專利名稱：一種升高白細胞的中藥組合物及其制備工藝和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥領域，尤其涉及一種升高白細胞的中藥組合物及其制備工藝和應用。
背景技術：
目前手術、放療、化療仍然是治療惡性腫瘤的主要手段。手術是第一種根治腫瘤的方法，對于某些局限性腫瘤，單用手術方法有時即可治愈，但很多病人單靠手術治療不能防止腫瘤復發和遠處轉移，如果手術合并放射或化療治療，使很多腫瘤，即使是姑息性手術也能取得較好的效果。放射治療目前雖已能根治多種腫瘤，但還有一定的局限性。化學治療的發展歷史較短，目前單獨應用在多數腫瘤處于姑息性治療的水平，但對于某些腫瘤已取得相當高的治愈率。因此多數學者認為，化療正從姑息治療向根治水平過渡。但是化療也有很大的缺點，它對腫瘤細胞的選擇性抑制作用不強，全身用藥毒性較大。化療藥物中的絕大多數在抑制生長或殺傷瘤細胞的同時，會對正常組織細胞造成損傷，對分裂增殖較活躍·的骨髓細胞的損傷尤為明顯，往往導致骨髓造血功能降低，臨床上出現白細胞減少和(或)粒細胞缺乏等骨髓抑制的表現。骨髓抑制的機理在于主要是對造血干細胞的直接損傷和對骨髓基質細胞或微循環的結構或功能的損傷，造成骨髓抑制的程度及持續時間與放化療的部位、劑量及藥物種類有關(湯釗猷，《現代腫瘤學》，第2版，上海醫科大學出版社，2000 9)。中性粒細胞是白細胞的主要成分，所以中性粒細胞減少常導致白細胞減少。白細胞減少是指外周血白細胞絕對計數持續低于4. OX 109/L ;中性粒細胞絕對計數低于2. OX IO9/L，稱為中性粒細胞減少；低于O. 5X109/L時，稱為粒細胞缺乏癥。骨髓抑制的發生會延遲或阻礙腫瘤患者放、化療的治療進程，是并發放、化療后嚴重感染的主要誘因。骨髓抑制不但影響腫瘤治療的有效實施，重度的骨髓抑制(如粒細胞缺乏癥)所并發的嚴重感染甚至可能導致死亡。目前臨床上常用的利血生、鯊肝醇等口服西藥，雖然可以增強骨髓造血系統功能，促進白細胞增生，但效果不理想，僅適用于輕中度骨髓抑制。治療放、化療后重度骨髓抑制的常用藥物是集落刺激因子(CSF)，它升白效應迅即，可迅速動員、加快骨髓細胞的分化、成熟并釋放入外周血。但CSF的作用靶點相對比較單一，CSF無法有效地修復反復受損的骨髓造血微循環，使骨髓造血功能不斷下降，這也許就是許多復治化療患者在反復使用CSF后出現每次藥效遞減現象的原因之一。其次，被過度動員后的骨髓造血儲備會明顯降低，在一定時間內骨髓儲備的消耗無法及時補充，就會出現藥物的升白作用的維持時間變短，這可能就是臨床上有些患者在用藥后白細胞迅速大量上升但不久又進行性下降的原因之一。并且它的副反應較為明顯，主要表現為發熱、頭痛、骨痛、周身無力等感冒樣癥狀，另外可見胸悶、憋氣、皮疹等癥狀；并且CSF價格昂貴，作用時間短，給藥方法為皮下注射，屬有創治療。值得注意的是，有研究發現CSF可能對腫瘤細胞的生長具有刺激作用，是否應該慎用仍有爭議。近年來，中醫藥防治化療骨髓抑制也取得了一定進展，許多以扶正為主的中藥制劑治療骨髓抑制導致的白細胞減少均取得了較好療效。有關中醫藥治療化療后白細胞減少癥的meta分析指出中醫藥治療化療后白細胞減少癥有較好療效，較一般升白西藥有明顯優勢。除了升高白細胞，通過中藥治療，腫瘤化療骨髓抑制患者的臨床癥狀與全身情況多有明顯好轉，這提示中藥在促進骨髓造血的同時具有對機體整體調節的作用。但這些中藥多僅限于輕中度(I - ΙΓ )骨髓抑制的治療，對重度(III-IV。)骨髓抑制的防治研究較少。因此，優化中醫藥治療腫瘤化療骨髓抑制的治則治法，突破中醫藥僅用于I - Ir骨髓抑制的瓶頸，研究開發能在促進骨髓造血同時抑制腫瘤增殖的藥物成為亟待解決的臨床問題。目前中藥經驗復方雖然具備臨床基礎扎實，療效確切的優勢，但由于其配伍仍停留于中藥飲片的層次，成分復雜多樣，藥物進入機體后如何代謝、哪些有效部位通過哪些途徑或機制發揮作用均難以說明，這些都給制劑的質量控制，藥物產業化的推廣帶來了困難。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有的升高白細胞的西藥無法有效地修復反復受損的骨髓造血微循環，而中藥對重度骨髓抑制的療效有限的缺陷，提供了一種可升高白細胞，有效促進造血功能恢復的中藥組合物及其制備工藝和應用。本發明的中藥組合物通過促進脾細胞表達GM-CSF蛋白，增加內源性GM-CSF生成，升高GM-CSF活性，進而促進白細胞和骨髓細胞的分化增殖，可升高放化療患者的白細胞，防治放化療患者的骨髓抑制，改善和提高癌癥患者中醫癥候和生活質量；對于氣虛患者，通過益氣養陰，提高免疫力促進氣虛患者的恢復；且無毒副反應。本發明提供了一種升高白細胞的中藥組合物，其活性成分由下述原料中藥材制得黃芪和黃精(Polygonatum sibiricum Red.)，其中黃芪與黃精的重量比為I 1-2 I。本發明中所述的黃芪可選用各種品種的黃芪，例如莢膜黃芪(Astragalusmembranaceus (Fisch. ) Bge)和 / 或蒙古黃苗(Astragalus membranaceus (Fisch. )Bge.var. mongholicus(Bge. ) Hsiao)。本發明中，所述的中藥組合物可為本領域中藥制劑的各種常規劑型，較佳地為散齊 、口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑(包括硬膠囊或軟膠囊)、脂質體、緩釋制齊 、控釋制劑或注射劑(包括小針、輸液或凍干粉)，更佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸齊U、片劑、膠囊劑或注射劑。本發明中，可通過將所述活性成分與制備所述劑型時相應的賦形劑相結合，采用本領域常規方法制得各種劑型。本發明還提供了所述中藥組合物的制備工藝，其包括下述步驟采用下述方案中的任一種制備所述活性成分方案一按照所述中藥組合物中原料中藥材的重量比，將黃芪和黃精干燥后粉碎成細粉，得活性成分細粉；方案二 按照所述中藥組合物中原料中藥材的重量比，將黃芪和黃精加水煎煮，過濾，取濾液并離心分離去除固體物質，取上清液濃縮成清膏，得活性成分清膏；方案三按照方案二制備活性成分清膏，再進行干燥和粉碎，得活性成分細粉。
在方案二或方案三中，加水煎煮時，每次加水的量為本領域制備清膏時的常規用量，較佳地為所述原料中藥材總重量的8-16倍，煎煮的溫度較佳地為使煎煮液沸騰的溫度。每次煎煮的時間為本領域常規的煎煮時間，較佳地為2-4小時。煎煮的次數較佳地為1-4次。當所述煎煮次數為2次以上時，每次煎煮后都進行所述過濾,將每次過濾后的濾液合并，再進行所述離心去除固體物質。所述濃縮的方法采用本領域常規的清膏濃縮方法進行，濃縮的程度較佳地為使所述活性成分清膏在60°C時的相對密度為O. 8-1. 5。在本發明一較佳的實施方式中，所述的制備工藝還可包括下述步驟將所述活性成分與賦型劑按本領域常規方法制成各種藥學劑型，如散劑、口服液體制劑、顆粒劑、滴丸齊 、片劑、膠囊劑(包括硬膠囊或軟膠囊)、脂質體、緩釋制劑或注射劑(包括小針、輸液或凍干粉)等，較佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑或注射劑。其中，所述的賦型劑根據不同的劑型，按本領域常規知識選擇。在本發明一更佳的實施方式中，所述口服液體制劑的制備工藝按下述步驟進行將所述活性成分清膏與甜味劑和山梨酸鉀混合，與水混合攪拌，調PH值至6-7，過濾，灌裝， 滅菌，即得口服液體制劑。其中，所述甜味劑、山梨酸鉀和水的用量皆為本領域中進行口服液體制劑制備時的常規用量。所述PH值較佳地采用NaOH水溶液進行調節。該口服液體制劑劑型的優點是起效迅速，生物利用度高。在本發明一更佳的實施方式中，所述顆粒劑的制備工藝按下述步驟進行將所述活性成分清膏與糊精和甜味劑混合，干燥，制粒，整粒，即得顆粒劑。其中，所述糊精與所述活性成分清膏的重量比較佳地為I : 1-1 2，所述甜味劑的用量可為本領域中進行顆粒制劑制備時的常規用量，一般為所述顆粒劑重量的10%以下。在本發明一更佳的實施方式中，所述膠囊劑的制備工藝按下述步驟進行將所述活性成分清膏與淀粉混勻，制粒，過篩，干燥，整粒，灌裝，即得膠囊劑。其中，所述淀粉的用量為本領域中進行膠囊劑制備時的常規用量。在本發明一更佳的實施方式中，所述片劑的制備工藝按下述步驟進行將所述活性成分清膏干燥，粉碎，制粒，壓制成片，即得片劑；或者將所述活性成分細粉制粒，壓制成片，即得片劑。本發明還提供了一種升高白細胞的中藥組合物，其活性成分為黃芪提取物和黃精提取物，其中所述的黃芪提取物至少為黃芪多糖提取物，所述的黃精提取物至少為黃精多糖提取物；所述黃芪多糖提取物與所述黃精多糖提取物的重量比為I : 1-3 I。本發明中，所述的黃芪提取物較佳地還包括黃芪皂苷提取物和/或黃芪總黃酮提取物，所述黃芪多糖提取物和黃芪皂苷提取物的重量比較佳地為30 1，所述黃芪多糖提取物和黃芪總黃酮提取物的重量比較佳地為100 I。本發明中，所述的黃精提取物較佳地還包括黃精總皂苷提取物，所述黃精多糖提取物和所述黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為20 I。在本發明一較佳的實施方式中，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物。其中，所述黃芪多糖提取物與所述黃精多糖提取物的重量比較佳地為I : 1-3 : I。在本發明另一較佳的實施方式中，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物和黃芪皂苷提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物。其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃精多糖提取物的重量比較佳地為300 10 300。在本發明另一較佳的實施方式中，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物和黃芪皂苷提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物。其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃精多糖提取物所述黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為 300 : 10 : 100 : 5。在本發明一更佳的實施方式中，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃芪黃酮提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物。其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃芪總黃酮提取物所述黃精多糖提取物的重量比較佳地為 300 : 10 : 3 : 150。在本發明另一更佳的實施方式中，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃芪總黃酮提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物。其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃芪總黃酮提取物所述黃精 多糖提取物所述黃精總皂苷的重量比較佳地為300 : 10 : 3 : 300 15。本發明中，所述的中藥組合物可為本領域中藥制劑的各種常規劑型，較佳地為散齊 、口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑(包括硬膠囊和軟膠囊)、脂質體、緩釋制齊 、控釋制劑或注射劑(包括小針、輸液和凍干粉)，更佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸齊U、片劑、膠囊劑或注射劑。本發明中，可通過將所述黃芪提取物、黃精提取物與制備所述劑型時相應的賦形劑相結合，采用本領域常規方法制得各種劑型。本發明還提供了所述中藥組合物的制備工藝，其包括下述步驟將所述黃芪提取物和所述黃精提取物混合即可。在本發明一較佳的實施方式中，所述的制備工藝還可包括下述步驟將混合后的物料與賦型劑按本領域常規方法制成各種藥學劑型，如散劑、口服液體制劑、顆粒劑、滴丸齊 、片劑、膠囊劑(包括硬膠囊或軟膠囊)、脂質體、緩釋制劑或注射劑(包括小針、輸液或凍干粉)等，較佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑或注射劑。其中，所述的賦型劑根據不同的劑型，按本領域常規知識選擇。在本發明一更佳的實施方式中，所述口服液體制劑的制備工藝按下述步驟進行將所述混合后的物料與甜味劑和山梨酸鉀混合，與水混合攪拌，調PH值至6-7，過濾，灌裝，滅菌，即得口服液體制劑。其中，所述甜味劑、山梨酸鉀和水的用量皆為本領域中進行口服液體制劑制備時的常規用量。所述PH值較佳地采用NaOH水溶液進行調節。其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃精多糖提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃精多糖提取物的重量比較佳地為30 : I : 30。該口服液體制劑劑型的優點是起效迅速，生物利用度高。在本發明一更佳的實施方式中，所述顆粒劑的制備工藝按下述步驟進行將所述混合后的物料與糊精和甜味劑混合，干燥，制粒，整粒，即得顆粒劑。其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為300 10 3 300 15。所述糊精和甜味劑的用量可為本領域中進行顆粒制劑制備時的常規用量。
在本發明一更佳的實施方式中，所述膠囊劑的制備工藝按下述步驟進行將所述混合后的物料與淀粉混勻，制粒，過篩，干燥，整粒，灌裝，即得膠囊劑。其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為300 10 100 5。所述淀粉的用量為本領域中進行膠囊劑制備時的常規用量。在本發明一更佳的實施方式中，所述片劑的制備工藝按下述步驟進行將所述混合后的物料混勻，制粒，壓制成片，即得片劑。其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物和黃精多糖提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物和黃精多糖提取物的重量比較佳地為300 10 3 150。本發明所用試劑及原料均市售可得，黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物與黃精皂苷提取物為西安林禾生物技術有限公司生產；黃精多糖提取物為寧波德康生物制品有限公司生產；黃芪總黃酮提取物是上海中醫藥大學中藥研究所提供。本發明的中藥組合物的治療劑量可為成人每日服用量相當于O. 7-1. 5克活性 成分/kg體重。本發明還提供了所述的中藥組合物在用于制備治療白細胞減少癥，提高機體免疫功能，促進骨髓造血干/祖細胞增殖，保護造血微環境，修復放射線對骨髓造血組織的損壞和損傷，防治放、化療的骨髓抑制，促進粒-單系造血祖細胞集落形成，或改善和提高癌癥患者中醫癥候和生活質量的藥物中的應用。本發明中，上述優選條件在符合本領域常識的基礎上可任意組合，即得本發明各較佳實施例。本發明的積極進步效果在于經臨床及動物試驗研究發現，本發明的中藥組合物能夠升高癌癥患者白細胞，防治癌癥患者較重的骨髓抑制，提高機體免疫功能，促進骨髓造血干/祖細胞增殖，保護造血微環境，修復放射線對骨髓造血組織的損壞和損傷，防治放化療的骨髓抑制，促進粒-單系造血祖細胞集落形成，改善和提高癌癥患者中醫癥候和生活質量。


圖I為骨髓抑制小鼠外周血的WBC圖。圖2為主方對骨髓抑制小鼠BMNC的影響圖。圖3為主方對骨髓抑制小鼠粒系造血祖細胞增殖的影響圖。圖4為骨髓抑制小鼠骨髓⑶34+細胞比率的影響圖。圖5為骨髓抑制小鼠血清GM-CSF含量圖。圖6為RNA電泳圖。圖7為主方對骨髓抑制小鼠骨髓GM-CSFmRNA表達的影響圖(η = 8)。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物與黃精皂苷提取物為西安林禾生物技術有限公司提供。黃精多糖為寧波德康生物制品有限公司提供，黃芪總黃酮是上海中醫藥大學中藥研究所提取。實施例I 口服液體制劑的制備I、稱取原料中藥材黃芪30Kg，黃精30Kg。2、將上述藥材加15倍質量的水煎煮，時間3小時，過濾，將濾渣加水重復煎煮一次，過濾，合并兩次的濾液，離心分離去除固體物質，取上清液濃縮制得清膏(相對密度
O.8，溫度 59 0C ) ο3、加入Ikg甜味素，2kg山梨酸鉀，攪拌加水30L，10wt% NaOH水溶液調pH值至6-7，濾過，灌裝，滅菌。
實施例2顆粒劑的制備稱取黃芪多糖提取物30Kg，黃精多糖提取物30Kg，黃芪總黃酮提取物O. 3Kg，黃芪皂苷提取物lKg，黃精皂苷提取I. 5Kg，混勻后加入等質量的糊精和占顆粒劑5wt%的甜味素，再經過干燥、制粒、整粒，即可。實施例3膠囊制劑的制備將黃芪多糖提取物30Kg、黃芪皂苷提取物lKg、黃精多糖提取物10Kg、黃精總皂苷提取物O. 5Kg混合，再與淀粉混勻，制粒，過篩，干燥，整粒，灌裝，即得膠囊劑。實施例4片劑的制備將黃芪多糖提取物30Kg、黃芪皂苷提取物lKg、黃芪總黃酮提取物O. 3Kg和黃精多糖提取物15Kg混勻，制粒，壓制成片，即得片劑。實施例5 口服液體制劑的制備稱取黃芪多糖提取物30Kg、黃芪皂苷提取物IKg和黃精多糖提取物30Kg，混勻，力口入3kg甜味素,6kg山梨酸鉀,攪拌加水60L, IOwt % NaOH水溶液調pH值至6-7,濾過,灌裝，滅菌。效果實施例I動物實驗研究采用實施例I的口服液體制劑作為主方。I、實驗動物及分組及給藥方法取Balb/C小鼠隨機分為7組，每組22只。除正常對照組外，其余小鼠造模后隨機分入模型組、陽性對照利可君組、主方高、中、低劑量組。分組后連續給藥9天，利可君、主方(中劑量)組劑量相當于成人臨床有效劑量的9倍，主方高、低劑量各為臨床用量的18、4. 5倍。正常組和模型組給予等體積的生理鹽水。分別為正常組生理鹽水20mL · kg4 · Cf1 ;模型組生理鹽水20mL · kg—1 · cf1 ；利可君組20mg· kg-1 · cf1 ；主方高劑量組36g· kg—1 · cf1 ；主方中劑量組18g · kg' cf1 ;主方低劑量組9g· kg—1 · (Γ1。上述劑量皆每kg體重每天攝入的活性成分的量。2、實驗方法I. I樣本的采集
I. I. I外周血采集分別于造模后給藥第4、7、10日，尾靜脈取血20 μ 1，與I. 5% EDTA抗凝，以待上樣血細胞分析儀檢測。1.1.2血清分離給藥第10天，摘眼球取血采 集于EP管內，靜置2h，3000轉/分，15分鐘，離心分離血清，_80°C備用。I. I. 3骨髓單細胞懸液的制備脫白處死小鼠，在75%酒精中浸泡3分鐘，從股骨大轉子至髕骨處完整取出一側股骨，剔去肌肉，用注射器吸取無菌處理的PBS沖出骨髓細胞，通過4號針頭過濾，制成單細胞懸液。取少量進行細胞計數和骨髓細胞集落培養，一部分液氮中保存。1. 1. 4病理標本的制備給藥第10天，脫臼處死，取一側股骨，剔除軟組織后，于4%多聚甲醛溶液中固定48h后，于脫鈣液內繼續脫鈣固定。I. 2指標檢測I. 2. I外周血白細胞檢測分別于造模后第4，7，10日，尾靜脈取血20 μ I，血細胞分析儀上進行外周血白細胞數量測定。I. 2. 2骨髓有核細胞計數給藥第10日，稱重后脫曰處死，取右側完整股骨，用PBS沖出全部骨髓，形成單細胞懸液，顯微鏡下進行計數。I. 2. 3骨髓病理觀察給藥第10天，脫白處死，取左側股骨于4%多聚甲醛溶液中固定，經常規脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片、H-Giemsa-E染色，顯微鏡下觀察骨髓造血組織病理變化。骨髓造血組織損傷程度的劃分標準參照浦權[35]等方法進行改良在一個高倍視野下(10 X 40)，血竇數量10個以上，計I分，脂肪細胞面積1/3以下，計I分；血竇數量5-10個，計2分，脂肪細胞面積在1/3 1/2之間，計2分；血竇數量5個以下，計3分，脂肪細胞面積大于1/2，計3分，每個樣本的2種分值相加得出I個總分，用總分來描述小鼠骨髓造血組織損傷程度。I. 2. 4粒-單系祖細胞集落(CFU-GM)產率的檢測給藥第7天，脫臼處死小鼠每組3只，按I. 8. 3法制備各組小鼠BMNC單細胞懸液。參考文獻(徐有恒，王綺如.造血生理學和造血細胞檢測技術.湖南湖南科學技術出版社，1997 11)中記載的粒-單系造血祖細胞培養方法，IX 10_4mol/ml 2-巰基乙醇O. 2ml，3% L-谷氨酰胺 O. 03ml，馬血清 O. 5ml，25ng/ml rmGM-CSF O. 3ml，BMNC濃度調整至 I X IO5/ml，IMDM培養基補足體積至I. 8ml，3 % Agar O. 2ml，混勻，各培養體系總體積為2ml，于24孔板中培養，每孔O. 5ml，平行4孔。在37°C、5% C02培養箱中培養7天，在倒置顯微鏡下觀察，以多于40個細胞的克隆單位為一個集落。1.2. 5骨髓⑶34+細胞比例檢測按照文獻(MorelF, Szilvassy SJ, Travis M, et al. Primitive hematopoieticcells in murine bone marrow express the CD34 antigen.Blood,1988, (10)3774-3784)中記載的方法進行檢測。分別于給藥第4、7、10天，取Balb/C小鼠每組6只，按I. 8. 3法制成單細胞懸液，充分混勻。于每管加入2ml溶血素以破壞紅細胞，2000rpm離心15min,棄上清后重懸,取
IX IO6個細胞加入30 μ I正常小鼠血清以封閉非特異結合位點，加入10 μ I FITC標記的大鼠抗小鼠⑶34抗體，4°C避光反應30min，加入2ml紅細胞裂解液，作用4min，用PBS洗細胞2次(1500rpm，IOmin)，加入終濃度為3 μ g/ml的碘化丙啶(PI)染液，上流式細胞儀檢測。I. 2. 6骨髓細胞周期檢測按照文獻(PattonWF. A thousand points of light the application offluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis andproteomics. Electrophoresis, 2000, 21 (6) :1123-44)中記載的方法進行檢測。 給藥第7天，取Balb/C小鼠每組6只，按I.8.3法制成單細胞懸液，充分混勻。于每管加入2ml溶血素以破壞紅細胞,2000rpm離心15min,棄上清,加入Iml PBS重懸,再加入2ml無水乙醇,混勻,放置4°C冰箱固定過夜。檢測前，用PBS洗滌除去乙醇后，加RNase 50 μ g/ml，37°C溫育后冰浴中止酶的作用。加100 μ I PBS混勻，再加入50μ I含0. 1% Triton-100的PI染液(50 μ g/ml)進行染色，室溫避光放置60min，加入500 μ IPBS重懸，上流式細胞儀檢測骨髓細胞DNA含量并分析細胞周期。如有成團細胞，用500目尼龍網濾過后再上機檢測。I. 2. 7Elisa法檢測小鼠血清中粒-單核巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)含量給藥第10日，摘眼球取血，離心，分離血清，用雙抗體夾心Elisa法測定血清中GM-CSF含量。具體程序如下(I)檢測程序I)建立標準曲線設標準孔8孔，每孔中加入樣品稀釋液100μ 1，第一孔加標準品100 μ 1，混勻后加用加樣器吸出100 μ 1，移至第二孔。如此反復作對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100μ I棄去,使之體積均為100μ I。第八孔為空白對照。2)加樣待測品孔每孔各加入待測品100 μ I。3)將反應板充分混勻后置37°C 120分鐘。4)洗板用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。5)每孔中加入第一抗體工作液50 μ I。6)將反應板置37°C 60分鐘。7)洗板同前。8)每孔加酶標抗體工作液100 μ I。9)將反應板置37°C 60分鐘。10)洗板同前。11)每孔加入底物工作液100 μ 1，置37°C暗處反應5-10分鐘。12)每孔加入50 μ I終止液混勻。13)在492nm處測吸光度。(2)結果計算與判斷I)所有OD值都應減除空白值后在進行計算。2)以標準品 1000、500、250、125、62· 5、32、16、0ng/ml 之 OD 值在半對數紙上做圖，畫出標準曲線。3)根據樣品OD值在該曲線上查出相應的GM-CSF含量。I. 2. 8RT-PCR檢測骨髓抑制小鼠骨髓GM-CSF mRNA表達1.2. 8. I 標本來源給藥第10日，取Balb/c小鼠每組8只，按I. 8. 3法制成單細胞懸液凍存于液氮罐中。I. 2. 8. 2引物序列設計引物由上海生物化工有限公司合成，見下表。·5,primer3, primer尺寸(bp)
AGCGGTTCCGATGCAGAGGTCTTTACGGAT β-actin123
CCTACAACGGTCAACG
TTACTTTTCCTGGGCGTTTCACAGTCCGTTT GM-CSF371
ATTCCI. 2. 8. 3Trizol 法總 RNA 抽提按照Trizol Reagant試劑說明書進行總RNA提取實驗,步驟如下(I)液相分離取出凍存的小鼠骨髓細胞懸液轉移到EP管中，加入ImlTrizol液，充分混勻。將上述懸液在室溫下靜置5min，加入200 μ I氯仿，來回顛倒混勻15sec，再室溫靜置2-3min后，4°C, 12000轉/分,離心15min。則可見懸液分為三層上層水樣無色，所含RNA約占體積的60%，中層為蛋白，下層呈紅色，為酚氯仿。(2)1 熟沉淀小心將上層水相移至1 他86-;1^66 1.5ml EP管內，按O. 5ml異丙醇/ml Trizol加入異丙醇混勻，室溫靜置lOmin。4°C, 12000轉/分,離心IOmin,可見管底白色沉淀為RNA。(3) RNA洗滌棄去上清，按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩EP管洗下沉淀。4°C，7500轉/分，離心5min。(4) RNA再溶解棄上清，自然干燥5_10min (避免過于干燥)，加入DEPC水30 μ I溶解。(5) RNA濃度測定采用分光光度儀檢測Α26(ι/Α28(ι比值，以檢驗樣品RNA的純度；并按公式計算RNA濃度，C( μ g/ μ I) = (A260A280) X稀釋倍數/25。1.2.8. 4cDNA 第一鏈合成20 μ I RT反應體系內加入以下試劑總RNA2 μ IOligo (dT) 18Primer I μ IDEPC-H2O(IOmM)8μ I將上述樣品混勻，70°C反應5min，然后立即轉至冰上2_3min。室溫高速離心5sec，將所有溶液收集到管底，按次序分別加入下列試劑，使RT反應體系總量至20 μ I :5X First-Strand Buffer 4 μ I
Ribonuclease inhibitor 0. 5 μ IdNTP mix(IOmM)4μ IAMV Reverse Transcriptase I μ I將上述RT反應體系混勻，37°C保溫I小時。70°C加熱IOmin滅活，冰上冷卻。將所得cDNA第一鏈產物置_20°C保存，待作PCR。1.2.8.5PCR 擴增參照試劑和說明，結合實驗條件，20ulPCR反應體系如下 IOxPCR Buffer2μ1
dNTP Mix (各 2.5 mM) 2μ1primer0.5μ1 +0.5μ1
β-actin0·5μ1 +0·5μ1
Taq 酶0·5μ1
cDNA第一鏈反應液 3μ1
滅菌雙蒸水1()_5μ1PCR循環條件β-actin 95 °C預變性5min,接以26次循環數擴增(95 °C 5min,95°C 30s, 60°C 40s, 72°C lmin)，最后 72°C延伸 lOmin，冰上冷卻；GM-CSF 95°C預變性 5min，接以 26 次循環數擴增(95°C 5min,95°C 30s, 58°C 40s, 72°C lmin)，最后 72°C延伸 lOmin,冰上冷卻。I. 2. 8. 6PCR 產物分析PCR產物加樣于含1% EB的I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓150v，電泳30分鐘。在紫外光凝膠分析系統下攝片，運用灰度掃描軟件檢測以上電泳條帶的熒光強度。在同一反應體系中擴增目的基因和管家基因β -actin，并以兩者的熒光比值來衡量各目的基因的相對量進行分析統計。I. 2. 9免疫組織化學法檢測小鼠骨髓細胞GM-CSF及GM-CSFR α蛋白表達給藥第10日，每組取8只小鼠，取左側完整股骨，置于4%多聚甲醛溶液中固定48小時，10% EDTA脫鈣后，常規石蠟包埋、切片。免疫組化SP法(I)石蠟切片常規脫蠟至水。(2)3% H2O2室溫孵育5-10min，以消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min。(3)蒸餾水洗3次，每次lmin，進行抗原的修復將切片放入盛有O. OlM枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復1-2次。冷卻后PBS洗滌3次，每次5分鐘。(4)5% BSA封閉液室溫孵育30min。傾去血清，不洗。
(5)滴加適當比例稀釋的一抗(GM-CSF :1 100 ；GM-CSFRa 1 150)，4°C過夜。PBS沖洗3次，每次5min。同時以PBS液代替一抗進行陰性對照。
(6)滴加二抗(生物素化山羊抗小鼠IgG工作液)，37°C孵育30min。PBS洗3次，每次3min。(7)滴加SP混合液，20-37°C下放置30min，PBS洗4次，每次5min。(8)DAB顯色8_12分鐘，鏡下觀察控制時間。(9)蒸餾水充分沖洗，蘇木素輕度復染(60-90秒)，脫水，透明，封片。(10)陽性結果判定GM_CSF和GM-CSFa陽性表現均為細胞漿著色呈棕黃色。分別采用Image pro6. O圖像分析系統測定400倍鏡下陽性面積。每組選取切片6張，每張選取細胞分布均勻的三個視野進行分析。I. 3統計學方法各組實驗數據以均數土標準差(無士S)表示，整理后導入SPSS16.0統計軟件進行數據分析。以方差分析檢驗各組均數間的差異性，若方差不齊用Games-Howell校正檢驗。P <0.05為差異顯著，具有統計學意義。2、結果2. I對骨髓抑制小鼠外周血白細胞、骨髓有核細胞數量的影響2. I. I對骨髓抑制小鼠給藥第4、7、10天外周血白細胞的影響將小鼠給藥第4、7、10天的外周血白細胞數據進行重復測量的方差分析，球形檢驗P值< O. 01，如表I所示，表明各組小鼠給藥第4、7、10天的外周WBC存在高度相關性。表I各組小鼠給藥第4、7、10天重復測量外周血WBC的球形檢驗
權利要求
1.一種升高白細胞的中藥組合物，其活性成分由下述原料中藥材制得黃芪和黃精，其中黃芪與黃精的重量比為I : 1-2 I。
2.如權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于其劑型為散劑、口服液體制劑、顆粒齊U、滴丸劑、片劑、膠囊劑、脂質體、緩釋制劑、控釋制劑或注射劑，較佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑或注射劑。
3.—種如權利要求I或2所述的中藥組合物的制備工藝，其特征在于其包括下述步驟采用下述方案中的任一種制備所述活性成分 方案一按照所述中藥組合物中原料中藥材的重量比，將黃芪和黃精干燥后粉碎成細粉，得活性成分細粉； 方案二 按照所述中藥組合物中原料中藥材的重量比，將黃芪和黃精加水煎煮，過濾，取濾液并離心分離去除固體物質，取上清液濃縮成清膏，得活性成分清膏； 方案三按照方案二制備活性成分清膏，再進行干燥和粉碎，得活性成分細粉。
4.如權利要求3所述的制備工藝，其特征在于在方案二或方案三中，加水煎煮時，每次加水的量為所述原料中藥材總重量的8-16倍；和/或，煎煮的溫度為使煎煮液沸騰的溫度；和/或，每次煎煮的時間為2-4小時；和/或，煎煮的次數為1-4次，當所述煎煮次數為2次以上時，每次煎煮后都進行所述過濾，將每次過濾后的濾液合并，再進行所述離心去除固體物質；和/或，所述濃縮的程度為使所述活性成分清膏在60°C時的相對密度為O. 8-1. 5。
5.如權利要求3或4所述的制備工藝，其特征在于所述的制備工藝還包括下述步驟將所述活性成分與賦型劑按本領域常規方法制成散劑、口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片齊 、膠囊劑、脂質體、緩釋制劑或注射劑，較佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑或注射劑； 其中，所述口服液體制劑的制備工藝較佳地按下述步驟進行將所述活性成分清膏與甜味劑和山梨酸鉀混合，與水混合攪拌，調PH值至6-7，過濾，灌裝，滅菌，即得；所述pH值較佳地采用NaOH水溶液進行調節； 其中，所述顆粒劑的制備工藝較佳地按下述步驟進行將所述活性成分清膏與糊精和甜味劑混合，干燥，制粒，整粒，即得；其中，所述糊精與所述活性成分清膏的重量比較佳地為I : 1-1 : 2，所述甜味劑的用量較佳地為所述顆粒劑重量的10%以下； 其中，所述膠囊劑的制備工藝按下述步驟進行將所述活性成分清膏與淀粉混勻，制粒，過篩，干燥，整粒，灌裝，即得； 其中，所述片劑的制備工藝按下述步驟進行將所述活性成分清膏干燥，粉碎，制粒，壓制成片，即得片劑；或者將所述活性成分細粉制粒，壓制成片，即得。
6.一種升高白細胞的中藥組合物，其特征在于其活性成分為黃芪提取物和黃精提取物，其中所述的黃芪提取物至少為黃芪多糖提取物，所述的黃精提取物至少為黃精多糖提取物；所述黃芪多糖提取物與所述黃精多糖提取物的重量比為I : 1-3 I。
7.如權利要求6所述的中藥組合物，其特征在于所述的黃芪提取物還包括黃芪皂苷提取物和/或黃芪總黃酮提取物，其中所述黃芪多糖提取物和黃芪皂苷提取物的重量比較佳地為30 1，所述黃芪多糖提取物和黃芪總黃酮提取物的重量比較佳地為100 I。
8.如權利要求6所述的中藥組合物，其特征在于所述的黃精提取物還包括黃精總皂苷提取物，其中所述黃精多糖提取物和所述黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為20 I。
9.如權利要求6 8任一項所述的中藥組合物,其特征在于 所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物；其中，所述黃芪多糖提取物與所述黃精多糖提取物的重量比較佳地為1:1-3:1; 或，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物和黃芪皂苷提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物；其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃精多糖提取物的重量比較佳地為300 10 300 ； 或，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物和黃芪皂苷提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物；其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃精多糖提取物所述黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為300 10 100 5； 或，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃芪黃酮提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物；其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃芪總黃酮提取物所述黃精多糖提取物的重量比較佳地為300 10 3 150； 或，所述的黃芪提取物為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃芪總黃酮提取物，所述的黃精提取物為黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物；其中，所述黃芪多糖提取物所述黃芪皂苷提取物所述黃芪總黃酮提取物所述黃精多糖提取物所述黃精總皂苷的重量比較佳地為 300 : 10 : 3 : 300 15。
10.如權利要求6所述的中藥組合物，其特征在于所述的中藥組合物的劑型為散劑、口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、脂質體、緩釋制劑、控釋制劑或注射劑，較佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑或注射劑。
11.一種如權利要求6 9中任一項所述的中藥組合物的制備工藝，其包括下述步驟將所述黃芪提取物和所述黃精提取物混合即可。
12.如權利要求11所述的制備工藝，其特征在于所述的制備工藝還可包括下述步驟將所述混合后的物料與賦型劑按本領域常規方法制成散劑、口服液體制劑、顆粒劑、滴丸齊IJ、片劑、膠囊劑、脂質體、緩釋制劑或注射劑，較佳地為口服液體制劑、顆粒劑、滴丸劑、片齊U、膠囊劑或注射劑； 其中，所述口服液體制劑的制備工藝較佳地按下述步驟進行將所述混合后的物料與甜味劑和山梨酸鉀混合，與水混合攪拌，調PH值至6-7，過濾，灌裝，滅菌，即得；所述pH值較佳地采用NaOH水溶液進行調節；其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃精多糖提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物和黃精多糖提取物的重量比較佳地為30 I 30； 其中，所述顆粒劑的制備工藝較佳地按下述步驟進行將所述混合后的物料與糊精和甜味劑混合，干燥，制粒，整粒，即得；其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為300 10 3 300 15 ； 其中，所述膠囊劑的制備工藝較佳地按下述步驟進行將所述混合后的物料與淀粉混勻，制粒，過篩，干燥，整粒，灌裝，即得；其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃精多糖提取物和黃精總皂苷提取物的重量比較佳地為300 10 100 5；其中，所述片劑的制備工藝較佳地按下述步驟進行將所述混合后的物料制粒，壓制成片，即得片劑；其中，所述混合后的物料為黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物和黃精多糖提取物；黃芪多糖提取物、黃芪皂苷提取物、黃芪總黃酮提取物和黃精多糖提取物的重量比較佳地為300 10 3 150。
13.如權利要求1-2，6-10所述的中藥組合物在用于制備治療白細胞減少癥，提高機體免疫功能，促進骨髓造血干/祖細胞增殖，保護造血微環境，修復放射線對骨髓造血組織的損壞和損傷，防治放、化療的骨髓抑制，促進粒-單系造血祖細胞集落形成，或改善和提高癌癥患者中醫癥候和生活質量的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種升高白細胞的中藥組合物，其活性成分由下述原料中藥材制得黃芪和黃精，其中黃芪與黃精的重量比為1∶1-2∶1。本發明還公開了一種升高白細胞的中藥組合物，其活性成分為黃芪提取物和黃精提取物，其中所述的黃芪提取物至少為黃芪多糖提取物，所述的黃精提取物至少為黃精多糖提取物；所述黃芪多糖提取物與所述黃精多糖提取物的重量比為1∶1-3∶1。本發明還公開了所述升高白細胞的中藥組合物的制備工藝和應用。本發明促進白細胞和骨髓細胞的分化增殖，可升高放化療患者的白細胞，防治放化療患者的骨髓抑制，改善和提高癌癥患者中醫癥候和生活質量；對于氣虛患者，通過益氣養陰，提高免疫力促進氣虛患者的恢復；且無毒副反應。
文檔編號A61P7/00GK102895515SQ201210235938
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者徐振曄, 王立芳, 吳秋霞, 蔡曉月, 顧賢, 王爽 申請人:上海中醫藥大學附屬龍華醫院