專利名稱：溫經(jīng)通絡(luò)方在制備防治奧沙利鉑致周圍神經(jīng)毒性副作用藥物中的應(yīng)用的制作方法
溫經(jīng)通絡(luò)方在制備防治奧沙利鉑致周圍神經(jīng)毒性副作用藥物中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于運(yùn)用傳統(tǒng)中藥經(jīng)方來治療和減輕西藥尤其是抗腫瘤化療藥物的毒副作用，具體為預(yù)防和減輕胃腸道腫瘤常用化療藥物奧沙利鉬神經(jīng)毒性。背景技術(shù)：
奧沙利鉬(oxaliplatin, 0ΧΑ)是第3代鉬類抗腫瘤藥物,繼順鉬、卡鉬之后，目前作為胃腸道腫瘤化療方案的基礎(chǔ)用藥之一。奧沙利鉬有著高效、低毒的特性，受到臨床醫(yī)生的青睞。但該藥有一定的副作用，主要靶器官在骨髓、外周神經(jīng)及胃腸道。其治療中所產(chǎn)生的外周感覺神經(jīng)毒(Chemotherapy-induced peripheral neuropathy, CIPN)較為明顯，可累及感覺神經(jīng)末梢，故限制了奧沙利鉬臨床療效的進(jìn)一步發(fā)揮。初始時(shí)主要表現(xiàn)為肢體感覺障礙持續(xù)不退，隨后可出現(xiàn)震蕩感受降低、本體感受遲鈍、精細(xì)分辨力減退、書寫及扣鈕扣等精細(xì)動(dòng)作有困難等表現(xiàn)。但其與急性神經(jīng)毒性不同，癥狀在冷刺激后不會(huì)加重。累積用藥劑量越多，感覺障礙持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，故嚴(yán)重的神經(jīng)毒性反應(yīng)常常使患者面臨減低化療藥物劑量甚至停藥的困境，同時(shí)對(duì)患者的心理、生理和生活質(zhì)量都可能產(chǎn)生損害。因此如何預(yù)防和減輕OXA的神經(jīng)毒性已引起廣泛關(guān)注。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過觀察CIPN大鼠疼痛行為學(xué)變化、脊髓背角與背根神經(jīng)節(jié)NR2B和pNF-H的表達(dá)，探討溫經(jīng)通絡(luò)方對(duì)奧沙利鉬致CIPN的防治作用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為采用溫經(jīng)通絡(luò)方來防治奧沙利鉬致周圍神經(jīng)毒性副作用，溫經(jīng)通絡(luò)方的原料藥組成按重量比為當(dāng)歸1200份、桂枝1000份、細(xì)辛500份、芍藥900份、地龍1500份、甘草600份。選用52只成年WISTAR雌性大鼠隨機(jī)分為五組，空白組、模型組、對(duì)照組、溫經(jīng)通絡(luò)方低劑量組和高劑量組。預(yù)防性給藥7天后，除空白組(n=8)第8天予以腹腔注射5%葡萄糖注射液5ml/kg外,其余4組(n=ll)按照4mg/kg予以腹腔注射奧沙利鉬,每周2次。同時(shí)空白組、模型組及對(duì)照組予0.9%NaCl溶液灌胃(lml/次)，每日I次；溫經(jīng)通絡(luò)方組予以溫經(jīng)通絡(luò)方高低劑量煎劑(5ml/kg)灌胃，每日I次；對(duì)照組腹腔注射給藥甲鈷胺104ug/kg，每周兩次；持續(xù)性給藥至d50。每3日稱體重，每日觀察大鼠給藥后反應(yīng)、飲食、大便；每周MWT測(cè)定，熱輻射儀對(duì)大鼠尾部熱痛覺潛伏期的測(cè)定。D50解剖每組大鼠，取脊髓、L5背根神經(jīng)節(jié)，用RT-PCR及Western-blot方法檢測(cè)不同濃度溫經(jīng)通絡(luò)方對(duì)L4-6脊髓NR2B蛋白表達(dá)情況的影響；用免疫組化方法觀察不同濃度溫經(jīng)通絡(luò)方對(duì)背根神經(jīng)節(jié)(DRG) NF-H蛋白表達(dá)情況的影響。
。圖2-1體重變化圖表。圖2-2大鼠機(jī)械性縮足閾值變化。圖2-3熱輻射甩尾反應(yīng)時(shí)間。圖2-4大鼠脊髓NR2B mRNA的相對(duì)表達(dá)量RQ。、
圖2-5大鼠DRG pNF-H的表達(dá)顯微照片(A、B、C、D，100X ) PNF-H的神經(jīng)元胞體染色(t )，神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維(一)。圖A :空白組；圖B :模型組；圖C :低劑量組；圖D :高劑量組。圖I NR2B/NR1-NMDA受體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)位點(diǎn)。
具體實(shí)施方式。
實(shí)施例I.實(shí)驗(yàn)材料
1.I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雌性WISTAR大鼠52只，體質(zhì)量(190± 10) g，清潔級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。以隨機(jī)數(shù)字法均分為空白組、模型組、對(duì)照組、溫經(jīng)通絡(luò)方低劑量組和高劑量組共5組，正常組8只，其余每組11只。動(dòng)物飼養(yǎng)于安靜、通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中，保持室溫20-25°C，相對(duì)濕度40%-60%，自由進(jìn)食和飲水。為保持動(dòng)物晝夜生物節(jié)律，實(shí)驗(yàn)室每日8 00至20 00開燈，20 00至次日8 00熄燈。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國際疼痛學(xué)會(huì)(IASP)關(guān)于應(yīng)用清醒動(dòng)物進(jìn)行疼痛實(shí)驗(yàn)研究綱要的要求實(shí)施和完成。I. 2實(shí)驗(yàn)藥物
溫經(jīng)通絡(luò)方(當(dāng)歸12g、桂枝10g、細(xì)辛5g、芍藥9g、地龍15g、甘草6g)成人處方生藥量為61g (生藥低劑量含量5. 59g/ml，高劑量22. 36g/ml),中藥均購自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥房，4°C保存?zhèn)溆茫粖W沙利鉬(艾恒)注射液，50mg,批號(hào)11032111，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；甲鈷胺(彌可保)注射液，500ug:lml，批號(hào)110470A，海南斯達(dá)制藥有限公司。1.3主要試劑及儀器
上下流引物RatNR2B-F、RatNR2B-R (購自上海英駿生物技術(shù)有限公司)；抗NMDAR2B(D15B3)Rabbit mAb 抗體(購自 Cell Signaling Technology 公司)；抗p-NF-H(RT97)Mouse IgG抗體(購自 Santa Cruz 公司);Von frey hairs疼痛觸覺測(cè)試套件(購自美國 Stoelting 公司)；Tail_Flick Analgesia Meter(購自 Harvard 公司，0MIC433,USA)。2.實(shí)驗(yàn)方法
2.I動(dòng)物分組及奧沙利鉬致CIPN模型建立
將52只健康雌性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后稱重，隨機(jī)分為空白組(n=8)、模型組(n=ll)、對(duì)照組(n=ll)、溫經(jīng)通絡(luò)方低劑量組(n=ll)、高劑量組(n=ll)。預(yù)防性給藥7天后，參照Yuki Mihara[[i]]等的造模方法，除空白組第8天予以腹腔注射5%葡萄糖注射液5ml/kg外，其余4組按照4mg/kg予以腹腔注射奧沙利鉬。將奧沙利鉬200mg溶于50ml的5%葡萄糖溶液中，終濃度為4g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。腹腔注射給藥奧沙利鉬4mg/kgd8/9/15/16/22/23/29/30 (根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的藥物劑量換算方法，20 mg/kg的大鼠應(yīng)用劑量近似于的120mg/m2的人體應(yīng)用劑量，與130mg/m2的奧沙利鉬臨床單藥推薦劑量接近；實(shí)驗(yàn)組腹腔注射奧沙利鉬30mg/kg，大于臨床單藥推薦劑量，近似180mg/m2的人體應(yīng)用劑量)。2. 2 給藥空白組、模型組及對(duì)照組予0.9%NaCl溶液灌胃(lml/次)，每日I次；溫經(jīng)通絡(luò)方組予以溫經(jīng)通絡(luò)方高低劑量煎劑(5ml/kg)灌胃，每日I次；對(duì)照組腹腔注射給藥甲鈷胺104ug/kg，每周兩次；持續(xù)性給藥至d50。大鼠每3日稱體重，每日觀察大鼠給藥后反應(yīng)、飲食、大便；每周MWT測(cè)定，熱輻射儀對(duì)大鼠尾部熱痛覺潛伏期的測(cè)定。2.3痛覺行為測(cè)試
機(jī)械性痛覺超敏參照Chaplan等的方法，以機(jī)械性縮足閾值(mechanicalwithdrawal threshold,MWT)來評(píng)估小鼠的機(jī)械性痛覺超敏。方法是用von Frey纖維細(xì)絲(折力梯度分別為I. O、I. 4,2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,10. 0,15. Og)以u(píng)p — down法推算縮足閾值將一有機(jī)玻璃箱(22X 12X22)cm。置于金屬篩網(wǎng)上，待大鼠在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)15 min后處于靜止時(shí)，用von Frey纖維細(xì)絲垂直刺激大鼠一側(cè)后肢足底中部,持續(xù)時(shí)間< 4S，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測(cè)定時(shí)首先從折力2. Og開始，當(dāng)該 力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)時(shí)，則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激；若出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，每個(gè)折力的von Frey纖維細(xì)絲均連續(xù)測(cè)定5次，每次刺激間隔30S，5次當(dāng)中有3次或3次以上的陽性反應(yīng)視為有機(jī)械痛敏，最大力度為15g，大于此值時(shí)記為15g。折合成(4.08、4. 17,4.31,
4.56,4. 74,4. 93,5. 07,5. 18)計(jì)算統(tǒng)計(jì)。福射熱測(cè)痛儀(tail-flickanalgesia meter, Harvard 公司，0MIC433, USA):由24V、250W聚光燈泡制成，光線經(jīng)外罩上的聚光漏斗集中照射于鼠尾，漏斗外口直徑為3mm，測(cè)痛時(shí)外口緊貼鼠尾，當(dāng)鼠尾產(chǎn)生突然抽搐時(shí)，即為甩尾反應(yīng)陽性，借助秒表記錄甩尾反應(yīng)潛伏時(shí)間(以下簡(jiǎn)稱痛閾)，秒表記錄最低限度為0.1 S。因各測(cè)痛部位之間痛閾無顯著差異(P>0. 05)，我們?nèi)∥布獠科鹗嫉?cm處測(cè)痛，反復(fù)測(cè)痛3次，取平均值。2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)
2.4. I脊根神經(jīng)節(jié)取材和切片制備
D50天后，各組老鼠各取5只，心臟灌注200ml 4°C無菌生理鹽水，然后用4%多聚甲醛IOOmL先快后慢灌注固定。取出L4-5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG,因?yàn)長(zhǎng)4-5DRG是支配后肢初級(jí)感覺傳入神經(jīng)元聚集地之一)并剝膜。L4-OTRG置于4%多聚甲醛中，4°C過夜后行脫水、浸蠟、包埋。DRG取橫切面，厚度4um，37°C過夜，第2天60°C烘烤Ih后，行免疫組織化學(xué)步驟。2. 4. 2 DRG pNF-Η的免疫組織化學(xué)
連續(xù)切片中每隔5張取I張，每個(gè)標(biāo)本取5張，嚴(yán)格按照試劑盒說明行非生物素二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)pNF-H，滴加適當(dāng)比例(I :100)稀釋的抗p-NF-H Mouse IgG抗體，4°C過夜。加入0. OIMKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。2. 4. 3 pNF-H受體表達(dá)觀察和分析
每只大鼠隨機(jī)取5張切片，用Olympus顯微系統(tǒng)觀察，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽性細(xì)胞，可間接反映細(xì)胞NR2B蛋白表達(dá)水平。2. 5 RT-PCR
D50天后，各組老鼠各取6只，行脫椎處死，解剖，取出腰段脊髓(L2-4)并剝除硬脊膜，分離后迅速移至-80°C冰箱保存。取100 mg組織樣本采用Trizol (Invitrogen US)法抽提RNA, I UgRNA用于cDNA第一鏈的合成，第一鏈合成用maxima First strand cDNAsynthesis 試劑盒(Fermentas, us)。按照 Maxima SYBR Green qPCR 試劑盒(FermentasUS)配制20ul反應(yīng)體系，PCR引物序列如下上流引物RatNR2B-F :TACGGGAGGGATAGGGC，下流引物 RatNR2B-R :GCGAGGGAGGAGAAATG。PCR 在 ABI 7500 PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序如下50 V預(yù)處理(2min)，95 V預(yù)變性(IOmin)，95 V變性(15s)和60°C退火(60s)共40循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果采用Λ Λ CT法進(jìn)行分析。2. 6 WESTERN BLOT 分析
取腰段脊髓(L2-4)并剝除硬脊膜，冷RIPA裂解液冰上研磨5分鐘，IOOOprm 4°C離心5分鐘，吸取上清液。測(cè)每組蛋白樣品濃度，加入上樣緩沖液，將蛋白濃度調(diào)整相等，100°C煮5分鐘，使蛋白完全變性。分別灌制分離膠和濃縮膠，根據(jù)待測(cè)蛋白分子量大小選擇分離膠的濃度。樣品在濃縮膠中用80V電壓，然后改用100V電壓在分離膠中分離，卸膠。PVDF膜在甲醇中浸泡15秒，在雙蒸水中浸泡2分鐘，并和濾紙一起在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5分鐘；膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡半小時(shí)后，按濾紙(兩層)一膠一PVDF膜一濾紙(兩層)的順序放入轉(zhuǎn)膜裝置，排除氣泡。100V轉(zhuǎn)膜，根據(jù)蛋白分子量調(diào)整轉(zhuǎn)膜時(shí)間，一般I. 5小時(shí)。將膜放入含1% BSA的TBST中室溫封閉2小時(shí)，用TBST洗去封閉液。一抗室溫孵育2小時(shí)，TBST洗3次，每次5分鐘。用和一抗對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育I小時(shí)，TBST洗3次，每次5分鐘。將膜置于暗示曝光顯影，對(duì)照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS16. O統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用One-Way ANOVA方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P〈0. 05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P〈0. 01表示具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3. I體重變化測(cè)定
空白組體重隨時(shí)間平穩(wěn)上升，開始造模D8后其余各組與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 01)，模型組與用藥組差別有顯著意義(P〈0. 05)，D35之后，溫經(jīng)通絡(luò)方組高低劑量組均體重上升，而模型組繼續(xù)下降，有顯著差別(P〈0. 01)。隨藥物濃度變化，各用藥組之間有差異(P〈0. 01)。見表2-1，圖2-1。表2-1大鼠體重變化表(g) ( X 土 s)
權(quán)利要求
1.溫經(jīng)通絡(luò)方在制備防治奧沙利鉬致周圍神經(jīng)毒性副作用藥物中的應(yīng)用，其特征為該組合物原料藥組成按重量比為當(dāng)歸1200份、桂枝1000份、細(xì)辛500份、芍藥900份、地龍 1500份、甘草600份。
全文摘要
奧沙利鉑是第3代鉑類抗腫瘤藥物，目前為胃腸道腫瘤化療方案的基礎(chǔ)用藥。奧沙利鉑有著高效、低毒的特性，受到臨床醫(yī)生青睞。但該藥有一定的副作用，其治療中所產(chǎn)生的外周感覺神經(jīng)毒較為明顯，可累及感覺神經(jīng)末梢，故限制了奧沙利鉑臨床療效的進(jìn)一步發(fā)揮。累積用藥劑量越多，感覺障礙持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，故嚴(yán)重的神經(jīng)毒性反應(yīng)常常使患者面臨減低化療藥物劑量甚至停藥的困境，同時(shí)對(duì)患者的心理、生理和生活質(zhì)量都可能產(chǎn)生損害。因此如何預(yù)防和減輕OXA的神經(jīng)毒性已引起廣泛關(guān)注。本發(fā)明將溫經(jīng)通絡(luò)方用于治療奧沙利鉑致周圍神經(jīng)毒性副作用，本發(fā)明溫經(jīng)通絡(luò)方的原料藥組成按重量比為當(dāng)歸1200份、桂枝1000份、細(xì)辛500份、芍藥900份、地龍1500份、甘草600份。
文檔編號(hào)A61K35/64GK102716206SQ20121022821
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月30日
發(fā)明者曹鵬, 王小寧, 胡瑩, 蔡雪婷, 霍介格 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院