專利名稱：包含cFms胞外片段的融合蛋白質及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥工程技術，尤其涉及一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質及其制備方法和應用。
背景技術：
白細胞介素-34(IL_34)和巨噬細胞刺激因子(M-CSF)屬于細胞生長因子。雖然在DNA序列上沒有相似性，它們卻共用受體cFms。雖然彼此間有許多生物學功能相似，但與受體結合后所利用的細胞內信號傳遞通路不完全相同，并且彼此在組織中表達也有差異。白細胞介素-34和巨噬細胞刺激因子參與單核細胞/巨噬細胞系細胞的生存、增殖、分化和激活。在免疫反應和炎癥中，白細胞介素-34和巨噬細胞刺激因子與其受體(cFms)結合激活單核細胞/巨噬細胞，促進細胞毒性功能，細胞吞噬功能，化學趨向性和細胞因子的產生，調節樹突狀細胞的功能。IL-34/M-CSF/cFms也在骨骼代謝方面發揮重要作用。IL-34/M-CSF與核因子kappa-B受體配體活化子(RANKL) —道參與人破骨細胞前體的增殖、分化和融合，并參與后期骨質的吸收。致炎因子白細胞介素-1 (IL-1)和腫瘤壞死因子a (TNFa)能刺激人成纖維細胞、軟骨細胞、類風濕性關節炎(RA)關節滑膜血管內皮細胞生成IL-34和M-CSF。在自身免疫性疾病患者的血漿和關節滑膜液中，IL-34和M-CSF水平明顯增高。M-CSF敲除的小鼠(Csflop/op)不能誘發關節炎。在小鼠關節炎模型，應用抗M-CSF抗體或M-CSF抑制劑能減少小鼠關節中巨噬細胞數目及降低IL-1和TNFa水平，抑制破骨細胞形成和激活，減輕骨骼和軟骨的破壞，減弱疾病活動性，降低疾病的整體臨床評分。

在骨巨細胞瘤，IL-34表達水平增高，參與RANKL誘導的破骨細胞溶骨作用。給小鼠腹腔內注射外源性IL-34，增加單核細胞/巨噬細胞系分化和增殖，并且誘導破骨細胞分化和骨質吸收，引起骨質疏松。用基因工程方法在M-CSF缺失小鼠(Csflop/op)體內表達IL-34，可以恢復動物由于M-CSF缺失所致的骨質、破骨細胞、組織巨噬細胞、生育等方面缺陷。在RA病人，TNF a促使成纖維樣滑膜細胞產生IL-34，參與破骨細胞的形成和激活。除了在自身免疫性炎性疾病中扮演重要角色外，IL-34/M-CSF也在腫瘤生長、發育和轉移中起重要作用。M-CSF水平與許多惡性腫瘤的預后相關。在許多惡性腫瘤，血中M-CSF水平增高，腫瘤的預后則差。在腫瘤異種移植模型動物上，抑制cFms則能抑制腫瘤轉移導致的溶骨性骨質破壞。用細胞毒性療法(如化學療法)治療乳腺癌時，乳腺上皮細胞增加分泌IL-34和M-CSF，通過與受體cFms結合，促進巨噬細胞浸潤。在小鼠乳癌模型，聯合細胞毒性療法和cFms受體阻段劑或酪氨酸激酶抑制劑，減少腫瘤相關巨噬細胞(TAM)數量，延長動物的生存率，減慢原發腫瘤的發展和降低肺臟轉移。在原發癌組織中，腫瘤相關巨噬細胞數量減少可增加細胞毒性T細胞的數量。而細胞毒性T細胞能增強癌細胞對化療的敏感性，加強癌癥治療效果。cFms受體含有554個氨基酸，分為三個主要區域(參見圖1) :5個IgG樣胞外結構域(分別記作Dl、D2、D3、D4、D5)、一個跨膜區域和一個絡氨酸激酶的胞內結構域(UniProtKB/Swiss-Prot entry P07333)。在5個IgG樣胞外結構域中，結構域D2和結構域D3與IL-34/M-CSF的結合和功能是必需的，結構域Dl與IL-34和M-CSF的穩定結合是必要的。在一定程度上，結構域D4和結構域D5能提高IL-34與cFms的結合及隨后引起的細胞內信號傳遞。

發明內容
本發明的目的，就是為了提供一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，由cFms受體的細胞外片段與人免疫球蛋白Fe通過一連接肽相連構成,命名為cFmsE⑶-Fe ;所述cFms受體的細胞外片段由5個IgG樣胞外結構域中的至少兩個構成,5個IgG樣胞外結構域分別記作Dl、D2、D3、D4和D5 ;所述免疫球蛋白Fe來自于IgGl，其編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述連接肽的編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質,其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-001，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 19所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 26所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-002，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 20所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 27所示。

上述一種包含cFm s胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQID NO. 14所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-003，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 28所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-004，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 22所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 29所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-005，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 23所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 30所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D2-D3-D4-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 17所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-006，其編碼核苷酸序列如SEQID NO. 24所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 31所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質,其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D3-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-007，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 25所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 32所示。上述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的制備方法，包括以下步驟a)合成cFms受體的細胞外片段及連接肽核酸片段；b)將人IgG Fe片段的編碼基因克隆到pSec(Invitrogen)質粒中，構成質粒pSec—Fc ；

c)將步驟a)獲得的cFms受體的細胞外片段及連接肽核酸片段克隆到步驟b)獲得的質粒pSec-Fc中，構建pSec_cFmsEQ)-Fc質粒；d)將步驟c)獲得的質粒pSec-cFmsE⑶-Fe轉化到宿主細胞中，得到融合蛋白質；所述cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3或D2-D3-D4或D3-D4或D3-D4-D5或D1-D2-D3-D4 或 D2-D3-D4-D5 或 D1-D3-D5 ；所述宿主細胞選自293細胞、CHO-Kl細胞、CHO-S細胞、DG44細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞、PerC6細胞、Sf9細胞、Sf21細胞或酵母細胞。上述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的應用，是用于制備抑制炎癥性疾病的藥物、抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥物或抑制腫瘤生長和轉移的藥物。所述的抑制炎癥性疾病的藥物是用于治療自身免疫性疾病，炎性疾病，移植物抗宿主病，系統性紅斑狼瘡，哮喘和牛皮癬，炎性腸道疾病(Inflammatory Bowel Diseases)多發性硬化癥和動脈粥樣硬化癥的藥物。所述的抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥物是用于治療類風濕性關節炎、關節炎、腫瘤轉移引起的骨組織吸收過多所致的骨質疏松癥的藥物。所述的抑制腫瘤生長和轉移的藥物是用于治療乳腺癌、肺癌、結直腸癌、前列腺癌或子宮卵巢癌的藥物。所述的藥物的組合劑型是注射劑、冷凍干燥劑或噴霧劑。本發明是依據IL-34/M-CSF與其受體的結合位點在真核細胞中表達的一種融合蛋白質；該融合蛋白質主要包含兩個區域，第一個區域是cFms的細胞外區域，能與IL-34/M-CSF結合，第二個區域是IgG的Fe片段，該片段功能一是增加該融合蛋白質與IL-34/M-CSF的結合能力，二是增加融合蛋白質的血液半衰期，從而減少臨床用藥次數。進一步，在該融合蛋白質中插入了一個連接肽，其目的是在增加該融合蛋白各功能區域的相對獨立性，同時也增加了該融合蛋白質各功能區的結構穩定。本發明描述了cFmsECD-Fc 融合蛋白質 YY-001 至 YY-007 與 IL-34/M-CSF的離體結合實驗。本實驗中，融合蛋白YY-001與IL-34/M-CSF的結合最好，分別為O. 101-0. 149/0. 099-0. 169nM。本發明描述了cFmsECD-Fc 融合蛋白質 YY-001、YY-003、YY_004 和 YY-005 對 IL-34和M-CSF刺激人全血中性粒細胞趨化因子MCP-1釋放的抑制。其中，融合蛋白ΥΥ-001的抑制效應分別達 96% (P < O. 05)和 92% (P < O. 05)。本發明描述了 cFmsECD-Fc融合蛋白質YY-001在離體對IL-34和M-CSF協同RANKL刺激破骨細胞形成的抑制作用。本發明提供的融合蛋白質，具有結合IL-34和結合M-CSF，阻斷IL-34/M-CSF配體跟共用受體cFms的結合的作用。該融合蛋白適合治療異常情況下由IL-34/M-CSF所引起的疾病。對自身免疫性疾病、炎癥性疾病、骨質疏松癥和腫瘤具有潛在的治療前景。應用含有本發明融合蛋白質的藥物組合能減少或抑制破骨細胞的形成，從而用于骨質疏松癥的治療。應用含有本發明融合蛋白質的藥物組合能降低和抑制促炎性因子的釋放，減輕炎癥引起的組織功能破壞，緩解臨床癥狀，用于治療自身免疫性疾病，炎癥性疾病，如RA，移植物抗宿主病，系統性紅斑狼瘡，哮喘和牛皮癬，炎性腸道疾病(Inflammatory BowelDiseases)多發性硬化癥和動脈粥樣硬化癥等由IL_34/M_CSF異常引起的疾病。應用含有本發明融合蛋白質的藥物組合還能抑制腫瘤生長、轉移。


圖1顯示了 cFms分子的三個主要區域含有五個免疫球蛋白樣的胞外結構區域，一個跨膜結構區域和一個胞內酪氨酸激酶結構域。圖2顯示了融合蛋白YY-001至YY-007的構建模擬圖，Dl至D5表示免疫球蛋白樣區域，人免疫球蛋白Fe區域表示為Fe，在免疫球蛋白樣區域和Fe之間有一連接肽。圖3 顯不了 YY-001 至 YY-007 的蛋白質印跡(Western Blot)。圖4顯示了 YY-001至YY-007分別與IL-34的親和力。圖5顯示了 YY-001至YY-007分別與M-CSF的親合力。圖6、圖7顯示了 Y Y-001與IL-34和M-CSF的親合力。圖8 顯示了 YY-001、YY-003、YY-004 和 ΥΥ-005 對 IL-34 和 M-CSF 刺激人全血單核細胞趨化因子(MCP-1)釋放水平的影響。圖9、圖10小結ΥΥ-001對IL-34和M-CSF刺激人全血單核細胞趨化因子(MCP-1)釋放水平的影響(培養20小時)。圖11顯示了 ΥΥ-001對破骨細胞形成的抑制作用。
具體實施例方式實施例1表達質粒的構建cFms細胞外區域的編碼序列是依據GenBank(BC04752L I)用基因合成法得到。Fe片段(684bp)是以淋巴結cDNA(BD)為模版，以引物1、引物2PCR擴增所得弓丨物1:5，-ctatctcacacatcgacaattcgaagacaaaactcacacatgcccac_3，弓L 2 :5， _aagggaatctagagcggccgctcatttacccggagacagggag_3，YY-001由cFms細胞外區域的第1、第2和第3免疫球蛋白樣區(D1、D2、D3)(配合參見圖2)與人免疫球蛋白Fe融合而成。在胞外結構域D3和Fe之間，加有一連接肽。所獲得的YY-001的DNA序列如SEQ ID NO. 19所示。其中，Dl至D3的PCR片段(831bp)是以引物3、引物4PCR擴增所得引物3:5’ -ccgctcgagatcccagtgatagagcccagt-3!引物 4 :5，-gcataccggttaccacccggaagaacatgga-3!YY-002由cFms細胞外區域的第2、第3和第4免疫球蛋白樣區(D2、D3、D4)(配合參見圖2)與人免疫球蛋白Fe融合而成。所獲得的YY-002的DNA序列如SEQ ID NO. 20所示。其中，D2至D4的PCR片段(921bp)是以引物5和引物6PCR擴增所得引物5:5’ -ccgctcgagtatgtcaaagaccctgcccg-3!引物6:5’ -gcataccggtgacgcttacctctgggg-3!YY-003由cFms細胞外區域第3和第4免疫球蛋白樣區(D3、D4)(配合參見圖2)與人免疫球蛋白Fe融合而成。其中，D3和D4的PCR片段(615bp)是以合成基因為模版，以引物7和引物6PCR擴增所得。所獲得的YY-004的DNA序列如SEQ ID NO. 21所示。引物7 :5，-ccgctcgagcccccagccttgacact-3，YY-004由cFms細胞外區域第3、第4和第5免疫球蛋白樣區(D3、D4、D5)(配合參見圖2)與人免疫球蛋白Fe融合而成。其中，D3至D5的PCR片段(915bp)是以引物7和引物8PCR擴增所得。所獲得的YY-004的DNA序列如SEQ ID NO. 22所示。引物 8 :5，-ttaaccggtgtgggctcctgcagagat-3'YY-005由cFms細胞外區域的第1、第2、第3和第4免疫球蛋白樣區(D1、D2、D3、D4)(配合參見圖2)與人免疫球蛋白Fe融合而成。所獲得的YY-005的DNA序列如SEQ IDNO. 23所示。其中，Dl至D4的PCR片段(1161bp)是以引物3和引物6PCR擴增所得YY-006由cFms細胞外區域的第2、第3、第4和第5免疫球蛋白樣區(D2、D3、D4、D5)(配合參見圖2)與人免疫球蛋白Fe融合而成。所獲得的YY-006的DNA序列如SEQ IDNO. 24所示。其中，D2至D 5的PCR片段(1221bp)是以合成基因為摸版，以引物5和引物8PCR擴增所得。YY-007由cFms細胞外區域的第1、第3和第5免疫球蛋白樣區(DU D3、D5)(配合參見圖2)與人免疫球蛋白Fe融合而成。其中，D1、D3和D5的PCR片段(849bp)是以合成基因為摸版，先用引物3和引物9PCR擴增得Dl片段；用引物10和引物IlPCR擴增得到D3片段；用引物12和引物8PCR擴增得到D5片段。然后，將Dl、D3和D5三個片段通過連接PCR連在一起。最后，用引物3和引物8將連接后的片段放大，與Fe片段融合而成。所獲得的YY-007的DNA序列如SEQ ID NO. 25所示。引物9:5’ -ccagtgtcaaggcagggtctttgacatagagg-3'引物 10 :5，-agaccctgccttgacactggtgcctgcagag-3'引物 11 :5，-ttacctctggctctaccacccggaagaacatg-3'引物I2 :5，-gggtggtagagccagaggtaagcgtcatatgg-3/通過PCR擴增的片段，先用限制性內切酶XolI和AgeI (Invitrogen公司)切割，純化，插入到改造后的pSecDNA載體,得到表達質粒pSec-cFmsEMD-Fc。對每個表達質粒的編碼序列進行了核苷酸序列分析，確認所有表達質粒的序列是正確的。實施例2宿主細胞的轉染和融合蛋白質的生產本發明中的多個融合蛋白質是在CH0-KUCH0-S和DG44細胞中表達并分泌到培養液中，用葡萄球菌A蛋白親和沉析法純化所得。瞬時表達本發明中YY-001至YY-007融合蛋白，重組質粒用DNA純化試劑盒(Qiagen公司)提純后，用脂質體2000 (Invitrogen公司)轉染到CH0-K1 (ATCC#CCL61)細胞。在無血清培養液OPT1-MII中培養3天后收集上清液。純化后的融合蛋白，經ELISA測定濃度后，用SDS-PAGE和免疫印跡分析得到驗證。穩定表達本發明中YY-001至YY-007的融合蛋白，用電穿孔法將純化后的質粒轉染到CHO-S細胞或DG44細胞(Invitrogen公司)。48小時后，添加Zeocin或MTX(Invitrogen公司)到培養液中。四周后，用有限密度稀釋法進行克隆培養。第八周，用ELISA法測定各克隆細胞株蛋白表達量，挑選高產克隆細胞株進行放大培養。穩定轉染的CHO-S或DG44細胞能持久表達大量的融合蛋白，純化后的融合蛋白用于下面所述的實驗驗證。實施例3融合蛋白與IL-34和M-CSF體外結合實驗本發明應用高靈敏度和高特異性的IL-34和M-CSF檢測試劑盒(R&D Systems公司)來測定各融合蛋白與IL-34和M-CSF的親和力。將不同濃度(O到IOOnM)的融合蛋白(YY-001 至 YY-007)跟 250pM 人 IL-34 或跟 50pM 人 M-CSF (R&D Systems 公司)在室溫下孵育過夜，然后用IL-34或M-CSF檢測試劑盒檢測沒有被融合蛋白結合的游離的IL-34和游離的M-CSF。實驗結果用軟件程序Prism5 (GraphPad公司)非線性擬合后得到的親和力如表I所示。表I
權利要求
1.一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質,其特征在于由cFms受體的細胞外片段與人免疫球蛋白Fe通過一連接肽相連構成，命名為cFmsE⑶-Fe ;所述cFms受體的細胞外片段由5個IgG樣胞外結構域中的至少兩個構成，5個IgG樣胞外結構域分別記作D1、D2、D3、D4和D5;所述免疫球蛋白Fe來自于IgGl，其編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述連接肽的編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-001，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
3.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-002，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 27所示。
4.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-003，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 28所示。
5.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-004，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 29所示。
6.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-005，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 23所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 30所示。
7.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D2-D3-D4-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 17所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-006，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 31所示。
8.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D3-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-007，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 25所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 32所示。
9.根據權利要求1至8中任意一項所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a)合成cFms受體的細胞外片段及連接肽核酸片段； b)將人IgGFe片段的編碼基因克隆到pSec (Invitrogen)質粒中，構成質粒pSec_Fc ； c)將步驟a)獲得的cFms受體的細胞外片段及連接肽核酸片段克隆到步驟b)獲得的質粒 pSec-Fc 中，構建 pSec_cFmsEQ)-Fc 質粒； d)將步驟c)獲得的質粒pSec-cFmsECD-Fc轉化到宿主細胞中，得到融合蛋白質； 所述cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3或D2-D3-D4或D3-D4或D3-D4-D5或D1-D2-D3-D4 或 D2-D3-D4-D5 或 D1-D3-D5 ； 所述宿主細胞選自293細胞、CHO-Kl細胞、CHO-S細胞、DG44細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞、PerC6細胞、Sf9細胞、Sf21細胞或酵母細胞。
10.根據權利要求1至8中任意一項所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的應用，其特征在于用于制備抑制炎癥性疾病的藥物、抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥物或抑制腫瘤生長和轉移的藥物。
11.根據權利要求10所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的應用，其特征在于所述的抑制炎癥性疾病的藥物是用于治療自身免疫性疾病，炎性疾病，移植物抗宿主病，系統性紅斑狼瘡，哮喘和牛皮癖，炎性腸道疾病(Inflammatory Bowel Diseases),多發性硬化癥和動脈粥樣硬化癥的藥物。
12.根據權利要求10所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的應用，其特征在于所述的抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥物是用于治療類風濕性關節炎、關節炎、腫瘤轉移引起的骨組織吸收過多所致的骨質疏松癥的藥物。
13.根據權利要求10所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的應用，其特征在于所述的抑制腫瘤生長和轉移的藥物是用于治療乳腺癌、肺癌、結直腸癌、前列腺癌或子宮卵巢癌的藥物。
14.根據權利要求10所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質的應用，其特征在于所述的藥物的組合劑型是注射劑、冷凍干燥劑或噴霧劑。
全文摘要
本發明提供了一種包含巨噬細胞刺激因子受體(cFms)胞外片段的融合蛋白質，它由cFms受體的細胞外片段與人免疫球蛋白Fc通過一連接肽相連構成，命名為cFmsECD-Fc；cFms受體的細胞外片段由5個免疫球蛋白(IgG)樣胞外結構域中的至少兩個構成。構成的融合蛋白質包括YY-001、YY-002、YY-003、YY-004、YY-005、YY-006和YY-007。本發明提供的融合蛋白質，具有結合白細胞介素-34(IL-34)和結合巨噬細胞刺激因子(M-CSF)，阻斷IL-34/M-CSF配體跟共用受體cFms的結合的作用，適合治療異常情況下由IL-34/M-CSF所引起的疾病。對自身免疫性疾病、炎癥性疾病、骨質疏松癥和腫瘤具有潛在的治療前景。用于制備抑制炎癥性疾病的藥物、抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥物或抑制腫瘤生長和轉移的藥物。
文檔編號A61P17/06GK103044555SQ201210232648
公開日2013年4月17日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者殷勇, 鄭學初 申請人:雷克塞德(蘇州)生物醫藥有限公司