專利名稱：：一種脊髓管膜、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫學、醫學生物材料學以及醫學組織工程學
技術領域：
，具體涉及一種脊髓管膜、其制備方法及應用。
背景技術：
：二十世紀末隨著整體醫學的高速發展，細胞生物學、分子生物學、遺傳基因學以及組織工程學也隨之不斷的進步與發展。具有良好性能的生物材料也同時在被迅速的發現與利用。近年來組織工程學在醫學臨床中的快速掘起就證明了這一點。使用I型膠原蛋白做為載體的組織工程產品獲得了顯著的發展與應用。如中國專利號為021212779，名稱為醫用膠原蛋白材料及其制造工藝的專利就公開了一種高純度的醫用膠原蛋白材料，該文獻在此全文引用作為參考。以牛肌腱組織為基料，經除雜，清洗，酸，堿，酶處理，硫酸軟骨劑交聯、冷凍干燥及環氧乙垸滅菌等工序制成的具有特定大小孔隙的片狀的醫用膠原蛋白材料，具有結構穩定、生物相容性好、可吸收的特點。目前，已在臨床上用于硬腦膜、硬脊膜的再生修復和防止粘連。脊髓在外傷以及髓內腫瘤侵及時，可形成不同程度的脊髓損傷，造成階段性脊髓功能障礙，嚴重的損害可導致脊髓斷裂甚至缺損，將徹底阻斷破壞脊髓神經中樞系統的功能，導致截癱的發生。由于神經膠質細胞和其它非神經系統組織的侵入生長，阻止受損脊髓神經組織的再生，同時導致未受損傷的正常脊髓組織的變性與退化從而使截癱難以得到修復。綜上所述，因此對于外傷性脊髓損傷而致的截癱病人，即使早期經手術治療，但效果往往不佳，截癱很難治愈。本發明的特點是在早期進行外科手術的時候，在損傷的脊髓段使用具有一定強度與三維結構的脊髓管膜在修整后的脊髓表面進行部分包裹，必要時可將自體骨髓干細胞移植于管膜的內表面，同時將具有特定功能的生物膜在生物管膜上再進行保護性的覆蓋，這樣不僅機械性的保護脊髓受損部位的組織不受外周其他組織的侵入干擾，同時還建立了受損脊髓部位的中樞神經組織的再生內通道，防止腦脊液和其內的生長因子過度丟失，保持受損脊髓內環境的相對穩定，為受損的脊髓中樞祌經組織的再生提供最佳環境。如何利用生物材料/細胞為基礎修復受損的脊髓神經組織是本發明要解決的課題。
發明內容本發明的一個目的是提供一種脊髓管膜，該脊髓管膜由復合膠原管膜和膠原膜組成，可以協以自體骨髓干細胞的脊髓組織修復材料，用于修復再生受損的脊髓中樞神經組織。本發明的第二個目的是提供上述脊髓管膜的制備方法。本發明的第三個目的是提供上述脊髓管膜的應用。本發明提供的一種脊髓管膜，包括復合膠原管膜和膠原膜，其中膠原膜覆蓋在復合膠原管膜外部，復合膠原管膜包括致密單一縱向孔隙的膠原外層和疏松的具有單一縱向孔隙的膠原內層，膠原膜是單一的有散狀排列(即分散排列)孔隙的片狀膠原膜。復合膠原管膜與膠原膜是各自獨立的，可復合或單獨使用。膠原實稱為膠原蛋白，有21種之多，每種膠原蛋白在人體的組織器官內有其特定的功能，由3條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀蛋白質。1型膠原蛋白占體內的總膠原量的90%，所以通常所指的膠原泛指I型膠原蛋白，在體內以膠原纖維形式存在。在高等動物機體中含量豐富，約占蛋白質總量的1/3。主要分布在結締組織中。是人體皮膚、血管、骨胳、筋腱、牙齒和神經組織內結締組織的主要基質。可以理解的是，I型膠原蛋白可從動物體內含量豐富的組織中用各種不同的方法提取，這是本領域的已知技術。本發明提供的一種脊髓管膜，由I型膠原蛋白制成，優選由高純度I型膠原蛋白制成，更優選由0.5-5%的純度為98%以上的I型膠原蛋白制作，更優選為0.5%的1型膠原蛋白，更優選為5%的I型膠原蛋白。本申請所述I型膠原蛋白可由商業渠道購得，也可以根據現有技術記載的技術手段制備獲得。本發明提供的一種脊髓管膜，為中空結構，兩端不封閉。脊髓管膜在長度上無限制，依據應用需要可制備成不同長度規格的產品，優選長度為0.1—50cm。脊髓管膜的橫切面為有缺口的圓環(亦稱為U形)，具體切口大小無特定要求，依據應用需要可制備成不同切口大小的產品，本發明保護范圍不受產品長度和橫切面形狀的限制。具體形狀可參見附圖l一5。脊髓管膜內徑為5-20毫米；其中復合膠原管膜厚度為0.1-5.0毫米，優選0.5-4.0毫米，更優選1.0-3.0毫米，更優選1.5-2.5毫米。復合膠原管膜的致密膠原外層厚度為0.75-1.75毫米，優選1-1.5毫米，最優選1,25毫米，膠原外層管壁孔隙大小為1-50阿，優選20-40nm，更優選25-35pm，更優選30pm。復合膠原管膜的疏松膠原內層厚度大，孔隙大且密度疏松，其中孔隙成軸向縱向排列，優選孔隙為狹長形結構。膠原內層膜壁厚度為1.5-3毫米，優選1.7-2.8毫米，更優選1.9-2.6毫米，更優選2.1-2.8毫米，更優選2.3-2.6毫米，最優選2.5毫米。膠原內層孔隙大小為100-300|am，優選120-28(Him，更優選140-260(xm，更優選160-240nm，更優選180-220nm，最優選200nm，易于神經細胞生長。在復合膠原管膜外部的膠原膜壁厚為0.1-3.0毫米，優選0.5-l毫米;并具有10-20(Hun，優選35-175nm，更優選60-150pm，更優選85-125pm大小的無特殊結構孔隙。該復合材料是由2-3次冷凍程序完成的，復合膠原管膜是由兩層相同材料組成的，但是孔隙的方向性和大小都是不同的。兩層膠原組織之外層的厚度薄，孔隙小而且致密，孔隙排列不規整。本發明提供的一種脊髓管膜，其能在6個月特定時間內降解。本發明提供的一種脊髓管膜，所述脊髓管膜是雙開口結構。本發明還提供一種脊髓管膜的制備方法，包括如下步驟將1型膠原蛋白制成0.5-10%濃度的膠原蛋白懸濁液(優選5%濃度)，注入到開放管型的模具內，經1-2毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-80到-100攝氏度以內，使其形成符合要求的復合膠原管膜的疏松膠原內層；將1型膠原蛋白制成0.5-10%濃度的膠原蛋白懸濁液(優選5%濃度)，注入到上述保留有疏松膠原的開放管型的模具內，經1-2毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-80至lj-100攝氏度，經二次冷凍，使其形成符合要求的復合膠原管膜的致密膠原外層將制備得到的疏松膠原內層和致密膠原外層經復合常規冷凍干燥，制成復合膠原管膜；將1型膠原蛋白制成0.5-10%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入常規冷凍干燥儀器內，常規冷凍，制成片狀膠原膜。上述冷凍環境優選為液態或氣態環境，更優選為液態環境。I型膠原蛋白可以以牛肌腱組織為基料，經選材、取材、酸、堿、酶處理制備得到，也可以以目前已知的任何技術制備得到。優選I型膠原蛋白濃度為0.5%-5%，純度為98%以上。上述開放管型的模具為本領域的常用器具，可通過商業購得。在本發明的一個方面，提供了一種脊髓管膜在制備脊髓組織修復材料中的用途。在本發明的一個方面，提供了一種脊髓管膜在制備修復再生受損的脊髓中樞神經組織的材料中的用途。在本發明的一個方面，提供了一種脊髓管膜在制備治療或預防因外傷和腫瘤造成階段性脊髓損傷或缺損的材料中的用途。在本發明的一個方面，提供了一種脊髓管膜在制備治療或預防脊髓神經障礙的材料中的用途。在本發明的一個方面，提供了一種脊髓管膜在制備治療或預防截癱的材料中的用途。在本發明的一個方面，提供了一種脊髓管膜在制備促進脊髓中樞神經組織再生的材料中的用途。本發明提供一種脊髓管膜，可以促進干細胞在提供的膠原組織上分化生長，轉移，千擾非神經元性膠質細胞的增生，減少斑痕的形成，提供良好的脊髓再生環境，再生修復受損的脊髓組織，有效的治療因外傷和腫瘤造成階段性脊髓損傷或缺損，治療不同程度的脊髓神經障礙而形成的截癱，使病人的癥狀得到不同程度的改善。圖1:(A)復合膠原管膜的橫切面。黑色部分代表致密排列不規則小孔隙的膠原外層結構；珠狀表示疏松縱向排列且孔隙較大的膠原內層。(B)覆蓋在復合膠原管膜外部的膠原膜。圖2:從在手術中病人的髂前上棘應用Jamshidi骨髓穿刺針采集20-60毫升的自體骨髓，經離心處理取得骨髓干細胞。圖3:將獲取的自體骨髓干細胞小心均勻的種植于脊髓管膜的內表面。圖4:骨髓干細胞經內置物滲透生長受損的脊髓內，同時促使受損脊髓再生。圖5:復合膠原管膜和膠原膜的復合實用示意圖。具體實施方式以下結合具體實例，對本發明作進一步說明。實施例l將1型膠原蛋白制成0.5%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到開放管型的模具內，經l毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-80攝氏度以內，使其形成符合要求的復合膠原管膜的疏松膠原內層；將I型膠原蛋白制成10%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到上述保留有疏松膠原的開放管型的模具內，經1毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-80攝氏度，經二次冷凍，使其形成符合要求的復合膠原管膜的致密膠原外層將制備得到的疏松膠原內層和致密膠原外層經復合常規冷凍干燥，制成復合膠原管膜；將1型膠原蛋白制成5%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入常規冷凍干燥儀器內，常規冷凍，制成片狀膠原膜。實施例2將I型膠原蛋白制成10%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到開放管型的模具內，經1毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-100攝氏度以內，使其形成符合要求的復合膠原管膜的疏松膠原內層；將I型膠原蛋白制成0.5%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到上述保留有疏松膠原的開放管型的模具內，經2毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-100攝氏度，經二次冷凍，使其形成符合要求的復合膠原管膜的致密膠原外層將制備得到的疏松膠原內層和致密膠原外層經復合常規冷凍干燥，制成復合膠原管膜；將1型膠原蛋白制成1%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入常規冷凍干燥儀器內，常規冷凍，制成片狀膠原膜。實施例3將1型膠原蛋白制成5%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到開放管型的模具內，經l毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-90攝氏度以內，使其形成符合要求的復合膠原管膜的疏松膠原內層。將I型膠原蛋白制成5%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到上述保留有疏松膠原的開放管型的模具內，經2毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-90攝氏度以內，經二次冷凍，使其形成符合要求的復合膠原管膜的致密膠原外層。將制備得到的疏松膠原內層和致密膠原外層經復合冷凍干燥，制成復合膠原管膜。將1型膠原蛋白制成0.5%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入常規冷凍干燥儀器內，常規冷凍，制成片狀膠原膜。實施例4取2060毫升自體的骨髓，經離心分離將分析出的骨髓前質細胞/骨髓干細胞種植于復合膠原管膜內層；用手術方法將攜帶干細胞的復合膠原管膜包裹在脊髓損傷部位的表面，復合膠原管膜的包裹范圍兩側要超過脊髓中線，再在植入的復合膠原管膜的上面再覆蓋一層三維孔隙結構的片狀膠原膜。復合膠原管膜內層的干細胞在膠原組織上生長分化成神經原性細胞并轉移到收損脊髓部位。其功效可干擾非神經元性的膠質細胞的增生，使神經元細胞得以借助提供的修復通道使其從近端順利地生長借以達到遠端，同時保障硬膜內的腦脊液和其內的生長因子減少流失，得以保留，穩定脊髓生長的內環境，從而促進損傷內新生組織的生長。同時又隔絕了受損脊髓與外界的接觸減少外周組織斑痕的形成，從而形成新的脊髓組織。細胞膠原脊髓組織的一期動物實驗-復合膠原管膜的單一應用的動物實驗自1998年起，在大白鼠的脊髓上進行脊髓缺損后的再生試驗。暴露大白鼠(SpragueDawleyorLewisRats)胸椎7，8，9，10的脊髓，然后在其中間部位截取5毫米的脊髓，造成脊髓的完全缺損，然后應用復合膠原管膜對缺損部位進行環狀包裹，具體為將復合膠原管膜在殘留的脊髓組織上下端完全包裹覆蓋受損的脊髓組織上，同時在已置入的復合膠原管膜上再覆蓋另一膠原膜，術后對大白鼠進行特殊護理，6-9周后對其進行處死。將胸椎7-10部位的組織取出，進行組織學的檢査和分析鑒定。對其內的再生的神經元組織進行定性和定量的分析，其結果表明其類管狀的內置物對受損的脊髓可以起到阻礙對脊髓再生不利因素介入的作用。防止外界非神經元性組織的長入，減少巨大囊性變的產生，減少斑痕組織的過渡生成，提供有條理的和神經組織同向生長的修復組織。細胞膠原脊髓組織的二期動物實驗-復合膠原管膜內層協以自體骨髓干細胞的"細胞膠原脊髓組織"復合物應用的動物實驗，在上述試驗的基礎上在脊髓缺損部為植入復合膠原管膜，其內協以106數目的自體骨髓干細胞/神經干細胞，將細胞種植后的復合膠原管膜再培養24小時后植入包裹受損脊髓組織部位，并將另一膠原膜覆蓋在復合膠原管膜的上方。結果表明其類管狀的內置物除具有上述一期動物實驗的功能外，自體骨髓干細胞在內環境相對穩定地條件下分化生長，分化后的細胞可轉移到脊髓的受損部位，提供有條理的，有功能的神經元組織在脊髓內同向生長，形成新生的脊髓神經組織。本發明提供一種高純度的單一成分的I型膠原蛋白的脊髓管膜，可以促進干細胞在提供的膠原組織上分化生長，轉移，干擾非神經元性膠質細胞的增生，減少斑痕的形成，提供良好的脊髓再生環境，再生修復受損的脊髓組織，有效的治療因外傷和腫瘤造成階段性脊髓損傷或缺損，治療不同程度的脊髓神經障礙而形成的截癱，使病人的癥狀得到不同程度的改善。實施例5研究有關醫學材料的生物學反應與功效的實驗多位體外和體內良種，其不同的動物實驗就是直接證實機體對各種生物材料，藥物，生物化學介子的反應。而組織病理學的檢測更是取得機體對上述物質反應的最直接的方法之一。再應用統計學的方法加以評價。實驗動物組取1~5毫升大白鼠自體的骨髓，經離心分離將分析出的骨髓前質細胞/骨髓干細胞種植于復合膠原管膜內層；用手術方法將攜帶干細胞的復合膠原管膜植入脊髓損傷部位的表面，復合膠原管膜的包裹范圍兩側要超過脊髓中線，再在植入的復合膠原管膜的上面再覆蓋一層三維孔隙結構的片狀膠原膜。對照組按照上述實驗方法進行操作，區別在于無內置物。術后6周的動物實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由此可見，實驗組相對于對照組具有顯著性差異，表明本發明的脊髓管膜對于修復受損的脊髓組織、修復再生受損的脊髓中樞神經組織、治療或預防因外傷和腫瘤造成階段性脊髓損傷或缺損、治療或預防脊髓神經障礙、治療或預防截癱以及促進脊髓中樞神經組織再生方面的有效性。權利要求1.一種脊髓管膜，其特征在于它包括復合膠原管膜和膠原膜，其中復合膠原管膜包括致密單一縱向孔隙的膠原外層和疏松單一縱向孔隙的膠原內層，膠原膜是有散狀排列孔隙的片狀膠原膜。2、如權利要求1所述的脊髓管膜，其特征在于它是由I型膠原蛋白制成。3、如權利要求1或2所述的脊髓管膜，其特征在于所述膠原膜覆蓋在復合膠原管膜外部。4、如權利要求1或2所述的脊髓管膜，其特征在于脊髓管膜內徑為5-20毫米；其中復合膠原管膜厚度為0.1-5.0毫米，膠原膜壁厚為0.1-3.0毫米。5、如權利要求l所述的脊髓管膜的制備方法，包括如下步驟將1型膠原蛋白制成0.5-10%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到開放管型的模具內，經1-2毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-80到-100攝氏度以內，使其形成符合要求的復合膠原管膜的疏松膠原內層；將I型膠原蛋白制成0.5-10%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入到上述保留有疏松膠原的開放管型的模具內，經1-2毫米/分的速度慢速垂直冷凍于-80到-100攝氏度，經二次冷凍，使其形成符合要求的復合膠原管膜的致密膠原外層；將制備得到的疏松膠原內層和致密膠原外層經復合常規冷凍干燥，制成復合膠原管膜；將1型膠原蛋白制成0.5-10%濃度的膠原蛋白懸濁液，注入常規冷凍干燥儀器內，常規冷凍，制成片狀膠原膜。6、如權利要求l一4任一項所述的脊髓管膜在制備脊髓組織修復材料中的用途。7、如權利要求l一4任一項所述的脊髓管膜在制備修復再生受損的脊髓中樞神經組織的材料中的用途。8、如權利要求l一4任一項所述的脊髓管膜在制備治療或預防因外傷和腫瘤造成階段性脊髓損傷或缺損的材料中的用途。9、如權利要求l一4任一項所述的脊髓管膜在制備治療或預防脊髓神經障礙的材料中的用途。10、如權利要求1一4任一項所述的脊髓管膜在制備治療或預防截癱的材料中的用途。11、如權利要求l一4任一項所述的脊髓管膜在制備促進脊髓中樞神經組織再生的材料中的用途。全文摘要本發明公開了一種脊髓管膜、其制備方法及應用，所述脊髓管膜由復合膠原管膜和膠原膜組成，它由I型膠原蛋白制備，可用于保護脊髓受損部位，使受損的脊髓中樞神經組織再生，促進復合膠原管膜內形成新的脊髓組織。文檔編號A61L27/56GK101264350SQ200810097809公開日2008年9月17日申請日期2008年5月15日優先權日2008年5月15日發明者許和平申請人:許和平