專利名稱：硬腦/脊膜移植替代物的制備方法及其裝置的制作方法
技術領域：
本發明屬于組織工程學醫用生物材料技術領域，具體涉及一種硬腦/脊膜移植替代物的制備方法及其裝置。
背景技術：
硬腦膜和硬脊膜分別是大腦與顱骨、脊柱與脊髓之間重要的功能膜組織，具有相同的生物學特征和功能。硬腦膜貼附顱腔內面，與顱蓋連結疏松，與顱底結合緊密；硬腦膜在腦神經出顱處向外延伸，移行而與神經的被膜結合，在枕骨大孔周緣向下延為硬脊膜。開放性創傷、炎癥、腫瘤或其他腦顱脊柱疾病等均會引起硬腦/脊膜的損傷。硬腦/脊膜的破損往往又會引起癲癇、脊液外漏、顱內感染、腦膜膨出、腦功能障礙等病癥。硬腦/脊膜成形術是解決硬腦/脊膜損傷的臨床方式，需要采用移植替代物植入缺損部分進行修復。因此，硬腦/脊膜移植替代材料的研發至關重要。本申請中所稱硬腦/脊膜即指硬腦膜和硬脊膜 (硬腦膜和硬脊膜的功能和結構都是一致，硬腦膜是保護腦組織，硬脊膜是保護脊髓組織，二者連接為一體)。目前采用自體筋膜移植修復硬腦/脊膜仍是臨床應用的標準，但存在有來源受限、術后早期腦脊液滲漏發生率高、易粘連、供區不愈合等缺點。尸體來源的硬腦膜材料也曾被用于硬腦/脊膜修復，但由于捐獻者少，一個材料僅能用于4 5例患者移植修復，市場化困難；更重要的是，尸體來源的材料具有引起病毒傳染的高風險，如克雅氏病(CJD)。1987年自美國發現第一例因為采用尸體來源的硬腦膜而患CJD致死的患者，后又在全世界范圍內陸續出現62名類似患者，美國食品藥品監督管理局(FDA)對此類產品進行了嚴厲處置。高分子聚合物材料也被大量地研究用于硬腦/脊膜修復，根據降解性能分為可降解高分子聚合材料和不可降解聚合材料，例如不可降解的聚四氟乙烯(PTFE)，可降解的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內酯(PCL)等及其共聚物。中國專利文獻101878048A公開了一種丙交酯/ e -己內酯共聚物人工硬腦膜的制造方法；美國專利20070233275公開了一種聚乳酸(PLA)/乙醇酸(GA) /己內酯(CL)三元共聚物硬腦膜修復材料的制備方法。無論是可降解或是不可降解的高分子聚合材料，均存在有以下缺陷可降解聚合材料降解后往往會產生酸性微環境，引起嚴重的炎癥反應，影響修復效果；不可降解的聚合材料對于受體來說永遠是異物，易導致炎癥反應、結締組織增生包裹、感染、出血等。Protasoni M.等(J Neurosurg 114 :1723-1730, 2011)研究了人體硬腦膜的膠原架構特征，發現人體硬腦膜具有五層結構1)與頡骨接觸的骨表面層(Bone surfacelayer) ；2)外中間層(External Median Layer) ；3)血管層(Vascular Layer) ；4)內中間層(Internal Median Layer) ；5)蛛網膜層(Arachnoid Layer)。每個結構層的膠原纖維具有特殊的取向和不同的搭配編制模式，具有不同的功能。這一發現對人工硬腦膜材料的研發具有重要的啟發意義。因為動物膜組織同樣具有類似的多層功能結構和膠原架構，以此開發硬腦/脊膜移植替代物是可行的。
大量的研究被用于開發異種脫細胞基質硬腦/脊膜修復材料。這類材料來源廣泛，例如哺乳動物的皮膚組織、筋膜、心包膜、腹膜、隔膜、小腸粘膜等。現有的脫細胞基質材料的制備方法主要是通過脫細胞去抗原、或封閉抗原和交聯固定等工藝完成。美國專利5413798公開了一種硬腦膜替代材料的制備方法及其應用。該材料是以牛心包膜為原料，經過濕化學處理、漂白、輕洗、脫脂、凍干和滅菌等工藝制備。經動物試驗顯示該材料具有良好的生物相容性和硬腦膜修復效果，但是臨床實驗發現該材料仍有粘連現象發生。中國專利申請200510120796. 5公開了一種動物組織經過非醛類固定劑交聯固定和活潑試劑封閉抗原處理獲得的可用于修復的生物型硬腦膜。盡管該專利宣稱動物組織經過堿處理、脫脂、交聯固定和封閉抗原處理，可以達到去抗原目的；但是，其對動物組織中的細胞如何處理沒有說明，若只通過封閉抗原處理，則細胞成分引起免疫反應的風險是很大的；盡管通過交聯固定可以改變材料的降解性能，達到“被動式”降解，但人體硬腦膜和動物膜組織都具有獨特的多層結構，這樣整體交聯后勢必造成不同結構層的趨同化，會引起一些功能的消退；此外，隨著材料的降解，被封閉的抗原會再次裸露，有引起免疫排斥的危險。一些實驗研究發現，這種經過交聯固定處理的材料在動物體內長時間不降解，與組織再生 并不匹配，生物相容性差。總之，現有方法都需要采用各種化學試劑、交聯劑、酶等脫細胞處理，在處理過程中會破壞材料的天然結構，降低使用性能，如材料的降解性能、力學性能等；或者脫細胞去抗原不徹底，或者材料植入體內后由于降解致使被封閉的抗原重新裸露，引起嚴重的免疫反應。大量臨床實驗發現，這類材料會與腦組織發生粘連，長期效果有待進一步驗證。因此，現有的脫細胞去抗原技術還未達到理想要求。

發明內容
針對現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種硬腦/脊膜移植替代物的制備方法及其裝置，使所制備的硬腦/脊膜移植替代物具有致密面和疏松面以及膜組織的天然結構，并有效去除細胞及抗原成分，其生物相容性好、無免疫排斥、使用安全可靠、柔韌力學性能好。本發明所提出硬腦/脊膜移植替代物的制備方法，包括以下步驟步驟一、將膜組織在-20 _80°C溫度下冷凍2 24小時，初步破碎膜組織中的細胞，在室溫下解凍，如此反復凍融I 3次；所述的膜組織為哺乳動物的心包膜、腹膜、隔膜、硬腦膜和小腸黏膜的任一種；步驟二、將凍融后的膜組織采用輾壓進一步破裂細胞，輾壓是以空氣或是液體為環境媒介，可以在常壓、或是真空、或是壓力的環境中進行；輾壓的壓力為5MPa 50Mpa，優化值為IOMPa 20Mpa ;所述液體媒介可以選擇純化水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)或是Tris緩沖液的任一種。由于天然動物膜組織的表面結構一面疏松一面致密，具有不同的生理功能，在脫細胞去抗原處理時，保持其固有的結構特點至關重要；因此在去抗原處理前需通過交聯固定對膜組織表面進行保護；步驟三、將輾壓后的膜組織進行交聯固定保護對膜組織的疏松面不交聯，或是以< 2小時的紫外光照射交聯；而對膜組織的致密面，采用物理交聯或化學交聯、或是二者復合的方式；其中物理交聯為2 12小時的紫外光照射，優化選擇為4 6小時；物理交聯也可以是有機溶劑脫水交聯，所述的有機溶劑為乙醇、或丙酮、或異丙醇；化學交聯可以采用異氰酸鹽類(HDI)、或酰基疊氮類(DPPA)、或醌類(NDGA)、或碳化二亞胺(EDC)、或環氧化合物(EC)及其低聚物、或聚乙二醇為化學交聯劑，或是采用葡萄糖、或核糖為生物交聯劑；交聯劑的優化選擇為EDC或D-核糖。采用EDC交聯的方法為，以乙醇、或異丙醇、或丙酮與磷酸鹽緩沖液(PBS)的混合溶液為溶媒，其中有機試劑占溶媒總體積的30 50%;再以N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為穩定劑，EDC的濃度為5mM 20mM，NHS的用量是EDC的1/4 1/3，交聯溫度為2 10°C，交聯時間16 36h ;采用D-核糖交聯的方法為，以乙醇、或異丙醇、或丙酮與水的混合溶液為溶媒，有機試劑占溶媒總體積的60 80%，D-核糖濃度為0. 3mM 3mM，交聯溫度為20 40°C，交聯時間3 15天。 在交聯固定處理時，對疏松面進行低強度的交聯或不交聯，對致密面的高強度交聯，是通過交聯方式、交聯劑種類和濃度及時間的調整來完成。通過不同的交聯方式及強度分別對膜組織的兩個表面進行處理，以緩沖后續處理對膜結構的破壞。步驟四、脫細胞去抗原對交聯后膜組織的兩個表面采用不同方式脫細胞去抗原處理，疏松面的處理強度相對致密面要溫和； 對膜組織的致密面，采用酸溶液、或堿溶液、或鹽溶液、或酶溶液、或雙氧水溶液，或是丙酮、異丙醇、乙醇的任一種溶劑進行脫細胞去抗原處理；其中，酸溶液為鹽酸或硫酸，濃度為0. 5 2M，處理時間I 12h ;堿溶液為氫氧化鈉、或氫氧化鉀、或氫氧化鋰、或氫氧化鈣，濃度為0. 5 2M，處理時間I 12h ;鹽溶液為氯化鈉或氯化鉀，濃度為I 3M，處理時間0. 5 2h ;酶溶液為活力> 250U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力> 50KU/mL的RNA酶溶液、或活力彡15KU/mL的DNA酶溶液，處理時間8 24h ;雙氧水溶液的體積濃度為2% 30%，處理時間I 6h ;丙酮、異丙醇、乙醇均為純試劑。在處理中對于試劑和條件的具體選擇，則視處理材料與處理效果的情況確定，而且該處理可以是單次處理，也可以是多次處理，并允許是多種試劑的聯合處理或交替處理；混合處理如堿與鹽、酸與鹽、堿與雙氧水等；交替處理如雙氧水處理后采用高滲鹽溶液處理，再進行堿處理等。對膜組織的疏松面，采用低滲溶液，或弱酸溶液、或弱堿溶液、或酶溶液、或十二烷基硫酸鈉(SDS)、或曲拉通(Triton)、或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)進行脫細胞去抗原處理；其中，低滲溶液為10 IOOmM濃度的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、或是濃度低于9g/L的鹽溶液，處理時間2 24h ;弱酸溶液為醋酸、或檸檬酸、或乳酸，濃度為0. I 0. 5M，處理時間I 12h ;弱堿溶液為碳酸鈉、或碳酸氫鈉、或碳酸鉀、或碳酸氫鉀,質量濃度為0. 25 1%，處理時間I 12h ;酶溶液為活力彡25U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力彡5KU/mL的RNA酶溶液、或活力彡I. 5KU/mL的DNA酶溶液，處理時間8 24h ；SDS溶液的濃度為5g/L 20g/L，處理時間12 48h ；Triton溶液的濃度為lg/L 10g/L，處理時間12 24h ；EDTA溶液的濃度為lg/L 10g/L，處理時間0. 5 6h。在處理中對于試劑和條件的具體選擇，則視處理材料與處理效果的情況確定，而且該處理可以是單次處理，也可以是多次處理，并允許是多種試劑混合處理或交替處理。
在本發明交聯固定和脫細胞去抗原過程中，可輔以超聲或震蕩的方式處理；超聲頻率為20 lOOKHz，間隔I 2h處理一次，每次5 IOmin ;震蕩可以采用水浴或氣浴搖床，轉速80 200rpm，或間隔震蕩、或連續震蕩。步驟五、致密面的纖維化修飾采用磷酸鹽與堿的混合溶液對膜組織致密面進行纖維化修飾處理；所述的磷酸鹽為磷酸氫二鈉或磷酸鉀，濃度為0. I 0. 5M，所述的堿為氫氧化鈉、或氫氧化鉀、或氫氧化鋰、或氫氧化鈣、或是氨水，濃度為0. 01 0. IM ;所述的混合溶液PH彡11，處理溫度2 25°C，優化溫度4 10°C，處理時間6 48小時，優化時間12 24小時；在混合溶液處理后，還可以再采用丙酮、乙醇、異丙醇等有機試劑進行處理，加強致密化效果。盡管經過交聯固定保護，但在脫細胞去抗原過程仍可能引起致密面膠原結構的變化，比如膠原纖維的松散和解構等。采用磷酸鹽與堿的混合液對致密面進行纖維化修飾處理，改變材料中膠原纖維的微觀構象和結構，使該面的膠原纖維化程度更高、纖維排列更密、取向程度更高。 步驟六、包裝及滅菌將所得產品經干燥、裁切、包裝、滅菌后儲存。為了在使用中更容易區分產品的兩面，方便臨床使用，可以在包裝前對產品疏松表面進行碾壓標記，從而區分產品的致密面和疏松面。本發明制備方法中對膜組織兩個表面分別處理所采用的裝置，是由相同的兩個容器對扣組成，容器的口徑與膜組織的材料尺寸相匹配，兩個容器之間通過對扣能固定膜組織材料，以插槽、或螺栓、或卡扣方式密封固定，在兩側分別注入不同液體時，使容器兩側的液體不會互通和滲漏；在兩個容器上分別設有進出液導管，可以注入或排除溶液；封閉導管口后，采用震蕩、超聲等方式進行處理，處理完畢后再排出溶液。容器可以選擇耐酸、堿及鹽腐蝕的材料制作，如有機玻璃、聚丙烯、或聚四氟乙烯。其特征還在于，在兩個容器上分別設置進液導管和出液導管；進液導管和出液導管分別通過管路連接于循環泵，使兩個容器內液體分別實現循環流動，流速控制在5 50mL/min,有利于交聯固定和脫細胞去抗原處理。與現有技術相比，本發明具有以下效果1)制備方法簡單、原料來源廣泛且低廉，規模化生產可降低醫療成本；2)所采用的輾壓方法操作簡單，可以降低后續脫細胞去抗原處理的強度，有利于保護膜組織的天然結構；3)所采用先交聯后脫細胞的處理方式，可以在保護膜組織天然結構和性能的同時徹底去除引起免疫反應的細胞成分和其他抗原成分，避免采用單一封閉抗原或直接去抗原方法潛在的抗原再次裸露或影響材料結構的弊端；也避免了先脫細胞再交聯方法的材料毒性高、力學性能和降解性能難以兼顧的缺點；4)對膜組織兩個表面采用分面處理方式，使所制備的膜替代物具有獨特的表面功能結構，能夠滿足硬腦/脊膜缺損修復的需要；致密面能防止粘連以及腦/脊液滲漏，疏松面有利于組織液的吸附、活性因子的富集、血管和細胞的長入，具有促進組織再生功能；5)所制備的膜替代物生物相容性好、無免疫排斥、使用安全可靠、材料柔韌力學性能好，易于臨床手術操作，與周圍組織貼合好，易于縫合，不撕裂，或直接覆蓋使用不用縫合；并具有與宿主融合快、可降解吸收、修復效果好的優點。經動物試驗表明，本發明制備的膜替代物植入2 3周后可與缺損周圍組織完全融合，6 10周完全降解吸收，缺損得到完全修復，未見腦/脊液滲漏，未與腦組織發生粘連，未發現明顯的排斥反應。


附圖I為本發明所設計膜組織分面處理裝置的結構示意圖；圖中I和2分別為腔體I和腔體II，3為進液導管，4為出液導管，5為膜組織材料；
附圖2為本發明方法所制備硬腦/脊膜替代物截面的電鏡(SEM)照片，可見明顯的雙面結構，其中6為疏松面，7為致密面；附圖3為采用本發明實施例I所制備硬腦/脊膜替代物修復兔硬腦膜缺損術后2周取材的大體照片，可以看出硬腦膜上的兩處缺損已經沒有明顯的缺損痕跡，材料已開始與周圍組織融合，沒有粘連和腦脊液滲漏現象發生；圖中圓圈標注位置為缺損修復區；附圖4為采用本發明實施例2所制備硬腦/脊膜替代物修復兔硬腦膜缺損術后4周取材的大體照片，可以看出硬腦膜上的兩處缺損已無明顯的缺損痕跡，材料已與周圍組織融合，沒有粘連和腦脊液滲漏現象發生；圖中圓圈標注位置為缺損修復區；附圖5為采用本發明實施例I所制備硬腦/脊膜替代物修復兔硬腦膜缺損術后2周取材的組織學01E)染色結果照片，方框標注的是缺損邊緣，顯示有大量結締組織生成，可見材料已與周圍組織融合，與附圖3結果一致。
具體實施例方式以下結合實例對本發明技術方案作進一步的詳細說明。實例中所采用的哺乳動物膜組織購于屠宰場，分離附帶的脂肪等雜質后，采用PBS緩沖液或生理鹽水清洗除去血色，再用超純水清洗。實例中使用的分面處理裝置采用聚丙烯材料制備，單個腔體容積為0. 8L，開口大小為12cmX 12cm,開口處設有密封膠條，兩個腔體相嵌，腔體兩邊設有卡扣或是螺栓，可以進一步密封固定膜材料；兩種規格①在兩個容器上分別設有進出液導管；②分別設置有進液導管和出液導管，分別通過管路連接循環泵，使兩容器內液體分別實現循環流動。實例中的輾壓裝置為廣州旭眾食品機械公司生產的SZ-150型手動壓面機，可以將其置入容器中，保證輾壓輥浸入液體；也可以在輾壓時采用噴淋液體的方式。當然，輾壓也可采用其他擠壓設備、或高壓水槍沖擊處理。實施例I、以牛心包膜、腹膜為原料，按以下步驟制備硬腦/脊膜移植替代物。步驟一、凍融經過預處理的膜組織，于_80°C下冷凍3h，取出在室溫條件下解凍；再重復操作2遍，然后用PBS緩沖液或生理鹽水清洗；步驟二、輾壓采用輾壓裝置，控制輾壓壓力9±謹 &，轉速2±1印111，將經過凍融的膜組織在生理鹽水中反復輾壓5遍后，用超純水沖洗；步驟三、交聯固定保護將輾壓后的膜組織分割成約12. 5cmX12. 5cm大小，置于分面處理裝置的一側容器開口處，把另一側容器開口相對膜組織，開口處的密封膠條固定住膜組織，兩個容器相嵌，扣上兩側的卡扣，保證密封效果。在疏松面一側的容器腔體內注入生理鹽水，在致密面一側的容器腔體內注入交聯混合溶液，4°C下以90rpm速度震蕩交聯16小時，然后注入PBS緩沖液沖洗膜組織表面，洗去殘留的交聯劑；在疏松面一側采用紫外光照射交聯2h ;其中交聯混合溶液為30%的乙醇與70%的磷酸鹽緩沖液的混合，內含交聯劑 EDC 20mM，穩定劑 NHS 5mM。步驟四、脫細胞去抗原將交聯后的膜組織再次固定于分面處理裝置，向疏松面一側的容器腔體內注入含有6g/mL的氯化鈉和I. 5g/L的EDTA的Tris-HCl緩沖溶液，pH =8. 0 ;并向致密面一側的容器腔體內注入IM的NaOH與3%的H2O2的混合溶液；室溫下溶液循環處理16h，液體流速為10ml/min ;輔以超聲處理，每小時I次，每次5min，整個體系每4小時換液一次；然后分別用PBS液和超純水沖洗膜組織。步驟五、致密面纖維化修飾向致密面一側的容器腔體內注入含有0. IM的Na2HPO4和0. 05M的NaOH的混合溶液，于4°C下處理14小時；拆開分面處理裝置，分別用PBS緩沖液和超純水清洗膜組織，漂洗去除殘留鹽分；步驟六、包裝及滅菌將得到的膜組織經過冷凍干燥、對疏松面表面進行壓花標 記，然后裁切、封裝后輻照滅菌，得到硬腦/脊膜移植替代物產品。所制備膜產品的厚度為0. 5 2mm (膜組織的厚度是不均勻的)，滲水率為零，縫線撕裂力不低于7N，復水時間小于lOmin，脂肪含量低于I %，羥脯氨酸含量大于10 %，細菌內毒素低于2. 15EU/件，無熱原、無毒性；縫合不易撕裂、脫邊，操作方便；用于兔硬腦膜缺損修復動物實驗結果顯示缺損修復良好，無粘連，無腦脊液滲漏(見附圖3)。實施例2、以豬硬腦膜為原料，按以下步驟制備硬腦/脊膜移植替代物。步驟一、凍融經過預處理的膜組織，于_20°C下冷凍12h，取出在室溫條件下解凍，再重復操作I遍，然后分別用PBS緩沖液和生理鹽水清洗；步驟二、輾壓采用輾壓裝置，控制輾壓壓力17±lMPa，轉速7±lrpm，將經過凍融的膜組織在空氣中反復輾壓6遍后，用超純水沖洗；步驟三、交聯固化保護將輾壓后的膜組織裁切成約12. 5cmX12. 5cm大小，置于分面處理裝置的一側容器開口處，把另一側容器開口相對膜組織，兩個容器相嵌，開口處的密封膠條固定住膜組織，扣上兩側的螺栓，通過旋緊保證密封效果。在疏松面一側的容器腔體內泵入生理鹽水，在致密面一側的容器腔體內泵入濃度為3mM的D-核糖交聯溶液(內含丙酮80% )，于37°C下以80rpm速度震蕩交聯3天；然后分別用PBS緩沖液和超純水沖洗；步驟四、脫細胞去抗原向疏松面一側的容器腔體內泵入濃度為0. IM的醋酸溶液，并向致密面一側的容器腔體內泵入含有0. 5M的NaOH和I. 5%的H2O2的混合溶液，于室溫下輔以震蕩處理8h，震蕩速度為90rpm，隔4h換液一次；最后分別用PBS液和超純水沖洗膜組織；步驟五、致密面纖維化修飾向致密面一側的容器腔體內泵入含有0. 511的1(3 04和
0.IM的氨水的混合溶液，于4°C下處理8小時；用超純水沖洗后，再注入丙酮溶劑，4°C下脫水處理16小時，隔8小時換液一次；最后采用抽真空方法去除殘留丙酮；拆開分面處理裝置，取出膜組織產品；步驟六、包裝及滅菌將得到的膜材料產品經過冷凍干燥、裁切、封裝后輻照滅菌，得到硬腦/脊膜移植替代物產品。所制備的替代物產品厚度為0. I 0. 5mm之間，滲水率為零，縫線撕裂力不低于5N，復水時間小于lOmin，脂肪含量低于1%，羥脯氨酸含量大于10%，細菌內毒素低于2. 15EU/件，無熱原，無毒性；縫合不易撕裂、脫邊，也 可以不縫合使用，操作方便；用于兔硬腦膜缺損修復動物實驗結果顯示缺損修復良好，無粘連，無腦脊液滲漏(見附圖4)。
權利要求
1.一種硬腦/脊膜移植替代物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一、將膜組織在-20 -80°c溫度下冷凍2 24小時后，于室溫下解凍，如此反復凍融I 3次；所述的膜組織為哺乳動物的心包膜、腹膜、隔膜、硬腦膜和小腸黏膜的任一種； 步驟ニ、將凍融后的膜組織采用輾壓破裂細胞，輾壓是以空氣或是液體為環境媒介進行；輾壓壓カ為5MPa 50Mpa ； 步驟三、將輾壓后的膜組織進行交聯固定保護對膜組織的疏松面不交聯 ，或是以< 2小時的紫外光照射交聯；對膜組織的致密面，采用物理交聯或化學交聯、或是二者復合方式；其中物理交聯為2 12小時的紫外光照射，或是采用こ醇、或丙酮、或異丙醇的脫水交聯；化學交聯是采用HDI、_DPPA、_NDGA、_EDC、_EC及其低聚物、或聚こニ醇為化學交聯劑，或是采用葡萄糖、或核糖為生物交聯劑，進行交聯反應； 步驟四、脫細胞去抗原對交聯后膜組織的兩個表面采用不同方式脫細胞去抗原處理，對疏松面的處理強度相對致密面要溫和； 步驟五、致密面的纖維化修飾采用磷酸鹽與堿的混合溶液對膜組織致密面進行纖維化修飾處理；所述的磷酸鹽為磷酸氫ニ鈉或磷酸鉀，濃度為O. I O. 5M，所述的堿為氫氧化鈉、或氫氧化鉀、或氫氧化鋰、或氫氧化鈣、或是氨水，濃度為O. 01 O. IM ;所述的混合溶液pH彡11，處理溫度2 25°C，處理時間6 48小時；得到硬腦/脊膜移植替代物產品；在混合溶液處理后，允許再采用丙酮、こ醇、異丙醇有機試劑進行致密化處理； 步驟六、包裝及滅菌將所得產品經干燥、裁切、包裝、滅菌后儲存。
2.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟ニ中，輾壓壓カ為IOMPa 20Mpa ;所述液體媒介為純化水、生理鹽水、PBS緩沖液或是Tris緩沖液的任ー種。
3.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟三中，物理交聯的紫外光照射為4 6小時。
4.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟三中，化學交聯劑為EDC或D-核糖；采用EDC的交聯方法為，以こ醇、或異丙醇、或丙酮與磷酸鹽緩沖液的混合溶液為溶媒，有機試劑占溶媒總體積的30 50%;以NHS為穩定劑，EDC的濃度為5mM 20mM，NHS的用量是EDC的1/4 1/3，交聯溫度為2 10°C，交聯時間16 36h ;采用D-核糖的交聯方法為，以こ醇、或異丙醇、或丙酮與水的混合溶液為溶媒，有機試劑占溶媒總體積的60 80%，交聯劑濃度為O. 3mM 3mM，交聯溫度20 40°C，交聯時間3 15天。
5.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟四中脫細胞去抗原的處理為 對于膜組織的致密面，采用酸溶液、或堿溶液、或鹽溶液、或酶溶液、或雙氧水溶液，或是丙酮、異丙醇、こ醇的任一種溶劑進行脫細胞去抗原處理；其中，酸溶液為鹽酸或硫酸，濃度為O. 5 2M,處理時間I 12h ;堿溶液為氫氧化鈉、或氫氧化鉀、或氫氧化鋰、或氫氧化鈣，濃度為O. 5 2M，處理時間I 12h ;鹽溶液為氯化鈉或氯化鉀，濃度為I 3M，處理時間O. 5 2h ;酶溶液為活カ彡250U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力彡50KU/mL的RNA酶溶液、或活力彡15KU/mL的DNA酶溶液，處理時間8 24h ;雙氧水溶液的體積濃度為2% 30%，處理時間I 6h ;丙酮、異丙醇、こ醇均采用純試劑； 對于膜組織的疏松面，采用低滲溶液，或弱酸溶液、或弱堿溶液、或酶溶液、或是SDS、或Triton、或EDTA進行脫細胞去抗原處理；其中，低滲溶液為10 IOOmM的Tris緩沖液、或是濃度低于9g/l的鹽溶液，處理時間2 24h ;弱酸溶液為醋酸、或檸檬酸、或乳酸，濃度·0.I 0. 5M， 處理時間I 12h ;弱堿溶液為碳酸鈉、或碳酸氫鈉、或碳酸鉀、或碳酸氫鉀，質量濃度為0. 25 1%，處理時間I 12h ;酶溶液為活力≥25U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力≥5KU/mL的RNA酶溶液、或活力≥I. 5KU/mL的DNA酶溶液，處理時間8 24h ；SDS溶液的濃度為5g/L 20g/L，處理時間12 48h ；Triton溶液的濃度為lg/L 10g/L，處理時間·12 24h ；EDTA溶液的濃度為lg/L10g/L,處理時間0. 5 6h。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述對于致密面和疏松面處理為單次或是多次處理，允許多種試劑的聯合處理或交替處理。
7.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，在步驟三交聯固定的化學交聯和步驟四的脫細胞去抗原的過程中，輔以超聲或震蕩的處理；超聲頻率為20 IOOKHz，間隔I 2h處理一次，每次5 IOmin ;震蕩采用水浴或氣浴搖床，轉速80 200rpm，或間隔處理、或連續處理。
8.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，在步驟六的包裝前對產品疏松表面進行碾壓標記。
9.ー種實現權利要求I所述制備方法中對膜組織兩個表面分別處理的裝置，其特征在于，是由相同的兩個容器對扣組成，容器的口徑與膜組織的材料尺寸相匹配，兩個容器之間通過對扣固定膜組織材料，密封固定后使容器兩側的液體不會互通和滲漏；在兩個容器上分別設有進出液導管。
10.根據權利要求9所述的裝置，其特征在于，在兩個容器上分別設置進液導管和出液導管；進液導管和出液導管分別通過管路連接于循環泵。
全文摘要
一種硬腦/脊膜移植替代物的制備方法，本發明是將膜組織反復凍融、輾壓破裂細胞、交聯固定保護、脫細胞去抗原、致密面纖維化修飾及包裝滅菌后獲得；具有方法簡單、原料來源廣泛低廉、成本低的優點；所制備的膜替代物在保護膜組織天然結構和性能的同時徹底去除細胞成分和其他抗原成分，生物相容性好、無免疫排斥、安全可靠、力學性能好，易于臨床手術操作，能滿足缺損修復的需要，疏松面有利于組織液的吸附、活性因子的富集、血管和細胞的長入，有促進組織再生功能；并具有與宿主融合快、可降解吸收、修復效果好的優點；經動物試驗表明，使缺損得到完全修復，未見腦/脊液滲漏，未與腦組織發生粘連，未發現明顯的排斥反應。
文檔編號A61L27/36GK102727935SQ20121025113
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者黃文濤 申請人:陜西博鴻生物科技有限公司