專利名稱：姜黃素殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高分子前體藥物的合成領(lǐng)域，具體涉及一種姜黃素殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
姜黃素(Curcumin,Cur, I, 7-二(4-輕基-5-甲氧基苯基))-1,6-庚二烯-3,5- 二酮)，分子式為C21H2tlO6,分子量368. 37，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團(tuán)，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯和堿液中，不溶于水，微溶于苯和乙醚，在高溫或強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境中穩(wěn)定性較差，是一種光敏性很強(qiáng)的物質(zhì)，需避光保存，主要從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等植物的根或者莖中提取分離，在亞洲特別是印度和中國(guó)的藥用歷史悠久，并被作為一種天然的酚類食品添加劑。姜黃素具有多種藥理活性，這包括抗腫瘤、抗突變、抗增生、抗炎、 抗氧化、抗人類免疫缺陷病毒、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟和腎臟及抗纖維化等藥理作用，姜黃素另一個(gè)重要特點(diǎn)就是對(duì)嚙齒類動(dòng)物和人體的毒副作用很小，即使在很高的劑量下，也沒有出現(xiàn)任何明顯毒副作用。在抗腫瘤治療方面，姜黃素具有作用機(jī)制和化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、多靶點(diǎn)、多途徑、抗腫瘤譜廣、交叉發(fā)揮抗腫瘤作用、毒副作用輕等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于提高腫瘤患者的治療成功率及改善腫瘤患者的生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生命方面都有顯著療效。Sharma等用姜黃提取物治療標(biāo)準(zhǔn)化療方案耐藥的晚期結(jié)直腸癌患者四個(gè)月，發(fā)現(xiàn)口服姜黃提取物耐受性好且未發(fā)現(xiàn)劑量限制性毒性；Cheng等在姜黃素前瞻性I期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，口服液姜黃素達(dá)8000mg/d三個(gè)月仍對(duì)人體無毒性，其中2例新切除的輸尿管膀胱癌患者中的I例、7例口腔粘膜白斑病中的2例、6例胃腸化生中的I例、4例宮頸上皮癌中的I例和6例鮑溫氏病中的2例可觀察到組織學(xué)改善；Lal等用姜黃素(375m/d，每日3次，口服6 22月)治療8例眼窩特發(fā)性炎性假瘤患者，在5例完成療程患者中4例完全治愈。其作用機(jī)制包括抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制真核轉(zhuǎn)錄因子活化等幾個(gè)方面，Hartojo等發(fā)現(xiàn)姜黃素通過調(diào)控NF-k B (Nuc I ear f ac tor-kappa B)通路發(fā)揮其作用，單獨(dú)使用姜黃素能抑制NF-k B活性并誘導(dǎo)Flo-I和0E33食道腺癌細(xì)胞系的凋亡；Hilchie等發(fā)現(xiàn)姜黃素能誘導(dǎo)PC3前列腺癌細(xì)胞時(shí)間、劑量依賴性細(xì)胞凋亡，這種細(xì)胞毒性是由于細(xì)胞神經(jīng)酰胺的聚集和線粒體損傷引起由細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子和其他過氧化氫酶非依賴性進(jìn)程介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；另外臨床上姜黃素與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可以明顯減輕阿霉素引起的心臟和腎臟毒性作用。姜黃素所表現(xiàn)出來的生物化學(xué)特性使其成為有史以來最強(qiáng)大的候選化學(xué)預(yù)防劑和抗癌劑之一，美國(guó)國(guó)立癌癥研究院已將其列為第3代抗癌化學(xué)預(yù)防藥。姜黃素發(fā)現(xiàn)至今，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)超過上千篇，藥效活性非常明確，近年來更是免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是腫瘤治療領(lǐng)域(抗腫瘤、癌癥預(yù)防)的一個(gè)熱點(diǎn)化合物，但是為什么沒有能夠被開發(fā)成為臨床上一個(gè)有效新藥？深入研究發(fā)現(xiàn)這與其水溶性不好、胃腸道吸收差、生物利用度低及體內(nèi)代謝迅速等特點(diǎn)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)給患者每天口服500 8000 mg姜黃素，全身監(jiān)測(cè)不到姜黃素濃度，只有當(dāng)口服達(dá)10 12 g才能在少數(shù)患者體內(nèi)測(cè)到微量姜黃素；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)姜黃素口服絕大部分從糞便排出，僅有三分之一左右維持原型，而所吸收的大部分經(jīng)腸黏膜及肝臟時(shí)被轉(zhuǎn)化或代謝而清除，剩余部分又可能進(jìn)入腸肝循環(huán)而被進(jìn)一步代謝消除，因此姜黃素在胃腸道中代謝嚴(yán)重、首過效應(yīng)顯著，且存在腸肝循環(huán)，所以姜黃素在沒有達(dá)到病灶(如腫瘤組織)前，絕大部分已經(jīng)被代謝清除。如何改善姜黃素生物利用度，制備生物利用度高、用藥量低的高效、強(qiáng)效制劑已經(jīng)成為近年來廣大姜黃素研究者亟待解決的課題和熱點(diǎn)。為了提高姜黃素的生物利用度，各種各樣的方法已經(jīng)被采用。這包括結(jié)構(gòu)修飾的方法即以姜黃素為先導(dǎo)化合物、設(shè)計(jì)、合成和表征大量姜黃素結(jié)構(gòu)類似物和衍生物，以保留其藥物安全性、增加水溶性和抗腫瘤活性進(jìn)而解決其臨床應(yīng)用缺陷，以及載體輔助技術(shù)方法即采用脂質(zhì)體、納米粒、前體藥物等新型載體技術(shù)，使藥物到達(dá)病灶部位后再緩慢釋放出藥物分子發(fā)揮作用。通過結(jié)構(gòu)修飾，人們發(fā)現(xiàn)酚羥基的個(gè)數(shù)和化學(xué)環(huán)境對(duì)抗氧化活性有重要的影響、而酯化后的衍生物在抗菌/滅蟲和抗腫瘤方面活性有所提高、姜黃素還原產(chǎn)物在清除自由基方面有一定的優(yōu)勢(shì)、3 - 二酮上引入羥胺后抗結(jié)核桿菌活性提高、而亞甲基取代對(duì)抗癌生物活性產(chǎn)生很大影響，但是由于姜黃素本身結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可修飾改造基團(tuán)不多(其修飾主要包括對(duì)苯環(huán)的修飾、亞甲基的修飾、不飽和羰基的修飾三個(gè)方面)，迄今只有少數(shù)幾個(gè)類似物報(bào)道了體內(nèi)抑瘤活性，因此有必要在不破壞原藥抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上，利用 多學(xué)科交叉的優(yōu)勢(shì)如納米材料、化學(xué)工程等改造姜黃素，使得載體輔助技術(shù)和傳統(tǒng)中藥單體利用得到深度挖掘。載體輔助技術(shù)一般采用乳化技術(shù)、利用聚合物包覆藥物將其放在脂質(zhì)體、固體分散劑、納米粒子和微乳液(環(huán)糊精復(fù)合物、生物可降解微球及微乳等)中，形成藥物復(fù)合物或合成類似結(jié)構(gòu)衍生物；或利用溶劑揮發(fā)法以兩親性嵌段共聚物聚氧乙烯-聚EPSILON-己內(nèi)酯(PEO-PCL)為載體制成載藥膠團(tuán)可防止生理環(huán)境下藥物降解、持續(xù)緩釋藥物數(shù)天。以上方法盡管在溶解或口服吸收方面有一定改善，但仍有不足，這包括載藥量低(如微球、納米粒、固體分散體、脂質(zhì)體等需要大量載體輔料致使載藥量受限)、潛在毒性(如微乳制劑含有大量表面活性劑)、制備過程有可能引起姜黃素降解(如磷脂復(fù)合物需在一定溫度下藥物與磷脂進(jìn)行復(fù)合反應(yīng)并除掉溶劑)。因此如何選擇合適的藥物載體將姜黃素安全、高效、緩釋、靶向?qū)肽[瘤組織，由此研制高載藥量、少載體輔料、無毒及制備過程不影響藥物穩(wěn)定且簡(jiǎn)單易行的劑型是目前載體技術(shù)改造姜黃素研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)姜黃素水溶性低、體內(nèi)吸收少、生物利用度低的缺點(diǎn)及現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備方法及其應(yīng)用。姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備方法的步驟如下
(1)低分子量殼聚糖的合成
取市售分子量為450kDa的脫乙酰度為90%的殼聚糖60g，加入到2000mL重量百分比濃度為I. 2%的鹽酸水溶液中，55°C條件下攪拌2小時(shí)，然后加入殼聚糖酶4g，在55°C條件下行酶解反應(yīng)，用布氏漏斗過濾，80°C下攪拌半小時(shí)后，加入0. 5g活性炭，稀釋，過濾，用0. 45um的微孔濾膜處理濾液，噴霧干燥得到殼聚糖，測(cè)得殼聚糖的重均分子量為ISkDa ；
(2)殼聚糖-硬脂酸接枝物的合成
取0. 8g殼聚糖，加40mL蒸懼水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?. 65g,攪拌溶解，將0. Ig的硬脂酸溶于20 mL乙醇溶液中，將上述兩種溶液混合，在400rpm磁力攪拌條件下，80°C恒溫反應(yīng)4小時(shí)，之后維持常溫，繼續(xù)攪拌8小時(shí)至反應(yīng)液澄清，將終反應(yīng)液置透析袋，蒸餾水透析72小時(shí)，透析液冷凍干燥，得殼寡糖硬脂酸接枝物；采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖-硬脂酸接枝物的氨基取代度，取I 8mg的殼寡糖分別溶于2mL蒸餾水，加入4% (w/w)的碳酸氫鈉2mL和0. 1% (w/w)的三硝基苯磺酸2ml，37°C放置2小時(shí),加人2mol/L鹽酸2mL,搖勻，344nm測(cè)定吸光度，制備殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；取殼寡糖-硬脂酸接枝物，按上述方法操作，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸接枝物氨基取代度；(3)姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備
稱取氨基取代度為5 6%的殼寡糖硬脂酸接枝物20mg溶于IOmL純水，以0. IN HCl調(diào)節(jié)pH至5. 0，然后將溶液在常溫超聲30次，隨后加入以DMSO溶解的2mg/mL姜黃素lmL，再在4°C振蕩過夜，將上清液反復(fù)透析24小時(shí)后離心lOmin，收集上清，得到姜黃素殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束。(4)姜黃素殼聚糖-硬脂酸接枝物膠束應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為克服姜黃素水溶性低、體內(nèi)吸收少、生物利用度低的缺點(diǎn)，提供一種包裹于殼寡糖硬脂酸接枝物的姜黃素納米膠束，CSO-SA/curcumin納米膠束在水溶液中可以自組裝形成納米膠束，該膠束的平均粒徑為114. Ixm, Zeta電位18. 5mV。體內(nèi)外試驗(yàn)顯示CSO-SA/curcumin具有較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)化能力，可以增強(qiáng)姜黃素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積聚，對(duì)MCF-7、MCF-7/Adr和大腸癌原代細(xì)胞具有較強(qiáng)殺傷作用；體內(nèi)給藥可以選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而對(duì)小鼠無明顯的毒性作用。


圖I是實(shí)施例3制備的CSO-SA/curcumin膠束的粒徑(A), CSO-SA/curcumin膠束的透射電鏡照片(B);
圖2是姜黃素原藥與膠束的顏色(A)，CSO-SA/curcumin膠束釋放曲線(B)；
圖3是實(shí)施例3制備的CSO-SA/curcumin對(duì)MCF-7 (A)、MCF-7/Adr (B)、細(xì)胞大腸癌原代細(xì)胞(C)及空載體(D)的毒性作用；
圖4是實(shí)施例3制備的CSO-SA/curcumin體內(nèi)抗腫瘤活性(A)、瘤鼠體重變化(B)及姜黃素瘤內(nèi)分布(C)。
具體實(shí)施例方式姜黃素殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束的制備方法的步驟如下
(1)低分子量殼聚糖的合成
取市售分子量為450kDa的脫乙酰度為90%的殼聚糖60g，加入到2000mL重量百分比濃度為I. 2%的鹽酸水溶液中，55°C條件下攪拌2小時(shí)，然后加入殼聚糖酶4g，在55°C條件下行酶解反應(yīng)，用布氏漏斗過濾，80°C下攪拌半小時(shí)后，加入0.5 g活性炭，稀釋，過濾，用0. 45um的微孔濾膜處理濾液，噴霧干燥得到殼聚糖，測(cè)得殼聚糖的重均分子量為ISkDa ；
(2)殼聚糖-硬脂酸接枝物的合成
取0. 8g殼聚糖，加40mL蒸懼水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?. 65g,攪拌溶解,將0. Ig的硬脂酸溶于20mL乙醇溶液中，將上述兩種溶液混合，在400rpm磁力攪拌條件下，、80°C恒溫反應(yīng)4小時(shí)，之后維持常溫，繼續(xù)攪拌8小時(shí)至反應(yīng)液澄清，將終反應(yīng)液置透析袋，蒸餾水透析72小時(shí)，透析液冷凍干燥，得殼寡糖-硬脂酸接枝物；采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖-硬脂酸接枝物的氨基取代度，取I 8mg的殼寡糖分別溶于2mL蒸餾水，加入4% (w/w)的碳酸氫鈉2mL和0. 1% (w/w)的三硝基苯磺酸2mL, 37°C放置2hr,加人2mol/L鹽酸2mL,搖勻，344nm測(cè)定吸光度，制備殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；取殼寡糖-硬脂酸接枝物，按上述方法操作，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸接枝物氨基取代度；
(3)姜黃素-殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束的制備
稱取氨基取代度為5 6%的殼寡糖-硬脂酸接枝物20mg溶于IOmL純水，以0. IN HCl調(diào)節(jié)pH至5. 0，然后將溶液在常溫超聲30次，隨后加入以DMSO溶解的2mg/mL姜黃素1ml，再在4°C振蕩過夜，將上清液反復(fù)透析24小時(shí)后離心lOmin，收集上清，得到姜黃素-殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束。(4)姜黃素殼聚糖-硬脂酸接枝物膠束應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
本發(fā)明通過實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I
(1)低分子量殼聚糖(CSO)的合成
取市售分子量為450kDa的脫乙酰度為90%的殼聚糖60g，加入到2000mL重量百分比濃度為I. 2%的鹽酸水溶液中，55°C條件下攪拌2小時(shí)，然后加入殼聚糖酶4g，在55°C條件下行酶解反應(yīng)，用布氏漏斗過濾，80°C下攪拌半小時(shí)后，加入0.5g活性炭，稀釋，過濾，用0. 45um的微孔濾膜處理濾液，噴霧干燥得到殼聚糖，測(cè)得殼聚糖的重均分子量為ISkDa ；
(2)殼聚糖-硬脂酸接枝物(CSO-SA)的合成
取0. 8g殼聚糖，加40mL蒸懼水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?. 65g,攪拌溶解,將0. Ig的硬脂酸溶于20mL乙醇溶液中，將上述兩種溶液混合，在400rpm磁力攪拌條件下，80°C恒溫反應(yīng)4小時(shí)，之后維持常溫，繼續(xù)攪拌8小時(shí)至反應(yīng)液澄清，將終反應(yīng)液置透析袋，蒸餾水透析72小時(shí)，透析液冷凍干燥，得殼寡糖硬脂酸接枝物；采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖-硬脂酸接枝物的氨基取代度，取Img的殼寡糖分別溶于2mL蒸餾水，加入4%(w/w)的碳酸氫鈉2mL和重量百分比濃度為0. 1%的三硝基苯磺酸2mL，37°C放置2小時(shí)，加入2mol/L鹽酸2mL，搖勻，344nm測(cè)定吸光度，制備殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；取殼寡糖-硬脂酸接枝物，按上述方法操作，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸接枝物氨基取代度；
(3)姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束(CSO-SA/curcumin)的制備
稱取氨基取代度為5%的殼寡糖-硬脂酸接枝物20mg溶于IOmL純水，以0. IN HCl調(diào)節(jié)pH至5. 0，然后將溶液在常溫超聲30次，隨后加入以DMSO溶解的2mg/mL姜黃素lmL，再在4°C振蕩過夜，將上清液反復(fù)透析24小時(shí)后離心lOmin，收集上清，得到姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束。實(shí)施例2
(I)低分子量殼聚糖的合成
取市售分子量為450kDa的脫乙酰度為90%的殼聚糖60g，加入到2000mL重量百分比濃度為I. 2%的鹽酸水溶液中，55°C條件下攪拌2小時(shí)，然后加入殼聚糖酶4g，在55°C條件下行酶解反應(yīng)，用布氏漏斗過濾，80°C下攪拌半小時(shí)后，加入0. 5g活性炭，稀釋，過濾，用0. 45um的微孔濾膜處理濾液，噴霧干燥得到殼聚糖，測(cè)得殼聚糖的重均分子量為ISkDa ；(2)殼聚糖-硬脂酸接枝物的合成
取0. 8g殼聚糖，加40mL蒸懼水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?. 65g,攪拌溶解,將0. Ig的硬脂酸溶于20 mL乙醇溶液中，將上述兩種溶液混合，在400rpm磁力攪拌條件下，80°C恒溫反應(yīng)4小時(shí)，之后維持常溫，繼續(xù)攪拌8小時(shí)至反應(yīng)液澄清，將終反應(yīng)液置透析袋，蒸餾水透析72小時(shí)，透析液冷凍干燥，得殼寡糖-硬脂酸接枝物；采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖-硬脂酸接枝物的氨基取代度，取8mg的殼寡糖分別溶于2mL蒸餾水，加A 4% (w/w)的碳酸氫鈉2mL和0. 1% (w/w)的三硝基苯磺酸2mL，37°C放置2小時(shí)，加人2mol/L鹽酸2mL,搖勻，344nm測(cè)定吸光度，制備殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；取殼寡糖-硬脂酸接枝物，按上述方法操作，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸接枝物氨基取代度；
(3)姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備
稱取氨基取代度為6 %的殼寡糖-硬脂酸接枝物20mg溶于IOmL純水，以0. IN HCl調(diào)節(jié)pH至5. 0，然后將溶液在常溫超聲30次，隨后加入以DMSO溶解的2mg/mL姜黃素lmL， 再在4°C振蕩過夜，將上清液反復(fù)透析24小時(shí)后離心lOmin，收集上清，得到姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束。實(shí)施例3
(1)低分子量殼聚糖的合成
取市售分子量為450kDa的脫乙酰度為90%的殼聚糖60g，加入到2000mL重量百分比濃度為I. 2%的鹽酸水溶液中，55°C條件下攪拌2小時(shí)，然后加入殼聚糖酶4g，在55°C條件下行酶解反應(yīng)，以凝膠滲透色譜法控制殼聚糖的降解程度，以布氏漏斗過濾后，80°C下攪拌半小時(shí)，加入0. 5g的活性炭，將反應(yīng)稀釋后過濾，用0. 45 y m的微孔濾膜處理濾液，噴霧干燥得到殼聚糖，測(cè)得殼聚糖的重均分子量為ISkDa ；
(2)殼聚糖-硬脂酸接枝物的合成
取0. 8g CSO,加40ml蒸餾水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?. 65g,攪拌溶解，將0. Ig的硬脂酸溶于20 mL乙醇溶液中，將上述兩種溶液混合，在400rpm磁力攪拌條件下，80°C恒溫反應(yīng)4小時(shí)，之后維持常溫，繼續(xù)攪拌8小時(shí)至反應(yīng)液澄清，將終反應(yīng)液置透析袋，蒸餾水透析72小時(shí)，透析液冷凍干燥，得殼寡糖-硬脂酸接枝物；采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖-硬脂酸接枝物的氨基取代度，取I 8mg的殼寡糖分別溶于2mL蒸餾水，加入4%(w/w)碳酸氫鈉2mL和0. 1%三硝基苯磺酸2mL，37°C放置2小時(shí)，加人2mol/L鹽酸2mL，搖勻，344nm測(cè)定吸光度，制備殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；取殼寡糖-硬脂酸接枝物，按上述方法操作，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸接枝物氨基取代度為5 6% ；
(3)姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備
稱取氨基取代度為5 6%的殼寡糖硬脂酸接枝物20mg溶于IOmL純水，以0. IN HCl調(diào)節(jié)pH至5. O，然后將溶液在常溫超聲30次，隨后加入以DMSO溶解的2mg/mL姜黃素lmL，當(dāng)立即出現(xiàn)輕微的渾濁時(shí)表示殼聚糖-硬脂酸接枝物與姜黃素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，再在4°C振蕩過夜，將上清液反復(fù)透析24小時(shí)(透析袋分子量7 KDa)后離心lOmin，得到姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束。(4)姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束理化特征CSO-SA/curcumin的粒徑其分布特征測(cè)定采用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量法(ZETASIZER 3000, Malvern, UK);同時(shí)ZETASIZER 3000測(cè)定膠束(電位；透射電鏡測(cè)定膠束的外觀及形狀(JEOL JEM-1230, Japan)，其樣本以醋酸鈾溶液(1%，w/v)負(fù)染，并置于覆有火棉膠膜電鏡銅網(wǎng)上觀察；熒光分光光度計(jì)(F-2500，Hitachi Co. , Japan)測(cè)定包封率(EE)，其操作如下即將膠束以DMSO稀釋10倍，在熒光分光光度計(jì)下按照激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)射波長(zhǎng)566nm，電壓700V檢測(cè)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，包封率計(jì)算公式EE%=(包入膠束的姜黃素量/加入的總量)X 100%。粒度分析表明，所得納米膠束以平均粒徑114. 7nm為有效直徑且呈正態(tài)分布(圖
1)，Zeta電位18. 5 ±0. 4mV。透射電鏡下觀察該納米膠束具有規(guī)整的球形外觀，在溶液中分散良好。測(cè)量結(jié)果姜黃素包封率為29. 9 ±2.9%。(5)姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的體外釋放
CSO-SA/curcumin的體外釋放采用透析法測(cè)定，即將ImL終濃度為50 y g/ml的CSO-SA/curcumin加入到透析袋內(nèi)(MWC0 7.0 kDa)，將透析袋內(nèi)置于10 ml PBS (pH 6.0) 并間隔一定時(shí)間換液，收集不同時(shí)間點(diǎn)的PBS溶液，以分光光度法測(cè)定姜黃素釋放量。測(cè)量結(jié)果表明在48小時(shí)內(nèi)，超過40%的姜黃素是從CSO-SA/curcumin膠束中釋放(圖2)。釋放曲線顯示，藥物能較平緩釋放。(6)細(xì)胞毒性試驗(yàn)
以MTS法測(cè)定，即大腸癌原代細(xì)胞、MCF-7、10^-7/^(11'胞分別按照每孔2\104 5\104密度接種，培養(yǎng)48小時(shí)后加入MTS測(cè)定。測(cè)量結(jié)果表明CS0-SA/CurCumin膠束能有效的對(duì)腫瘤細(xì)胞起到抑制作用，在同等的姜黃素濃度下，比游離藥物藥效提高4 6倍(圖3)。而空載體對(duì)細(xì)胞的毒性影響較小。(7) CSO-SA/curcumin 體內(nèi)抗腫瘤活性
試驗(yàn)對(duì)象為5周齡的雌性裸鼠，將大腸癌細(xì)胞皮下接種于其腹側(cè)，當(dāng)腫瘤平均直徑達(dá)到 7 9mm 時(shí)，，將裸鼠分成 3 組單用 PBS、空載體、CSO-SA/curcumin (2mg Curcumin/kg/d);每組一天一次連續(xù)2周按照上述方法干預(yù)，以數(shù)顯卡尺測(cè)量腫瘤大小，腫瘤體積計(jì)算公式V= a2 Xb/2，，在治療結(jié)束后，摘除移植瘤用于腫瘤組織的藥物生物分布分析。測(cè)量結(jié)果表明CS0-SA/CurCumin膠束治療組移植瘤較對(duì)照組明顯縮小(圖4)，熒光共聚焦顯微鏡顯示腫瘤組織內(nèi)有較強(qiáng)的綠色熒光姜黃素分布。
權(quán)利要求
1.一種姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備方法，其特征在于它的步驟如下 (1)低分子量殼聚糖的合成 取市售分子量為450kDa的脫乙 酰度為90%的殼聚糖60g，加入到2000mL重量百分比濃度為I. 2%的鹽酸水溶液中，55°C條件下攪拌2小時(shí)，然后加入殼聚糖酶4g，在55°C條件下行酶解反應(yīng)，用布氏漏斗過濾，80°C下攪拌半小時(shí)后，加入0. 5g活性炭，稀釋，過濾，用0.45um的微孔濾膜處理濾液，噴霧干燥得到殼聚糖，測(cè)得殼聚糖的重均分子量為ISkDa ； (2)殼聚糖硬脂酸接枝物的合成 取0. 8g殼聚糖，加40mL蒸懼水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?. 65g,攪拌溶解,將0.Ig的硬脂酸溶于20 mL乙醇溶液中，將上述兩種溶液混合，在400rpm磁力攪拌條件下，80°C恒溫反應(yīng)4小時(shí)，之后維持常溫，繼續(xù)攪拌8小時(shí)至反應(yīng)液澄清，將終反應(yīng)液置透析袋，蒸餾水透析72小時(shí)，透析液冷凍干燥，得殼寡糖-硬脂酸接枝物；采用三硝基苯磺酸法測(cè)定殼寡糖-硬脂酸接枝物的氨基取代度，取I 8mg的殼寡糖分別溶于2mL蒸餾水，加入重量百分比濃度為4%的碳酸氫鈉2ml和重量百分比濃度為0. 1%的三硝基苯磺酸2ml，37°C放置2小時(shí)，加人2mol/L鹽酸2ml，搖勻，344nm測(cè)定吸光度，制備殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；取殼寡糖-硬脂酸接枝物，按上述方法操作，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖-硬脂酸接枝物氨基取代度； (3)姜黃素殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束的制備 稱取氨基取代度為5 6%的殼寡糖硬脂酸接枝物20mg溶于IOmL純水，以0. IN HCl調(diào)節(jié)pH至5. 0，然后將溶液在常溫超聲30次，隨后加入以DMSO溶解的2mg/mL姜黃素lmL，再在4° C振蕩過夜，將上清液反復(fù)透析24小時(shí)后離心lOmin，收集上清，得到姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述方法制備的姜黃素殼聚糖-硬脂酸接枝物膠束的應(yīng)用，其特征在于姜黃素殼聚糖-硬脂酸接枝物膠束應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種姜黃素殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備方法及其應(yīng)用。它以姜黃素為原料藥，采用殼寡糖、硬脂酸形成的接枝物作為藥物載體，制備過程包括兩個(gè)部分，第一，以碳二亞胺為交聯(lián)劑，殼寡糖和硬脂酸共價(jià)結(jié)合形成殼寡糖-硬脂酸接枝物(CSO-SA)載體；第二，CSO-SA載體溶液中加入一定量的姜黃素DMSO溶液，經(jīng)絡(luò)合反應(yīng)形成CSO-SA/curcumin載藥納米膠束。本發(fā)明制備的膠束的平均粒徑為114.7nm，Zeta電位18.5mV。體內(nèi)外試驗(yàn)顯示CSO-SA/curcumin具有較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)化能力，可以增強(qiáng)姜黃素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積聚，對(duì)MCF-7、MCF-7/Adr和大腸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)殺傷作用；體內(nèi)給藥可以選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而對(duì)小鼠無明顯的毒性作用。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102743336SQ20121022933
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者吳先國(guó), 王科, 胡富強(qiáng), 黃建 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)