專利名稱：一種將蛋白質遞送到細胞中的方法
技術領域：
本發明主要涉及將蛋白質遞送到細胞中的方法。
背景技術：
對各種病癥、疾病和狀態的治療途徑可以設想將生物活性蛋白質遞送到細胞中，從而使該蛋白質能夠在細胞環境內執行其生物學功能。現存的將生物活性蛋白質遞送到細胞中的方法包括例如顯微注射[6，7]和電穿孔[8，9]的物理方法，該方法可證實難以應用在活體內。分子技術包括使蛋白轉導域(PTD)與活性蛋白質結合從而介導蛋白質的細胞吸收。三個最活躍地研究的PTD源自Drosophilia anntennapedia肽、HSV-VP22蛋白和HIV-TAT蛋白轉導基序。通過這些PTD穿過細胞膜的轉導的發生機制目前尚未充分了解，但是研究已顯示，肽和蛋白質的遞送與PTD中正電荷賴氨酸和精氨酸殘基的含量和分布密切相關[10，11] ο正在日益興起的合理的給藥研究中的另一途徑涉及陽離子型脂質和聚合物。例如，聚乙烯亞胺(PEI)結合蛋白質通過離子電荷相互作用能夠進入細胞[12]。蛋白質與PEI的結合必需在溫和條件下進行從而使蛋白質免于變性。而且，PEI的細胞毒性也限制其在活體內的應用，特別是具有高分子量的PEI。因此，需要將蛋白質(包括生物活性蛋白質或抗體)遞送到細胞中的另一途徑。

發明內容
一方面，本發明提供了一種膠束-蛋白質復合物，其包含陽離子型聚合物的膠束，所述陽離子型聚合物具有通式I一 (W— X— Y— Z)p-(w' —V -V —V ),-的結構；和蛋白質，所述蛋白質具有用來與所述膠束復合的區域。所述蛋白質通過蛋白質與陽離子型聚合物之間的相互作用復合到所述膠束的外部。在通式I中，W、X、Y和Z各自獨立地選自ORR'
--C——(CH^——--N————--N——jCH^一O--
LJ ；LΛ *LJ；
OO--O-C——----C-O——pH)--和不存在，其中 W、X、Y
LJ * LJ ·
和Z中只有一個為不存在，且W、X、Y和Z中至少一個為包含與R或V結合的氮的基團。而且，在通式I中，W' 'V 'Y'和Z'各自獨立地選自·
〇RR,
I—(CM)-- ——ι^Λ0Η)~°--
O Din*
LJ K,K,
oo--0-C-(cH)----C-。-(cH)"]--和不存在，其中 W,、
L-I ； L-I ;
V , V和r中只有一個為不存在，且f、V、Y'和r中至少一個為包含與R"或Ri "結合的氮的基團。此外，在通式I中，R和R'各自獨立地為H、烷基或雜烷基(heteroalkyl) ;R"和R'"各自獨立地為疏水基；P和q各自獨立地為大于零的整數；以及nums、!:、!]!'、n'、r' ,s'和C各自獨立地為大于O的整數。在本發明提供的膠束-蛋白質復合物中，所述陽離子型聚合物可包括聚{N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(膽留醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亞乙基)溴化銨]癸二酸酉旨} (poly {N-methyldietheneamine sebacate) -co- [ (cholesteryl oxocarbonylamidoethyl)methyl bis (ethylene) ammonium bromide] sebacate})。所述蛋白質可為寡妝、妝、多肽、全長蛋白質、蛋白質片段、蛋白質結構域(protein domain)或融合蛋白，并且可為生物活性的。在各種實施方式中，所述蛋白質可包括激素、受體配體、轉錄因子、轉錄增強子、轉錄抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生長因子、抗體或細胞毒性蛋白質。在特別的實施方式中，所述生長因子可包括神經膠質衍生的親神經因子，所述細胞毒性蛋白質可包括凝集素A，以及所述抗體可包括赫賽汀(here印tin)。本發明提供的膠束-蛋白質復合物可進一步包含附加的治療劑，其包括包含在所述膠束內部的藥劑或者復合到所述膠束外部的藥劑或核酸分子。另一方面，本發明提供了一種將蛋白質遞送到細胞中的方法。該方法包括使如本申請所述的膠束-蛋白質復合物與細胞接觸以使膠束-蛋白質復合物被吸收到細胞中。所述細胞可為體外細胞，或者可為體內細胞，所以該方法包括向被試者(包括例如人)施用所述膠束-蛋白質復合物。在一些實施方式中，所述蛋白質為生物活性蛋白質并且在遞送到細胞中后保持生物活性。再一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含如本申請所述的膠束-蛋白質復合物。所述藥物組合物可進一步包含可藥用的載體。又一方面，本發明提供了如本申請所述的膠束-蛋白質復合物用于將蛋白質遞送到被試者的細胞中的用途。所述被試者可為人。在各種實施方式中，所述蛋白質為生物活性蛋白并且在遞送到細胞中后保持生物活性。
結合附圖，在回顧本發明的具體實施方式
的下列描述后，對于本領域普通技術人員來說，本發明的其它方面和特點將變得明顯。


在圖中，只通過實施例說明本發明的實施方式圖I: P (MDS-共-CES)膠束/凝集素A復合物的粒度和ζ電勢。各條件重復三次測試。用誤差棒顯示標準差。 圖2:在用包含固定濃度的凝集素A和變化濃度的P (MDS-共-CES)的膠束/凝集素A復合物孵育后MDA-MB-231(a)、H印G2(b)、HeLa(c)和4T1 (d)細胞的生活力。各條件重復八次測試。用誤差棒顯示標準差。圖3:在用包含變化濃度的凝集素A和固定濃度的P (MDS-共-CES)的膠束/凝集素A復合物孵育后MDA-MB-231(a)、H印G2(b)、HeLa(c)和4T1 (d)細胞的生活力。各條件重復八次測試。用誤差棒顯示標準差。圖4:將P (MDS-共-CES)膠束介導的凝集素A和BioPorter介導的凝集素A遞送到1^-1^-231(&)、抱 62(13)、抱1^((3)和4Tl(d)細胞中的比較研究。在含血清培養基中分別以(a) 20ppm、(b) 50ppm、(c) 40ppm 和(d) IOOppm 的固定濃度使用 P (MDS-共-CES)。各條件重復八次測試。用誤差棒顯示標準差。
具體實施例方式本方法和組合物涉及生物可降解的陽離子膠束與蛋白質之間的復合物的形成，以及這種復合物用于將蛋白質遞送到細胞內部的用途。以前，在美國專利申請第10/849，498號(公開為US 2005/0260276)中描述了新的陽離子核-殼膠束。該申請涉及生物可降解的陽離子核-殼膠束用于遞送藥物(包括在膠束內部封裝的藥物)以及遞送核酸分子(包括與膠束外部結合的核酸分子)的用途。形成膠束的聚合物由具有連接到主鏈中季氨基(quaternary amino group)處的主鏈上的疏水側基的親水主鏈組成。該帶電季氨基賦予聚合物聚陽離子性質、沿著主鏈分布的非中和正電荷。該聚合物還包含沿著主鏈的叔氨基(tertiary amino group),其可被質子化和去質子化，從而使該聚合物在生理環境中具有緩沖效應[14]。如在US 2005/0260276中所述，通過在膠束裝配過程中用聚合物包合藥物而將藥物容易地封裝在膠束內部。盡管一些疏水基可位于膠束外部，但是許多藥物包含疏水部分，例如疏水環結構，從而使藥物與趨向與膠束結構的內部分離的聚合物上的疏水側基之間結
口 O同樣，如在US 2005/0260276中所述，如DNA的核酸可以容易地與膠束外部結合。核酸是具有沿著分子主鏈有規則地分布的負電荷的柔性分子，并因此能夠與膠束表面的輪廓相符并且與位于膠束外表面的陽離子電荷靜電結合。相反，蛋白質可以折疊成復雜結構，包括球狀結構，特別是在活性通常取決于蛋白質的構象折疊的生物活性蛋白質的情況下。蛋白質即使在具有負電荷區域時亦不會與聚陰離子核酸具有相同的電荷分布，并且往往是不能以與核酸相同的方式與膠束的表面一致。同樣，蛋白質往往對環境(包括微環境)十分敏感，并且在不適宜的條件下可變性，導致生物活性喪失。盡管蛋白質伴隨這些明顯的困難，本發明人現已證實了先前所述的膠束能夠令人驚訝地用于將蛋白質(包括折疊的生物活性蛋白質)遞送到細胞中。在保留蛋白質可具有的生物活性的同時，所述核-殼膠束可用于將該蛋白質遞送到細胞內部。細胞毒素凝集素A用作示范性的具有生物活性的蛋白質，并且如下列實施例I·所述，與BioPorter (包括陽離子脂質的商業可利用的蛋白質載體)相比，凝集素A被更加有效地遞送到細胞中。同樣，在通過膠束遞送時凝集素A針對各種癌細胞系的細胞毒性比在通過BioPorter遞送時的高得多。因此，本方法可導致蛋白質被非常有效地遞送到細胞中的同時保持蛋白質可具有的任何生物活性。所述膠束-蛋白質復合物具有多種應用，包括體外應用、研究和人的醫學應用。盡管將凝集素A用作示范性蛋白質，但是本發明所述的方法和復合物意欲延伸到通常蛋白質，包括抗體，例如赫賽汀；可以理解的是，本發明的方法和復合物不依賴于在該方法或復合物中所用的蛋白質的任何特定氨基酸序列或者生物活性。因此，提供了一種將蛋白質遞送到細胞內部的方法。由生物可降解的、陽離子型兩親性聚合物(amphilic polymer)形成的膠束用作遞送載體并且用來與要被遞送的蛋白質形成復合物。然后，使該復合物與將要向其中遞送蛋白的細胞接觸。該復合物適當地帶正電荷并且具有使復合物被胞吞的適當尺寸并因此被細胞吸收，從而將蛋白質遞送到細胞中。首先，提供了與蛋白質復合的膠束。如US 2005/0260276中所述，示范性的膠束包含陽離子型聚合物。如上所述，該聚合物具有包含氨基的親水主鏈。在形成聚合物主鏈的骨架的親水分子中的氨基為叔氨基。所述叔氨基可根據PH被質子化或者去質子化，根據溶液條件影響凈正電荷。然而，經由至少一部分叔氨基將疏水側基連接到親水主鏈上，其通過將這些氨基永久地轉變成帶正電荷的基團(即季氨基)，從而導致聚合物為陽離子型的(不管 pH)。所述陽離子型聚合物具有通式I的結構-(W-X-Y-Z)p- Qfi' -V -V -V )qW、X、Y和Z各自獨立地選自
ORR'
--C——------N——JCH|----N——^CH 參一O--
LJ ;IJ ; LJ ;
權利要求
1.一種膠束-蛋白質復合物，其包括 陽離子型聚合物的膠束，該陽離子型聚合物具有通式I的結構 —(W-X-Y-Z)p- Qfi' -V —V —V )-； 和蛋白質，該蛋白質具有用來與所述膠束復合的區域； 所述蛋白質通過蛋白質與所述聚合物之間的相互作用復合到所述膠束的外部； 其中,在通式I中 W、X、Y和Z各自獨立地選自
2.根據權利要求I所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述蛋白質的用來與所述膠束復合的區域為負電荷區域、極性區域或疏水區域。
3.根據權利要求I或2所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述陽離子型聚合物包括聚{N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(膽留醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亞乙基)溴化銨]癸二酸酯}。
4.根據權利要求I 3中任一項所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述蛋白質為寡肽、肽、多肽、全長蛋白質、蛋白質片段、蛋白質結構域或融合蛋白。
5.根據權利要求I 4中任一項所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述蛋白質為生物活性蛋白質。
6.根據權利要求5所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述蛋白質包括激素、受體配體、轉錄因子、轉錄增強子、 轉錄抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生長因子、抗體或細胞毒性蛋白質。
7.根據權利要求6所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述生長因子包括神經膠質衍生的親神經因子，所述細胞毒性蛋白質包括凝集素A，以及所述抗體包括赫賽汀。
8.根據權利要求I 7中任一項所述的膠束-蛋白質復合物，其進一步包含附加的治療劑。
9.根據權利要求8所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述附加的治療劑為包含在所述膠束內部的藥劑。
10.根據權利要求8所述的膠束-蛋白質復合物，其中，所述附加的治療劑為復合到所述膠束外部的藥劑或核酸分子。
11.一種將蛋白質遞送到細胞中的方法，其包括 使根據權利要求I 10中任一項所述的膠束-蛋白質復合物與細胞接觸以使所述膠束-蛋白質復合物被吸收到細胞中。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述細胞為體外細胞。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述細胞為體內細胞，并且所述方法包括向被試者施用所述膠束-蛋白質復合物。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述被試者是人。
15.根據權利要求11 14中任一項所述的方法，其中，所述蛋白質為生物活性蛋白質并且在遞送到細胞中后保持生物活性。
16.一種藥物組合物，其包含根據權利要求I 10中任一項所述的膠束-蛋白質復合物。
17.根據權利要求16所述的藥物組合物，其進一步包含可藥用的載體。
18.根據權利要求I 10中任一項所述的膠束-蛋白質復合物用于將蛋白質遞送到被試者的細胞中的用途。
19.根據權利要求18所述的用途，其中，所述被試者是人。
20.根據權利要求18或19所述的用途，其中，所述蛋白質為生物活性蛋白質并且在遞送到細胞中后保持生物活性。
全文摘要
本發明提供了一種由陽離子型聚合物形成的膠束與蛋白質的復合物以及使用該復合物將蛋白質遞送到細胞中的方法。
文檔編號A61K38/45GK102895668SQ201210404380
公開日2013年1月30日 申請日期2008年4月30日 優先權日2007年4月30日
發明者楊義燕, 王勇, 阿什林靈智·李 申請人:新加坡科技研究局