化合物I的制備 連接臂中碳原子可為I 6，本研究以三個碳原子的連接臂為例，氬氣保護下，在燒瓶中，加入Boc保護的連接臂N-Boc-1，3-丙ニ胺鹽酸鹽20mg，用3ml ニ甲基甲酰胺溶解，加入過量的三こ胺，然后加入N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酷，室溫攪拌反應lh，點板檢測反應結束，后經過硅膠柱分離，真空蒸干，得產物化合物I ; 化合物2的制備 IS氣保護下，在反應瓶中，加入化合物IIOmg,加入1.5ml ニ氯甲燒,冰浴下攪拌IOmin,緩慢加入1.5ml三氟こ酸，冰浴條件下攪拌反應20min，點板檢測反應結束，減壓濃縮蒸干，并加入適量純甲醇，再次蒸干，得到化合物2 ； 化合物3的制備 氬氣保護下，在IOml反應瓶中，加入胞壁酰ニ肽5mg、化合物23mg，用2ml ニ甲基甲酰胺和四氫呋喃溶解，冰浴條件下加入1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑1.66mg及N-(3- ニ甲基氨基丙基)-N’こ基-碳ニ亞胺2.34mg,攪拌15min，恢復至室溫，繼續反應2 3h，點板檢測反應完全，經硅膠柱，分離得化合物3，真空蒸干，得化合物3 ； 化合物4的制備 氬氣保護下，在反應瓶中，加入鼠抗人CD20單克隆抗體(Rituximab) lOOmg，用含有2mmol/LEDTA、PH為8、濃度為0.1moI/L的PBS溶液，溶解調整濃度為8mg/ml，然后加入2-亞氨基四氫噻吩1.38mg,攪拌且室溫反應Ih,經Sephacryl S-1OO丙烯葡聚糖凝膠柱分離純化，得到化合物4 ； MDP-抗CD20免疫偶聯物的制備 氬氣條件下，在反應瓶中，加入化合物467mg，用2ml濃度為0.1mmoI/L,PH = 8的PBS溶液溶解，然后加入化合物31.5mg攪拌，4°C下反應18-24h,點板檢測反應完全,經SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝膠柱分離純化，得到MDP-抗CD20免疫偶聯物。
12.一種抗CD20單克隆抗體衍生物，其特征在于為式II所示化合物，其中
13.一種胞壁酰ニ肽MDP的衍生物，其特征在于為式III所示化合物，Ii1為1、2、3、4、5或6，
14.一種如權利要求12中所述的ー種抗CD20單克隆抗體衍生物的制備方法，其特征在于:氬氣保護下，在反應瓶中，加入鼠抗人⑶20單克隆抗體(Rituximab) lOOmg，用含有2mmol/L EDTA, PH為8、濃度為0.lmol/L的PBS溶液，溶解調整濃度為8mg/ml，然后加入2-亞氨基四氫噻吩1.38mg,攪拌且室溫反應Ih,經Sephacryl S-100丙烯葡聚糖凝膠柱分離純化,得到抗CD20單克隆抗體衍生物。
15.一種如權利要求13中所述的ー種胞壁酰ニ肽MDP的衍生物的制備方法，其特征在于:連接臂中碳原子可為I 6，本研究以三個碳原子的連接臂為例，氬氣保護下，在燒瓶中，加入Boc保護的連接臂N-Boc-1，3-丙ニ胺鹽酸鹽20mg，用3ml ニ甲基甲酰胺溶解，加入過量的三こ胺，然后加入N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酷，室溫攪拌反應lh，點板檢測反應結束，后經過硅膠柱分離，真空蒸干，得產物化合物I ;氬氣保護下，在反應瓶中，加入化合物I IOmg,加入1.5ml ニ氯甲燒,冰浴下攪拌IOmin,緩慢加入1.5ml三氟こ酸，冰浴條件下攪拌反應20min，點板檢測反應結束，減壓濃縮蒸干，并加入適量純甲醇，再次蒸干，得到胞壁酰ニ肽MDP的衍生物。
全文摘要
本研究以疫苗接種所產生的特異性細胞免疫和單克隆抗體的免疫導向作用為理論依據，將卡介苗(BCG)的有效成分胞壁酰二肽(MDP)與抗淋巴瘤細胞膜抗原CD20的單克隆抗體Rituximab結合制備成胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶聯物，即MDP-Rituximab，了解經BCG免疫后的免疫活性細胞，在MDP-Rituximab的介導下的體內外抗腫瘤效果。該偶聯物保持了MDP的免疫原性，刺激機體產生特異性的T細胞免疫應答，借助Rituximab抗體與淋巴瘤細胞膜CD20分子結合的免疫導向作用，將MDP帶到殘留的淋巴瘤細胞周圍，通過MDP誘導T細胞介導的免疫應答達到清除殘存腫瘤的最終目的，這樣該方法不僅克服了單用Rituximab藥物抗性，而且減少了抗體用量，預示其在惡性淋巴瘤中的應用前景。
文檔編號A61P29/00GK103087196SQ201210227888
公開日2013年5月8日 申請日期2012年6月26日 優先權日2012年6月26日
發明者孫立榮, 王玲珍 申請人:孫立榮, 王玲珍