專(zhuān)利名稱(chēng)：一種促進(jìn)成骨和血管化的生物活性因子組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)成骨和成血管的生物活性因子組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨組織的生長(zhǎng)過(guò)程與血管化緊密相連。充分的血供是保證骨組織工程材料體內(nèi)活化的決定性因素。在骨組織的胚胎發(fā)生或骨損傷愈合的過(guò)程中，優(yōu)良的血管網(wǎng)絡(luò)能夠?yàn)榻M織提供良好的營(yíng)養(yǎng)供給和物質(zhì)運(yùn)輸，缺乏良好的血供將導(dǎo)致骨生長(zhǎng)異常和骨愈合不良。臨床植骨修復(fù)缺損時(shí)，要求植骨床具有豐富的血供，而自體骨移植時(shí)，也常通過(guò)帶血管蒂或帶肌瓣來(lái)增強(qiáng)血供，促進(jìn)移植骨早期成活。因此，一個(gè)較為完善的血管網(wǎng)對(duì)于骨形成是 非常必要的，它不僅能提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，還能輸送成骨前體細(xì)胞，分泌成骨細(xì)胞所需的生長(zhǎng)因子。骨組織工程采用三維支架與種子細(xì)胞復(fù)合的策略，雖然大大促進(jìn)了骨組織損傷的修復(fù)，但其三維構(gòu)建時(shí)僅靠外周滲透作用吸收營(yíng)養(yǎng)，對(duì)于小尺寸的骨修復(fù)，早期依靠組織液的滲透可獲得營(yíng)養(yǎng)；對(duì)于大尺寸骨修復(fù)，僅靠組織液的滲透遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，細(xì)胞多因營(yíng)養(yǎng)缺乏而導(dǎo)致移植失敗，因此目前大尺寸骨組織缺損修復(fù)面臨著血管化不足，組織易缺血壞死的難題。如何在新骨形成的同時(shí)，促進(jìn)小血管的長(zhǎng)入以及細(xì)胞與材料復(fù)合物內(nèi)血供的重建成為骨修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前有關(guān)人工骨中血供重建的研究主要集中在以下方面利用顯微外科技術(shù)包裹血管束、血管蒂或筋膜瓣植入形成內(nèi)在的血管網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)血管形成；以及血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)支架后植入體內(nèi)。楊新明等提出以帶蒂筋膜瓣包裹復(fù)合自體紅骨髓方法構(gòu)造非細(xì)胞型組織工程化骨，可一期修復(fù)大段骨缺損(中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009, 13,46:9050);裴國(guó)獻(xiàn)等利用帶蒂筋膜瓣包裹組織工程骨的方法修復(fù)兔橈骨大段骨缺損，發(fā)現(xiàn)早期的血管化有利于骨修復(fù)速度(中國(guó)實(shí)驗(yàn)外科雜志，2007，24 (6):752)。這種帶血管植入的方法借用體內(nèi)已經(jīng)存在的血管條件來(lái)促進(jìn)人工骨的血管化，手術(shù)效果明確，但存在增加機(jī)體額外創(chuàng)傷、受局部血管條件限制等缺點(diǎn)。將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分別定向分化為成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞使二者相互促進(jìn)發(fā)揮作用是血管化研究的一個(gè)方向。Kaigler等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共移植較單獨(dú)移植更有利于成骨(KaiglerD，eral, FASEB J,2005, 19 (6) :665);譚洪波等將兔骨髓誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞用纖維蛋白膠接種到脫鈣骨基質(zhì)支架上，證實(shí)骨髓誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞在脫鈣骨支架內(nèi)可以在體外培養(yǎng)成官腔樣內(nèi)皮樣結(jié)構(gòu)(譚洪波等，骨組織工程支架體外血管化初步研究，重慶醫(yī)學(xué)，2007，36 (6)499 )。但是細(xì)胞策略前期細(xì)胞培養(yǎng)的周期長(zhǎng)，不利于實(shí)際臨床應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域尚需研制一種新型的可同時(shí)促進(jìn)成骨和血管化的重建材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種可同時(shí)促進(jìn)成骨和血管化的生物活性因子組合物及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的第一方面，提供一種生物活性因子組合物，所述組合物包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)中的一種或兩種以上；所述磺化多糖選自磺化殼聚糖、 磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纖維素中的一種或兩種以上。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子為BMP-2、或BMP-7 ;或者所述生物活性因子為選自下組的因子與BMP-2或BMP-7的復(fù)合物轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)或其組合。在另一優(yōu)選例中，磺化多糖的分子量在8000-350000Da，硫含量為O. 5%_20%。在另一優(yōu)選例中，所述磺化多糖的分子量在10000-300000Da，硫含量為1%_20%。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例為O. 05 120: I。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例為O. f 100:1。在另一優(yōu)選例中，，所述生物活性因子組合物還包含水。本發(fā)明的第二方面，提供第一方面所述的生物活性因子組合物的制備方法，所述方法包括將生物活性因子加入到磺化多糖水溶液中，混合均勻得到所述生物活性因子組合物的步驟。在另一優(yōu)選例中，所述磺化多糖水溶液濃度為O. Of 150 μ g/mL。在另一優(yōu)選例中，所述磺化多糖水溶液濃度為O. 02^100 μ g/mL。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括將生物活性因子組合物進(jìn)行冷凍干燥的步驟。本發(fā)明的第三方面，提供一種可成骨植入體，所述植入體包含第一方面所述的生物活性因子組合物以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的第四方面，提供第一方面所述的生物活性因子組合物的用途，用于制備修復(fù)骨缺損、治療骨折、或修復(fù)軟骨的藥物或植入體。本發(fā)明提供了一種由生長(zhǎng)因子和磺化多糖組成的生物活性因子組合物，可同時(shí)促進(jìn)成骨和促進(jìn)血管化，且材料易得，成本低，應(yīng)用方便。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I為實(shí)施例8中肌袋內(nèi)成骨的HE染色切片圖。圖2為實(shí)施例8肌袋內(nèi)成骨的照片。圖3為實(shí)施例9中肌袋內(nèi)成骨的HE染色切片圖。圖4為實(shí)施例9肌袋內(nèi)成骨的照片。圖5為實(shí)施例10中肌袋內(nèi)成骨的HE染色切片圖。圖6為實(shí)施例10肌袋內(nèi)成骨的照片。圖7為實(shí)施例11中肌袋內(nèi)成骨的HE染色切片圖。圖8為實(shí)施例11肌袋內(nèi)成骨的照片。
圖9為實(shí)施例12中肌袋內(nèi)成骨的HE染色切片圖。圖10為實(shí)施例12肌袋內(nèi)成骨的照片。圖11為實(shí)施例13中肌袋內(nèi)成骨的HE染色切片圖。圖12為實(shí)施例13肌袋內(nèi)成骨的照片。圖13為實(shí)施例14中肌袋內(nèi)成骨的HE染色切片圖。圖14為實(shí)施例14肌袋內(nèi) 成骨的照片。圖15為對(duì)比例I中肌袋內(nèi)移植區(qū)組織HE染色切片圖。圖16為對(duì)比例2肌袋內(nèi)成骨的照片。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，意外發(fā)現(xiàn)包含生物活性因子和磺化多糖的生物活性因子組合物在促進(jìn)成骨的同時(shí)能夠促進(jìn)血管生成。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。生物活性因子所謂生物活性因子，是指來(lái)自生物體內(nèi)的對(duì)生命現(xiàn)象具有影響的微量或少量物質(zhì)，主要是生物活性多肽和細(xì)胞因子兩大類(lèi)。生物活性肽(biologicalactivepeptides, bap)指的是一類(lèi)分子量小于6000d,具有多種生物學(xué)功能的多肽。其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不一，可從簡(jiǎn)單的二肽到環(huán)形大分子多肽，而且這些多肽可通過(guò)磷酸化、糖基化或酰基化而被修飾。細(xì)胞因子(cytokine,簡(jiǎn)稱(chēng)ck)是指由活化免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞(包括骨髓、胸腺中的基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)合成分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)等多種生物學(xué)效應(yīng)的小分子多肽，它們與免疫球蛋白和補(bǔ)體一樣屬于分泌型免疫分子。生長(zhǎng)因子屬于細(xì)胞因子，是一類(lèi)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的細(xì)胞外多肽信號(hào)分子。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)是一種能夠通過(guò)誘導(dǎo)成骨修復(fù)骨缺損的生物材料，是一類(lèi)生長(zhǎng)分化因子家族，包括ΒΜΡ-1、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-7等，作用具有濃度依賴(lài)性，與相應(yīng)感受器結(jié)合會(huì)產(chǎn)生一系列骨形態(tài)發(fā)生蛋白反應(yīng)基因的信號(hào)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分化為骨或軟骨。在近20年中，人們不僅從多種動(dòng)物骨組織中分離和純化出天然的BMP-1、BMP-2、BMP-3和BMP-4，而且還通過(guò)基因重組技術(shù)進(jìn)一步在中國(guó)倉(cāng)鼠的卵母細(xì)胞和大腸桿菌中表達(dá)出了人類(lèi)基因重組的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rh BMPs)。目前已有超過(guò)15種骨形態(tài)發(fā)生蛋白被克隆并在人和鼠體內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)是可作用于細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化等的生長(zhǎng)因子。包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a (TGF-α )和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β )兩類(lèi)。TGF-a是由巨噬細(xì)胞，腦細(xì)胞和表皮細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)上皮發(fā)育。TGF-β是一多功能蛋白質(zhì)，可以影響多種細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化、細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等功能。TGF-β可以結(jié)合到細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合而激活其受體。TGF-β受體是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。其信號(hào)傳遞可以通過(guò)SMAD信號(hào)通路和/或DAXX信號(hào)通路。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)屬血小板源性生長(zhǎng)因子家族的生長(zhǎng)因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管的發(fā)生，提高單層內(nèi)皮的通透性，能與胎盤(pán)生長(zhǎng)因子形成異二聚體。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。喊性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一個(gè)傳遞發(fā)育信號(hào)，能促進(jìn)中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞分裂的多肽。具有強(qiáng)烈的血管生成作用。在體夕卜，能刺激細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)纖溶酶原激活物及膠原酶活性，是與肝素有高親和力的細(xì)胞促分裂原。成骨蛋白(osteogenin protein, 0GP)是誘導(dǎo)骨形成的蛋白質(zhì)(小于50kDa),與細(xì)胞外基質(zhì)和肝素結(jié)合，是多功能細(xì)胞因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族。磺化多糖多糖(polysaccharide)是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過(guò)10個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。包括殼聚糖、淀粉、氨基聚糖、和纖維素等。磺化多糖是多糖經(jīng)磺化反應(yīng)得到的產(chǎn)物。磺化是一種向有機(jī)分子中引入磺酸基(一SO3H)或磺酰氯基(一SO3Cl)的反應(yīng)過(guò)程。所用磺化劑通常有三氧化硫，濃硫酸，發(fā)煙硫酸等。有時(shí)也用氯磺酸、二氧化硫加氯氣、二氧化硫加氧以及亞硫酸鈉等作為磺化劑。磺化方法有液相磺化法和氣相磺化法。磺化過(guò) 程中磺酸基取代碳原子上的氫稱(chēng)為直接磺化；磺酸基取代碳原子上的鹵素或硝基，稱(chēng)為間接磺化。本發(fā)明中的磺化多糖選自磺化殼聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纖維素中的一種或兩種以上。采用本領(lǐng)域已知的方法以殼聚糖、葡聚糖等為原料，經(jīng)磺化后制得。如參考氯磺酸磺化法或濃硫酸磺化法制備磺化殼聚糖和磺化葡聚糖(吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007, 24(2) :20.西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27 (1):95)。磺化多糖的硫含量通過(guò)元素分析儀測(cè)定(Elementar,德國(guó)Vario Macro公司)。生物活性因子組合物及其制備本發(fā)明的生物活性因子組合物，包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)中的一種或兩種以上；所述磺化多糖選自磺化殼聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纖維素中的一種或兩種以上。所述生物活性因子的來(lái)源可以是人基因重組，經(jīng)發(fā)酵、分離得到，也可以直接從動(dòng)物體內(nèi)提取得到。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子為BMP-2。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子為BMP-7。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子為BMP-2與選自下組的因子的復(fù)合物轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子為BMP-7與選自下組的因子的復(fù)合物轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、成骨蛋白(OGP)或其組合。磺化多糖的分子量在8000-350000Da，硫含量為0. 5%_20%。在另一優(yōu)選例中，所述磺化多糖的分子量在10000-300000Da，硫含量為1%_20%。所述生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例為0. 05 120: I。
在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例為O. f 100:1。所述生物活性因子組合物可以為凍干制劑，以固體形式存在；或者溶于水中，以溶液形式存在。所述的生物活性因子組合物的制備方法，包括將生物活性因子加入到磺化多糖水溶液中，混合均勻得到所述生物活性因子組合物的步驟。在另一優(yōu)選例中，所述磺化多糖水溶液濃度為O. Of 150 μ g/mL，較佳地，所述磺化多糖水溶液濃度為O. 02^100 μ g/mL。在另一優(yōu)選例中，所述生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例為O. 05 120:1，較佳地，所述生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例為O. f 100:1。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括將生物活性因子組合物進(jìn)行冷凍干燥的步驟。
冷凍干燥又稱(chēng)升華干燥。將含水物料冷凍到冰點(diǎn)以下，使水轉(zhuǎn)變?yōu)楸缓笤谳^高真空下將冰轉(zhuǎn)變?yōu)檎魵舛サ母稍锓椒ǎ潜绢I(lǐng)域慣常使用的制備凍干制劑的方法。本發(fā)明中沒(méi)有特別的限制，可以采用常規(guī)的操作條件進(jìn)行凍干，如將溶液在_20°C冷凍，水轉(zhuǎn)變?yōu)楸笾糜诶鋬龈稍餀C(jī)中干燥得到凍干制劑。可成骨植入體在本發(fā)明中，可成骨植入體是指包含上述生物活性因子組合物和醫(yī)學(xué)上可接受的載體的移植物，用于修復(fù)骨缺損、治療骨折、或修復(fù)軟骨。本發(fā)明的生物活性因子組合物，包含生物活性因子和磺化多糖，與單純使用生物活性因子相比，具有增效協(xié)同作用，即促進(jìn)成骨的同時(shí)，促進(jìn)血管的生成。由于促進(jìn)血管生成作用顯著，血管的生成同時(shí)也促進(jìn)骨的生成。可用于本發(fā)明的可成骨植入體的醫(yī)學(xué)上可接受的載體是醫(yī)學(xué)上可接受的生物材料，包括(但不限于)(I)無(wú)機(jī)材料，例如羥基磷灰石、磷酸三鈣、磷酸鈣骨水泥、生物玻璃、硅酸鈣、硫酸 丐等;(2)合成高分子，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐、聚乙二醇、聚己內(nèi)酯等；(3)天然高分子,例如膠原、明膠、糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸、葡聚糖等；(4)上述材料的混合物或復(fù)合材料。將本發(fā)明生物活性因子組合物置于醫(yī)學(xué)上可接受的載體上構(gòu)成可成骨植入體，將可成骨植入體植入到體內(nèi)，生物活性因子和磺化多糖協(xié)同作用，促進(jìn)成骨和血管生成。醫(yī)學(xué)上可接受的載體可以是可降解的生物相容性材料，在體內(nèi)逐漸降解，同時(shí)釋放出生長(zhǎng)因子組合物，促進(jìn)新骨的形成。隨著材料的逐步降解，新生骨漸漸取代原有材料從而加速材料的體內(nèi)降解過(guò)程。當(dāng)本發(fā)明的醫(yī)學(xué)上可接受的載體為可注射性材料(如可注射骨水泥)時(shí)，將該液體材料與本發(fā)明的生物活性因子組合物混合，注射到骨損傷部位，進(jìn)行原位成骨。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何被提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(I)本發(fā)明提供了一種由生長(zhǎng)因子和磺化多糖組成的生物活性因子組合物，其作用是可同時(shí)促進(jìn)成骨和促進(jìn)血管化，避開(kāi)了使用多因子所帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)以及使用帶血管植入所產(chǎn)生的創(chuàng)傷。(2)本發(fā)明材料易得，制備條件溫和，所制備的生物活性因子組合物可以方便地加入到醫(yī)學(xué)上可接受的載體中一同使用，并可采用植入或注射方法置入體內(nèi)，應(yīng)用方便。(3)本發(fā)明適用范圍廣，能適應(yīng)不同形狀的缺損修復(fù)和重建。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。 除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I將分子量為10萬(wàn)，硫含量為8%的磺化殼聚糖溶解于去離子水中，配制成IOyg/HiL磺化殼聚糖水溶液。按生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例1:1加入人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)，混合均勻，即得到生物活性因子組合物。實(shí)施例2將分子量為30萬(wàn)，硫含量為5%的磺化殼聚糖溶解于去離子水中，配制成50μ g/mL磺化殼聚糖水溶液。按生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例2:1加入人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)，混合均勻，即得到生物活性因子組合物。實(shí)施例3將分子量為20萬(wàn)，硫含量為15%的磺化葡聚糖溶解于去離子水中，配制成
O.02 μ g/mL磺化殼聚糖水溶液。按生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例1:10加入人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)，混合均勻，即得到生物活性因子組合物。實(shí)施例4將分子量為I萬(wàn)，硫含量為12%的硫酸化肝素溶解于去離子水中，配制成100 μ g/mL磺化殼聚糖水溶液。按生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例100:1加入質(zhì)量均等的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，混合均勻，即得到生物活性因子組合物。實(shí)施例5將分子量為12萬(wàn)，硫含量為1%的磺化殼聚糖溶解于去離子水中，配制成20 μ g/mL磺化殼聚糖水溶液。按生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例I:I加入質(zhì)量均等的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，混合均勻，即得到生物活性因子組合物。實(shí)施例6將分子量為10萬(wàn)，硫含量為10%的磺化葡聚糖溶解于去離子水中，配制成50μ g/mL磺化殼聚糖水溶液。按生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例1:2加入質(zhì)量均等的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)和成骨蛋白(OGP)，混合均勻，即得到生物活性因子組合物。實(shí)施例7
將分子量為10萬(wàn)，硫含量為11%的硫酸纖維素溶解于去離子水中，配制成150 μ g/mL硫酸纖維素水溶液。按生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例50:1加入質(zhì)量均等的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，混合均勻，即得到生物活性因子組合物。實(shí)施例8將含10 μ g生長(zhǎng)因子BMP-2的生物活性因子組合物(實(shí)施例I)滴加到可吸收明膠海綿上，凍干，封裝，于-20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物植入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖1)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組 織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖2)，新骨的平均鮮重為160mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為lOOmg，證實(shí)生物活性因子組合物具有很好的誘導(dǎo)成骨活性，并且有利于成骨過(guò)程的血管化。實(shí)施例9將含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物(實(shí)施例2)滴加到磷酸鈣支架上，凍干，封裝，于_20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物植入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖3)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖4)，新骨的平均鮮重為150mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為95mg，證實(shí)所制備的生物活性因子組合物具有很好的誘導(dǎo)成骨活性，并且有利于成骨過(guò)程的血管化。實(shí)施例10將含IOyg生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物(實(shí)施例3)滴加到可注射殼聚糖凝膠中，凍干，封裝，于-20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物注入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖5)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖6)，新骨的平均鮮重為162mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為150mg，制備的生物活性因子組合物具有很好的誘導(dǎo)成骨活性，并且有利于成骨過(guò)程的血管化。實(shí)施例11將含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物(實(shí)施例4)滴加到可吸收明膠海綿上，凍干，封裝，于_20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物植入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖7)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解 剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖8)，新骨的平均鮮重為130mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為90mg，制備的生物活性因子組合物具有很好的誘導(dǎo)成骨活性，并且有利于成骨過(guò)程的血管化。實(shí)施例12將含IOyg生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物(實(shí)施例5)滴加到磷酸鈣支架中，凍干，封裝，于-20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物植入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖9)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖10)，新骨的平均鮮重為123mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為85mg，制備的生物活性因子組合物具有很好的誘導(dǎo)成骨活性，并且有利于成骨過(guò)程的血管化。實(shí)施例13將含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物(實(shí)施例6)滴加到硅基干凝膠中，凍干，封裝，于_20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物植入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖11)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖12)，新骨的平均鮮重為142mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為llOmg，制備的生物活性因子組合物具有很好的誘導(dǎo)成骨活性，并且有利于成骨過(guò)程的血管化。實(shí)施例14將含IOyg生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物(實(shí)施例7)滴加到可注射殼聚糖凝膠中，凍干，封裝，于-20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 μ g生長(zhǎng)因子的生物活性因子組合物注入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖13)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖14)，新骨的平均鮮重為127mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為108mg，制備的生物活性因子組合物具有很好的誘導(dǎo)成骨活性，并且有利于成骨過(guò)程的血管化。對(duì)比例I
將磺化殼聚糖水溶液滴加到可吸收明膠海綿中，凍干，封裝，得到含10μ g磺化殼聚糖的移植物，于_20°C儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10 yg磺化殼聚糖的移植物植入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察(見(jiàn)圖15)，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中未見(jiàn)異物及炎癥反應(yīng)，同時(shí)未見(jiàn)骨組織、骨小梁及骨髓。其余小鼠解剖其右腿取出移植部位，均未見(jiàn)骨組織形成。單純的磺化多糖不能誘導(dǎo)新骨生成。對(duì)比例2將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)水溶液滴加到可吸收明膠海綿中，凍干，封裝，得到含 ο μ g骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的移植物于-20°c儲(chǔ)存待用。將生長(zhǎng)2周的昆明種小鼠按體重的3%進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，將右大腿后外側(cè)剃毛消毒。將如上制備的含10μ g骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的移植物植入右大腿肌袋中。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中，進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。于手術(shù)后4周處死小鼠，其中I只小鼠迅速取出植入材料及其周?chē)浗M織浸入10%的福爾馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進(jìn)行組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)橫紋肌組織中可見(jiàn)骨組織，包括骨小梁及骨髓。骨組織周?chē)闯霈F(xiàn)比較粗壯的毛細(xì)血管。其余小鼠解剖其右腿取出新長(zhǎng)的骨頭(見(jiàn)圖16)，新骨的平均鮮重為105mg ;把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻后，取出稱(chēng)其灰分平均重量為60mg，結(jié)果表明，單一的生長(zhǎng)因子無(wú)法同時(shí)兼顧成骨和成血管功能，新生組織中沒(méi)有較好的血管生成。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種生物活性因子組合物，其特征在于，所述組合物包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成骨蛋白中的一種或兩種以上；所述磺化多糖選自磺化殼聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纖維素中的一種或兩種以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物活性因子組合物，其特征在于，所述生物活性因子為BMP-2、或 BMP-7 ;或者 所述生物活性因子為選自下組的因子與BMP-2或BMP-7的復(fù)合物轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成骨蛋白或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物活性因子組合物，其特征在于，磺化多糖的分子量在8000-350000Da，硫含量為 O. 5%_20%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物活性因子組合物，其特征在于，所述生物活性因子與磺化多糖的質(zhì)量比例為O. 05 120:1。·
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物活性因子組合物，其特征在于，所述生物活性因子組合物還包含水。
6.根據(jù)權(quán)利要求f5任一項(xiàng)所述的生物活性因子組合物的制備方法，其特征在于，所述方法包括將生物活性因子加入到磺化多糖水溶液中，混合均勻得到所述生物活性因子組合物的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述磺化多糖水溶液濃度為O.Of 150μ g/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述方法還包括將生物活性因子組合物進(jìn)行冷凍干燥的步驟。
9.一種可成骨植入體，其特征在于，所述植入體包含權(quán)利要求I所述的生物活性因子組合物以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
10.如權(quán)利要求I所述的生物活性因子組合物的用途，其特征在于，用于制備修復(fù)骨缺損、治療骨折、或修復(fù)軟骨的藥物或植入體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)成骨和血管化的生物活性因子組合物，包含生物活性因子和磺化多糖，所述生物活性因子選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成骨蛋白中的一種或兩種以上；所述磺化多糖選自磺化殼聚糖、磺化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸纖維素中的一種或兩種以上。本發(fā)明還公開(kāi)了該組合物的制備方法以及含有該組合物的移植物。本發(fā)明的組合物，促進(jìn)成骨的同時(shí)還能促進(jìn)血管生成，與醫(yī)學(xué)上可接受的載體復(fù)合，采用植入或注射等方式應(yīng)用于骨缺損修復(fù)等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K31/727GK102895704SQ20121025820
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者劉昌勝, 曹玲燕, 王靖 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)