專利名稱：一種治療視網膜新生血管性疾病的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于眼底疾病的生物防治技術領域，具體涉及一種治療視網膜新生血管性疾病的藥物，即甲磺酸萘莫司他(Nafamostat mesylate, FUT-175)的新的用途，以及以甲磺酸萘莫司他為主要原料制備的，用于治療視網膜新生血管性疾病的藥物。
背景技術：
視網膜新生血管性疾病是我國乃至世界范圍最嚴重致盲性眼病之一，主要是指由于新生血管生長伴隨出血、滲出、增生等病理性改變造成的致盲性玻璃體視網膜疾病。包括糖尿病性視網膜病變、視網膜血管阻塞性疾病、視網膜靜脈周圍炎、早產兒視網膜病變等，對我國人群視力健康的威脅日益凸顯。一直以來，關于視網膜新生血管發(fā)生的機制眾說紛紜，例如血管活性因子及內源性血管生成抑制劑在視網膜新生血管(retinalneovascularization, RNV)中的作用，它們在眼內不是單一、獨立地起作用，而是多種因子相互協調，共同調控血管生成。此外，免疫學途徑近年來逐漸引起科學家重視。其中，炎癥及補體途徑的參與已在部分視網膜新生血管性疾病中得到證實，但至于具體過程及涉及的補體成分均尚無定論。為此，開展視網膜新生血管性疾病相關免疫學機理的研究，以期尋找可以更早、更有效阻斷RNV進程的作用靶點，具有重要的臨床意義。甲橫酸萘莫司他(Nafamostat mesylate, FUT-175)是由日本Torii公司原研，1986年上市的合成蛋白酶抑制劑，此藥物主要用于急性胰腺炎、慢性胰腺炎急性惡化，胰管造影后的急性胰腺炎、外傷性胰腺炎、手術后急性胰腺炎等癥狀的改善。但申請人在長期的研究中發(fā)現，甲磺酸萘莫司他可以有效的抑制視網膜新生血管的生長，從而促成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種治療視網膜新生血管性疾病的藥物，即可以更早、更有效阻斷RNV生長的作用靶點，為視網膜新生血管性疾病的臨床治療提供新的思路，以彌補現有治療方式的不足。本發(fā)明一個方面涉及甲磺酸萘莫司他的新用途，即甲磺酸萘莫司他在制備治療視網膜新生血管性疾病的藥物中的應用。本發(fā)明另一方面提供一種治療視網膜新生血管性疾病的藥物，包括有甲磺酸萘莫司他和補體系統內毒素分子C3a和/或C5a的抗體。上述的藥品中，甲磺酸萘莫司的含量約為I 3%，而抗體的添加量為0.002
0.005%。本發(fā)明的藥劑中還添加0. 5 I. 5%苯乙醇作為防腐劑。本發(fā)明使用甲磺酸萘莫司他，作用于補體途徑，來制備治療視網膜新生血管性疾病的藥物，同時添加有C3a和C5a多肽的抗體，產生中和作用，更加有效的控制視網膜新生血管的生長，此合成劑將成為視網膜新生血管治療的新型藥物，為臨床多種視網膜新生血管性疾病的治療提供新思路。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。一、甲磺酸萘莫司他治療視網膜新生血管性疾病的新用途甲磺酸萘莫司他藥物購買于Sigma-Aldrich公司，小鼠腹腔注射用量為50mg/kg,利用C57BL/6J小鼠(購于Jackson Laboratory)建立氧誘導視網膜病變模型0IR，將7日(P7 )齡清潔級小鼠置于體積分數為75%的高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5d后回到空氣中繼續(xù)飼養(yǎng)，自12天(P12)開始，每天小鼠腹腔注射甲磺酸萘莫司他藥物，在視網膜新生血管生長最為旺盛的17 天(P17),通過頸靜脈灌 5 ii lFITC-conjugated isolectin_B4 (20mg/ml)。實驗結束后取材，隨后進行視網膜鋪片，觀察視網膜新生血管生長情況。通過熒光顯微鏡觀察表明，甲磺酸萘莫司他能夠明顯抑制RNV的生長，實驗小鼠眼底血管生長趨于正常。然而,利用補體系統內毒素分子C3a和C5a的受體C3aR和C5aR敲除鼠(CSaRvIEICSaR+小鼠)進行同樣處理，注射甲磺酸萘莫司他后視網膜新生血管的生長變化并不明 顯。此外，通過視網膜鋪片，熒光造影觀察，血管內皮核數的統計，比較C57BL/6J小鼠及C3aRv^和CSaR+小鼠，具體操作如下(I)視網膜鋪片利用C57BL/6J小鼠及CSaR+和CSaR+小鼠建立氧誘導視網膜病變模型0IR，具體方法同上所述。根據熒光顯微鏡觀察結果，C3a及C5aR的敲除抑制了 RNV的生長。根據RNV的評分標準，敲除鼠的RNV生長、血管簇的形成、血管迂曲程度較C57BL/6J小鼠明顯降低，而其中央無灌注區(qū)顯著大于正常組小鼠。(2)熒光造影術熒光素眼底血管制影是20世紀60年代興起的眼科檢查手藝。利用熒光素鈉做為制影劑疇前臂靜脈快速注入，當熒光素鈉隨血流進入眼底血管時，通過拆無一組濾色片的眼底攝影機，持續(xù)拍攝眼底血管外染料輪回時接收激發(fā)光線發(fā)射出的熒光形態(tài)，以察看視網膜動態(tài)輪回的過程，從而得以體會眼底血管的微細結構和微輪回的變化，為良多眼底病的發(fā)病機理、診斷、醫(yī)亂和預后評估供給按照。利用此手段，對小鼠腹腔灌注0. Imll0%熒光素鈉，隨后用眼底造影機進行實時觀察，并進行記錄。結果說明CSaR+和CSaR+小鼠的中央無灌注區(qū)明顯大于C57BL/6J小鼠。(3)血管內皮核數計數建立OIR模型，分別取C57BL/6J小鼠及C3aR和C5aR敲除鼠眼睛，并進行病理組織學分析，方法如下 固定(10%福爾馬林，Bouin氏固定液等)使組織、細胞的蛋白質變性凝固，以防止細胞死后的自溶或細菌的分解，從而保持細胞本來的形態(tài)結構。隨后進行 脫水透明一般用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，才能浸蠟包埋。 浸蠟包埋將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋先制備好容器(如折疊一小紙盒)，倒入已溶化的石蠟，迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中。冷卻凝固成塊即成。包埋好的組織塊變硬，才能在切片機上切成很薄的切片。 切片與貼片將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般為4微米厚。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45°C恒溫箱中烘干。
脫蠟染色(HE染色)染色前，須用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，就可染色。具體過程如下①將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數分鐘。②酸水及氨水中分色，各數秒鐘。③流水沖洗I小時后入蒸餾水片刻。④入70%和90%酒精中脫水各10分鐘。⑤入酒精伊紅染色液染色2 — 3分鐘。 脫水透明染色后的切片經純酒精脫水，再經二甲苯使切片透明。 封固將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干后，貼上標箋，切片標本就可使用。通過連續(xù)切片，染色觀察，統計血管內皮核數，結果表明C3aR+和CSaR+小鼠的突破內界膜的血管內皮核數明顯低于C57BL/6J小鼠表明補體系統中的內毒素分子C3a和C5a可明顯促進視網膜新生血管的生長。建立OIR模型，分別取C57BL/6J小鼠及C3aR和C5aR敲除鼠(PBS對照組及FUT-175處理組)視網膜,提取總蛋白進行western blot分析,具體操作步驟如下 總蛋白的提取加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，充分剪碎研勻，冰上放置，充分提取，離心，取上清。
SDS-PAGE凝膠電泳清洗玻璃板組裝電泳槽，灌膠與上樣，電泳(一般為恒壓120V電泳，當樣品進入下層膠后恒壓160V電泳直至溴酚藍達到凝膠底部為止)。 轉膜切膠，備膜,裝膜,轉膜 免疫反應,具體操作過程如下①封閉將膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后將硝酸纖維素膜放入加有BSA封閉液的平皿中，室溫下搖床2h，或者4°C冰箱過夜。②加一抗將封閉后的硝酸纖維素膜放入含有TBST的洗缸中搖床上漂洗3次，每次5min。洗完后將TBST盡可能浙干(但膜一定要保持濕潤)，放入加有一抗的平皿中側擺搖床室溫低速孵育2h。③加二抗回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫搖床漂洗3次，每次5min,然后將漂洗過的硝酸纖維素膜放入加有二抗的平皿中，避光室溫孵育lh。孵育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中洗3次每次5min。 化學發(fā)光,顯影,定影 凝膠圖像分析將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。通過分析凝膠圖像，顯示FUT-175可調節(jié)VEGF-A的蛋白表達，在敲除鼠中并無檢測到VEGF-A的表達變化，初步說明FUT-175通過補體系統(C3a和C5a)對VEGF-A表達進行調控，進而調節(jié)RNV的生長，并可更早、更有效的治療視網膜新生血管性疾病。因此，甲磺酸萘莫司他可以用來制備治療視網膜新生血管性疾病的藥物。
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實施例I :甲磺酸萘莫司他添加C3a抗體C3a抗體購買于Abcam公司(ab48581)。制備的藥品中中包含有質量體積比g/ml為2%的甲磺酸萘莫司，同時添加質量體積比g/ml為0. 002%的C3a抗體，防腐劑苯乙醇的添加量質量體積比g/ml為I. 1%，最后用磷酸鹽緩沖液補充至最終體積。對于甲磺酸萘莫司和抗體、防腐劑的用量以符合藥理劑量為準，本領域的技術人員可以通過常規(guī)的方法來確定添加量，而不僅僅限于本發(fā)明說明書中記載的范圍。具體制備方法是將甲磺酸萘莫司他固體粉末溶于磷酸鹽緩沖液(氯化鈉9克，磷酸氫二鈉6克，磷酸二氫鈉0.4克添加雙蒸水至1000ml，？117.2至7.4)中，加入濃度為200 u g/ml的抗體,然后加入苯乙醇完成制備。實施例2 甲磺酸萘莫司他添加C3a和C5a抗體C5a抗體購買于Santa Cruz公司(sc-21941 )。在90ml磷酸鹽緩沖液中加入Ig甲磺酸萘莫司，再加入0. 003g的C3a和C5a抗體的混合物，其中C3a和C5a抗體的添加比例 為I :1，再加入Ig防腐劑苯乙醇作為防腐劑，最后用磷酸鹽緩沖液補齊到100ml。其中C3a和C5a抗體可以等比例添加，也可以選用任一藥理允許的比例。根據甲磺酸萘莫司他的腹腔給藥劑量50mg/kg，自氧誘導模型的P12天開始，每天注射此實施例2制備的藥物，在視網膜新生血管生長最為旺盛的P17可以觀察到，注射此實施例藥劑的小鼠視網膜新生血管的生長較單純注射甲磺酸萘莫司他更加有效得得以控制，血管生長更加正常。
權利要求
1.甲磺酸萘莫司他的應用，其特征在于，所述的應用是甲磺酸萘莫司他在制備治療視網膜新生血管性疾病的藥物中的應用。
2.一種治療視網膜新生血管性疾病的藥物，其特征在于，所述的藥物為包含有藥理有效劑量的甲磺酸萘莫司他的溶液。
3.如權利要求2所述的藥物，其特征在于，所述的甲磺酸萘莫司他在溶液中的濃度為I 3%。
4.權利要求2所述的藥物，其特征在于所述的藥物還包括有補體系統內毒素分子C3a和/或C5a的抗體。
5.如權利要求4所述的藥物，其特征在于所述的抗體的添加量為0.002 0. 01%。
6.如權利要求2或4所述的藥物，其特征在于所述的藥物還添加防腐劑。
7.如權利要求6所述的藥物，其特征在于所述的防腐劑為苯乙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療視網膜新生血管性疾病的藥物，即用甲磺酸萘莫司他來制備治療視網膜新生血管性疾病的藥物。且在藥物中還選擇性的添加有補體系統內毒素分子C3a和/或C5a的抗體。本發(fā)明使用甲磺酸萘莫司他，作用于補體途徑，來制備治療視網膜新生血管性疾病的藥物，同時添加有C3a、C5a多肽的抗體，產生中和作用，更加有效的控制視網膜新生血管的生長，制備的藥物將成為視網膜新生血管治療的新型藥物，為臨床多種視網膜新生血管性疾病的治療提供新思路。
文檔編號A61P9/10GK102743371SQ201210259990
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優(yōu)先權日2012年7月26日
發(fā)明者朱瑋, 祁霞, 賈玉東 申請人:山東省眼科研究所