本發明具體涉及新材料技術領域，具體涉及一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長效抗菌涂層的制備方法。

背景技術：

醫用生物材料的應用越來越廣泛，在提高醫療水平的同時，我們也不得不面對其帶來的一系列問題，其中最迫切需要解決的就是生物材料感染的問題。可以將生物材料感染的過程簡單描述為：微生物在生物材料表面吸附，隨后定植形成菌落，繼而形成致密的生物膜，釋放浮游菌體和毒素，最終導致感染的發生。自然界超過95%的細菌均能通過以上方式形成生物膜。在美國每年有超過十萬人是死于生物材料相關的感染。因此在不破壞其性能的條件下，通過對生物醫療裝置表面進行修飾，從而達到抗細菌粘附和生物膜形成已經迫在眉睫。可以將目前生物醫療裝置表面修飾分為抗細菌粘附型和殺菌型。殺菌型雖然可以有效的殺死細菌，但也面臨著殘留細菌“尸體”可能會引發再次感染，故研發一種既可以有效殺菌也可以及時釋放細菌“尸體”的表面修飾方法十分重要。

層層自組裝技術具有簡單、易于操作的特點，并且使膜層具有其組分的復合功能，有望得到兼具殺菌和及時釋放死細菌的性能。

技術實現要素：

為了解決現有技術的缺陷及不足。本發明提供了一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長效抗菌涂層的制備方法。

本發明采用的技術解決方案是：一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長效抗菌涂層的制備方法，包括以下步驟：

（1）基材的表面預處理：將洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中，浸泡，獲得表面胺基化的基材；

（2）制備殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液；

（3）采用聚丙烯酸（PAA）和CHI-Ag⁺溶液，通過層層自組裝的涂層方法制備得到多層膜結構；

（4）將制備得到的多層膜加熱0.5-2h,熱還原銀離子形成納米銀；

（5）在涂層表面均勻的涂抹上一層1-5mg/ml殼聚糖溶液，至此完成整個殼聚糖包覆的多層膜涂層的制備。

所述的基材為玻璃、石英、硅片、不銹鋼、聚酯膜、硅膠中的一種。

所述的步驟（2）中殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液制備方法如下：配制硝酸銀溶解的殼聚糖溶液中磁力攪拌調節pH值，即得殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液。

所述的步驟（3）中層層自組裝的涂層方法如下：將表面胺基化的基材放入0.5-5mg/ml的聚丙烯酸 水溶液中浸泡6-8分鐘，然后用相同pH值的洗液清洗2-3分鐘，用氮氣吹干，放入含有0.05-2.0mg/mL硝酸銀的1-5mg/ml 的殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液中浸泡6-8min，用相同pH值的洗液清洗2-3分鐘，氮氣吹干，至此完成一個雙層膜的制備，重復以上操作，直到完成整個多層膜涂層的制備。

所述的步驟（4）中熱還原的納米銀粒徑為5-50nm。

所述的步驟（1）中洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中浸泡0.5-12小時。

所述的步驟（4）中多層膜加熱還原溫度為120-150℃。

本發明的有益效果是：本發明提供了一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長效抗菌涂層的制備方法，本發明涂層制備簡單、易行，可采用浸涂、噴涂等可工業實現的方式，適用范圍廣，涂層具有高效和長效的抗菌性能，能夠對具有復雜體型結構的生物醫用裝置進行涂層修飾；涂層可改善醫用裝置表面的生物相容性，具有降低細胞毒性；涂層材料化學結構穩定，耐疲勞、剪切，能適應人體的內環境；涂層能夠實現廣譜的多功能抗菌的能力。

具體實施方式

為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。

基材表面預處理：

將各基材（玻璃、石英、硅片、不銹鋼、聚酯膜、硅膠等）經刀片或玻璃刀裁剪成1×2 cm²大小，然后依次用前經乙醇和超純水分別超聲2-3min清洗，N₂吹干。清洗過的基材將洗凈的基材置于將洗凈的基材置于1-5mg/ml的PEI水溶液中，浸泡1-12h，獲得表面胺基化的基材。下列實施例中所用的基材均為通過上述表面與處理過后的基材。

實施例1：

配制0.5mg/mL的PAA溶液，測定pH值為4.35。取50ml超純水于50ml離心管中，調節pH為4.38，標為洗液1。

配制0.1mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的1 mg/ml的CHI中磁力攪拌，測定pH為3.97。取50ml超純水于50ml離心管中調節pH值為4.04，標為洗液2。

將經過預處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干,至此完成一個雙層的制備，制備10個雙層的多層膜涂層。

將制備得到的涂層在120℃下加熱0.5h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 1ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

靜態接觸角研究發現涂膜后親水性顯著增加，和單純的基材相比，由67.25±1.43°減到2±0.22°，透射電鏡下觀察膜層中納米銀的分布，發現納米銀均勻分布在4.0nm、9.8nm、15.6nm、23.1nm和23.6nm左右。通過抑菌環實驗發現抑菌環分別為4.3mm、7.0mm、15.9mm、17.1mm和16.6mm，其抗菌效果明顯增加。測定對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞的細胞毒性較低，細胞存活率達到73%以上。

實施例 2：

配制1mg/mL的dopa溶液，測定pH值為4.36。取50ml超純水于50ml離心管中，調節pH為4.34，標為洗液1。

配制0.5mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的2 mg/ml的CHI中磁力攪拌，測定pH為4.0。取50ml超純水于50ml離心管中調節pH值為4.20，標為洗液2。

將經過預處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個雙層的制備。分別制備3、6、9、12、15雙層。

將制備得到的涂層在130℃下加熱1h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 2ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

利用抑菌環實驗評價涂層的抗菌性能，結果測得五種涂層對金黃色葡萄球菌的抑菌環分別為3.3mm、9.8mm、19.9mm、20.6mm和23.4mm，并均能在15min內殺滅99.99%的濃度為10⁶CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。五種涂層對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞毒性較低，細胞存活率超過79%，具有良好的生物相容性。

實施例 3：

配制2mg/mL的dopa溶液，測定pH值為3.96。取50ml超純水于50ml離心管中，調節pH為4.0，標為洗液1。

配制1mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的2.5mg/ml的CHI中磁力攪拌，測定pH為4.96。取50ml超純水于50ml離心管中調節pH值為4.93，標為洗液2。

將經過預處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個雙層的制備。分別制備3、6、9、12雙層。

將制備得到的涂層在140℃下加熱1h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 3ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

測得四種涂層對大腸桿菌的抑菌環分別為7.9mm、13.2mm、19.7mm和31.4mm，均能在10min內殺滅99.99%的濃度為10⁸ CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。通過細菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。四種涂層對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的78%，因此具有良好的細胞相容性。

實施例 4：

配配制3mg/mL的dopa溶液，測定pH值為3.87。取50ml超純水于50ml離心管中，調節pH為3.92，標為洗液1。

配制2mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的3 mg/ml的CHI中磁力攪拌，測定pH為4.09。取50ml超純水于50ml離心管中調節pH值為4.12，標為洗液2。

將經過預處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個雙層的制備。分別制備6、9、12、15雙層。

將制備得到的涂層在140℃下加熱1.5h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 3.5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

利用透射電鏡觀察涂層中納米銀的分布，結果顯示納米銀分布較為均勻，分別分布在17.8nm、25.6nm、31.9nm、和45.7nm左右。測得四種涂層對大腸桿菌的抑菌環分別為18.7mm、29.5mm、40.6mm和45.2mm，均能在10min內殺滅99.99%的濃度為10⁶CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。通過細菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。四種涂層對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的83%，因此具有較好的細胞相容性。

實施例5

配制4mg/mL的dopa溶液，測定pH值為5.01。取50ml超純水于50ml離心管中，調節pH為5.12，標為洗液1。

配制2mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的3 mg/ml的PEI中磁力攪拌，測定pH為4.01。取50ml超純水于50ml離心管中調節pH值為4.21，標為洗液2。

將經過預處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個雙層的制備。分別制備6、9、12雙層。

將制備得到的涂層在150℃下加熱1.5h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 3.5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

利用透射電鏡觀察涂層中納米銀的分布，結果顯示納米銀分布較為均勻，分別分布在13.4nm、20.6nm和30.5nm左右。測得三種涂層對大腸桿菌的抑菌環分別為14.7mm、29.3mm和35.7mm，均能在10min內殺滅99.9%的濃度為10⁷ CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。通過細菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。三種涂層對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的89%，因此具有較好的細胞相容性。

實施例6

配制5mg/mL的dopa溶液，測定pH值為4.45。取50ml超純水于50ml離心管中，調節pH為4.64，標為洗液1。

配制3mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的4mg/ml的CHI中磁力攪拌，測定pH為5.27。取50ml超純水于50ml離心管中調節pH值為5.18，標為洗液2。

將經過預處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個雙層的制備。分別制備6、9、12雙層。

將制備得到的涂層在150℃下加熱2h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

靜態接觸角研究發現涂膜后親水性顯著增加，和單純的基材相比，由78.35±1.83°減到2±1.62°。利用透射電鏡觀察涂層中納米銀的分布，結果顯示納米銀分布較為均勻，分別分布在12.1nm、18.7nm和26.4nm左右。測得三種涂層對大腸桿菌的抑菌環分別為19.8mm、28.7mm和39.4mm，均能在10min內殺滅99.99%的濃度為10⁷ CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。三種涂層對成纖維細胞和人晶狀體上皮細胞毒性較低，細胞活性超過TCPS的95%，因此具有較好的細胞相容性。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發明思路下的技術方案均屬于本發明的保護范圍。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發明思路下的技術方案均屬于本發明的保護范圍。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。