專利名稱：一種介孔鈣硅凝膠及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，特別涉及ー種介孔鈣硅凝膠材料及其制備方法和應用。
背景技術：
介孔材料具有均一可調的介孔孔徑(2_50nm)、規則的納米孔道以及巨大的比表面積/孔容，可用作生物吸附劑、生物催化劑及載體，并在分離提純生物活性物質和新型生物組裝材料等領域有著廣闊的應用前景。介孔材料的特點使其非常適用于蛋白質、酶等活性分子的吸附固定。通過調節孔徑大小，介孔材料可選擇性地吸附生物活性分子。也可以將蛋白、生長因子及酶等固定在其表面，通過表面修飾構建新一代分子生物材料。介孔材料作為ー種新型的納米結構材料，已成為國際上跨化學、物理、材料、生物等多學科研 究熱點和前沿之一。介孔硅基干凝膠由于具有規整的孔道結構，巨大的比表面積，優異的生物活性和生物相容性，可用于快速止血和骨組織修復等生物材料領域(Li XS, Lin W,Xin FL, et al. Adv Mater Res. 2011 ；340 (222) :222-228 ;Heinemann S, Heinemann C，Bernhardt R, et al. Acta Biomater. 2009 ;5 (6) : 1979-1990.)。另外，介孔娃基干凝膠在藥物控釋等領域顯示了其潛在的應用前景(Lee EJ, Jun SH, Kim HE, et al. Silicaxerogel-chitosan nano-hybrids for use as drug eluting bone replacement. ChemMater Sci. 2010 ；21 (1) :207-214.)。以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為結構導向劑，并引入鈣離子，制備了具有2. 62nm孔徑的鈣摻雜介孔ニ氧化硅微球，提高了其生物活性(Li X，乙hang LX, Dong XP,et al. Preparation of mesoporous calcium doped silica sphereswith narrow size dispersion and their drug loading and degradation behavior.Micropor Mesopor Mat. 2007 ；102 (1-3) :151-158.) □吳曉輝等通過溶膠-凝膠法制備了高比表面積(466.5m2/g)的有序介孔(3.7mn)鈣摻雜硅干凝膠，證實了其在體外具有優良的生物活性(Wu XH, Ye L，Liu K，et al. Antibacterial properties of mesoporouscopper-doped silica xerogels. Biomed Mater. 2009 ；4 (4) :1_6.)。戴程龍等對介孔 I丐摻雜硅干凝膠進行了系統的研究，證實了該材料可用于快速止血及骨組織修復(Dai CL，L CS，Wei J.et al. Biomaterials. 2010 ；31 (30) :7620-7630. Dai CL，Guo H，Lu JX, etal. Biomaterials. 2011 ；32 (33) :8506-8517. ) 0然而，現有的鈣硅基干凝膠的介孔孔徑較小，其上限大約為8nm，材料對生物大分子如蛋白質的負載主要依靠其表面的物理吸附作用，材料吸附大分子的量較少，而且吸附后的大分子不能在材料上緩慢釋放，出現瀑釋，從而使該材料在大分子的控制釋放等方面的應用受到一定的限制(Aertsa CA，Verraedta E，Deplaa A. Int J Pharmaceut. 2010 ；397 (1-2) :84-91. Tourne-Peteilh C，Begu S，Lerner DA, et al. J Sol-Gel SciTechn. 2012 ；61 (3) :455-462.)。趙東元等在酸性條件下，利用非離子型嵌段共聚物為模板，制備了一系列具有高度有序孔結構的六方介孔硅分子篩(SBA)，其孔徑分布在5-30mnZJl] (Zhao DY，Feng JL, Huo QS, et a_L Triblock copolymer syntheses of mesoporoussilica with periodic 50 to 300 angstrom pores. Science. 1998 ;279 (5350)548-552.)，這為我們制備適合負載生物大分子如蛋白質的介孔材料提供了重要依據。外源性rhBMP-2是ー種生物大分子，具有很強的骨誘導活性(Pohla LM,Boergermannc jH, bchwaerzerc GK, et al.buriace immobilization of bonemorphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces celldifferentiation. Acta Biomater. 2012 ;8 (2) :772-780.)。然而，rhBMP-2 的體內半衰期短，全身和局部應用很快被稀釋代謝，達不到所期望的生物學效果。因此rhBMP-2要在骨缺損發揮作用，必須有一個合適的載體才能達到在體內緩釋進而長效發揮促進骨骼細胞生長的作用。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的介孔鈣硅基凝膠材料(MCS，Mesoporous caclium silicate)介孔直徑較小,對蛋白質等生物大分子或藥物分子的吸附量有限；而且該材料負載的生物大分子是以突釋或瀑釋方式(材料負載的生物大分子在很短時間內就被完全釋放)從材料上釋放，無法起到長效緩釋功能的缺陷，提供一種新的介孔鈣硅凝膠材料、所述介孔鈣硅凝膠的制備方法、所述介孔鈣硅凝膠在制備生物材料中的用途和所述的介孔鈣硅凝膠/生物大分子復合物。本發明人通過大量實驗驚喜地發現本發明制備的大孔徑介孔鈣硅凝膠不僅可作為細胞載體，而且可作為生物大分子的高容量載體，通過調控該材料的納米孔道結構能夠實現其負載的生物大分子的可控釋放，從而完成了本發明。為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一是ー種介孔鈣硅凝膠，其中所述介孔I丐娃凝膠的比表面積為257. 8m2/g 485. 6m2/g,平均孔徑為3. 97nm 35nm,孔容為
0.48cm3/g I. 43cm3/g。本發明所述介孔鈣硅凝膠的比表面積較佳地為257.8m2/g，平均孔徑較佳地為35nm，孔容較佳地為I. 43cm3/g。其中所述的介孔鈣硅凝膠粉末X-射線衍射圖譜上在橫坐標2 0為0 2°之間沒有衍射峰，而在2 0為10 40°有一個廣泛的吸收峰。為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二是ー種如上所述介孔鈣硅凝膠的制備方法，其中所述制備方法包括以下步驟(I)將結構導向劑溶解在水中，調節溶液pH值為I 3，加入擴孔劑攪拌溶解，再加入硅源、鈣源和磷源，30 50°C下進行反應；(2)將步驟(I)所得反應液pH值調節為9 13，80 120°C靜置12 48小時得到沉淀，將所得沉淀洗滌至PH7 7. 2，80 100°C干燥48 72小時后550°C 700°C焙燒2 8小時，得到最終產品。其中步驟⑴所述的結構導向劑為本領域常規的結構導向劑，所述結構導向劑較佳地包括非離子型表面活性剤、陽離子型表面活性劑和陰離子表面活性劑中的一種或幾種。其中所述非離子型表面活性劑較佳地為EO2ciPO7ciEO2tl(Pluixmic P123)和EO106PO70EO106(Pluronic F127)中的ー種或兩種。本發明所述導向劑優選地為非離子型嵌段共聚物 EO2qPO7qEO2q (Pluronic P123)。其中所述擴孔劑為本領域常規的擴孔劑，其中所述擴孔劑較佳地包括1，3，5-均三甲苯(TMB)、癸烷(Decane)和聚こニ醇(PEG)中的ー種或幾種。本發明所述擴孔劑優選地為1，3，5-均三甲苯(TMB)。其中所述硅源為本領域常規的硅源。其中所述硅源較佳地包括正硅酸こ酯(TEOS)和正硅酸甲酯(TMOS)中的ー種或兩種。本發明所述硅源優選地為正硅酸こ酷。其中所述的磷源為本領域常規的磷源。所述磷源較佳地包括磷酸三こ酯(TEP)和磷酸三甲酯(TMP)中的ー種或兩種。本發明所述磷源優選地為磷酸三こ酷。其中所述鈣源為本領域常規的鈣源試劑，所述鈣源試劑較佳地選自氯化鈣、硝酸鈣和醋酸鈣中的ー種或幾種。本發明所述鈣源優選地為Ca(NO3)2 4H20。其中所述結構導向劑的添加量較佳地為2 4%，所述擴孔劑的添加量較佳地為2 4%,所述娃源的添加量較佳地為3 4%,所述磷源的添加量為0. 5 3%,所述I丐源 的添加量較佳地為I 3%，上述百分比均為質量百分比。步驟(I)所述調節溶液酸堿性方法為本領域常規方法，本發明優選用鹽酸將溶液的PH值調節為I 3，所述攪拌時間較佳地為2 4小時，至溶液澄清后再加入硅源、鈣源和磷源，30 50°C反應時間較佳地為12小時 36小時。其中所述步驟(2)調節溶液酸堿性方法為本領域常規方法，本發明優選使用氨水將溶液PH值調節為9 13，靜置溫度較佳地為80 120°C，靜置時間較佳地為12 48小吋。將所得沉淀洗滌至中性，所述中性的PH值較佳地為7 7. 2，干燥溫度較佳地為80 100°C，干燥時間較佳地為48 72小時，煅燒溫度較佳地為550°C 700°C，焙燒時間較佳地為2 8小時，所述焙燒的升溫速率較佳地為1°C /min 5°C /min。本發明所述介孔鈣硅凝膠制備方法的優選實例為將3 Sg非離子型嵌段共聚物EO20PO70EO20(Pluronic P123, Sigma-AIdrich)作為結構導向劑(Mw = 5800)溶解在 200 300ml去離子水中，用磁力攪拌器強烈攪拌至溶液澄清；用37%濃鹽酸調節溶液體系的pH值至pHl 3,加入4 8g擴孔劑1,3,5-均三甲苯,攪拌2 4h,至溶液成白色乳液,再將6 IOg正硅酸こ酷、5 8gCa (NO3)2 *4H20和I. 5g 4g磷酸三こ酯加入溶液反應體系中，將反應體系置于30°C 50°C水浴，繼續反應12小吋 36小吋。用濃氨水將溶液反應體系PH值調節至pH9 13，溶液反應體系置于80°C 120°C烘箱，靜置12小時 48小時后，得到白色沉淀。將白色沉淀用去離子水洗滌至PH7 7.2，并于80°C 100°C干燥箱內干燥48小時 72小時，用馬弗爐將材料于550°C 700°C焙燒2小時 8小時，焙燒升溫速率1°C /min 5°C /min,得到最終產品介孔I丐娃凝膠。為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三是本發明所述的介孔鈣硅凝膠在制備生物材料中的用途。本發明所述介孔鈣硅凝膠在制備生物材料中的用途為本領域常規的用途。其中所述用途較佳地包括所述介孔鈣硅凝膠在制備生物材料支架的用途，在制備生物大分子和/或藥物緩釋載體的用途。本發明所述用途優選地為所述介孔鈣硅凝膠在制備生物大分子和/或藥物緩釋載體中的用途。其中所述生物大分子是本領域常規使用的生物大分子。所述生物大分子較佳地包括蛋白質、酶、核酸和碳氫化合物中的ー種或幾種。為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之四是一種介孔鈣硅凝膠復合物，所述的介孔鈣硅凝膠復合物中包含如上所述的介孔鈣硅凝膠以及該介孔鈣硅凝膠負載的蛋白質分子和/或生物活性因子。
其中所述的生物活性因子是能改變細胞的行為或性質，通過與細胞特異的受體結合而起作用的ー類分子的統稱。所述生物活性因子較佳地包括可溶性蛋白質分子、核酸分子、多糖分子或其他碳氫化合物類分子中的ー種或幾種。其中所述蛋白質分子為本領域常規的蛋白質分子。所述蛋白質分子是指生物體中廣泛存在的ー類生物大分子，由核酸編碼的a氨基酸之間通過a氨基和a羧基形成的肽鍵連接而成的肽鏈，經翻譯后加工而生成的具有特定立體結構的、有活性的大分子。本發明所述蛋白質分子優選地為rhBMP-2蛋白質分子(重組人骨形態發生蛋白-2)。所述rhBMP-2蛋白分子屬于骨形態發生蛋白，該類蛋白具有誘導未分化間充質細胞向軟骨細胞和成骨細胞方向分化的作用，在骨折和骨損傷的修復過程中發揮重要作用。所述rhBMP-2蛋白來源 較佳地包括天然提取、人工合成或體外重組表達等途徑。天然提取是指從自然界的生物體中提取天然存在的rhBMP-2蛋白。人工合成是指通過化學方法在體外合成具有生物活性的rhBMP-2蛋白。體外重組表達是指在體外構建表達該蛋白的載體，選擇合適的表達系統如原核表達系統或真核表達系統在體外表達、純化獲得具有生物活性的重組rhBMP-2蛋白。本發明所述介孔鈣硅凝膠復合物中介孔鈣硅凝膠成分的含量較佳地為0. 1% 99. 9%，優選的含量為0. 5% 90%,所述百分比為質量百分比。其中所述介孔鈣硅凝膠復合物的制備方法為本領域常規的制備方法，所述制備方法較佳地包括以下步驟將蛋白質分子和/或生物活性因子溶于溶劑中，配制成蛋白質分子和/或生物活性因子溶液，加入介孔鈣硅凝膠粉末，震蕩反應、離心、烘干得到負載蛋白質分子和/或生物活性因子的介孔鈣硅凝膠。其中所述蛋白質分子和/或生物活性因子較佳地為rhBMP-2分子(重組人骨形態發生蛋白-2)，所述溶劑較佳地為0. 02 0. 05M稀醋酸溶液，所述蛋白質分子溶液濃度較佳地為0. 5 lmg/mL。震蕩反應溫度較佳地為35 37°C，震蕩頻率較佳地為80 IOOr/min,反應時間較佳地為2 48小時，烘干溫度較佳地為37 42°C。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現有技術，本發明的有益效果如下本研究制備的大孔徑介孔鈣硅凝膠材料對生物活性因子具有容量高，緩慢釋放的特性，不僅可作為細胞載體，還可作為生物活性因子的高容量載體，并通過調控其納米孔道結構實現其可控釋放功能。因此，該介孔鈣硅凝膠材料具有調控組織再生和緩釋生物活性因子的雙重功能。同時本發明所述大孔徑介孔鈣硅凝膠材料，能有效地保持生物大分子的生物活性，是生物活性因子如rhBMP-2的控制釋放的優良載體，所述介孔鈣硅凝膠/rhBMP-2復合材料，對細胞増殖具有長效的促進作用。


以下結合

本發明的特征和有益效果。圖I是介孔鈣硅凝膠材料及其復合材料制備流程示意圖。(a)是制備MCS的流程示意圖。(b)是制備MCS/rhBMP-2復合材料的制備流程示意圖。圖2是介孔鈣硅凝膠材料小角X射線衍射圖譜。a MCS-4 ；b MCS-35。圖3是介孔鈣硅凝膠材料廣角X射線衍射圖譜。a MCS-4 ；b MCS-35。圖4是介孔鈣硅凝膠材料傅里葉紅外光譜。a MCS-4 ；b MCS-35。
圖5是介孔鈣硅凝膠材料低溫氮氣吸附-脫附等溫線。a MCS-4 ；b MCS-35。圖6是介孔鈣硅凝膠材料孔徑分布示意圖。a MCS-4 ；b MCS-35。圖7是介孔鈣硅凝膠材料的TEM照片。a，b MCS-4 ；c, d MCS-35。圖8是介孔鈣硅凝膠材料的SEM照片。a，b MCS-4 ；c, d MCS-35。圖9是介孔鈣硅凝膠材料的激光粒度分布圖。圖10是介孔鈣硅凝膠材料的EDS分析圖。a MCS-4 ；b MCS-35。圖11是介孔I丐娃凝膠材料對rhBMP-2的吸附曲線圖和釋放曲線圖b。其中a是吸附曲線圖，b是釋放曲線圖。圖12是介孔鈣硅凝膠材料在不同時間對細胞增殖的影響效果圖。
具體實施例方式下面用實施例來進ー步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。實施例I.介孔鈣硅凝膠的制備采用模板誘導和自組裝方法合成介孔I丐娃凝膠(MCS, Mesoporous cacliumsilicate)材料。將4. 8g非離子型嵌段共聚物E02(lP07(lE02(l (Pluronic P123, Sigma-Aldrich)作為結構導向劑(Mw = 5800)溶解在240ml去離子水中，用磁力攪拌器強烈攪拌至溶液澄清；用2ml 37% (v/v)濃鹽酸調節溶液體系的pH值至pH = I,加入6g I,3,5-均三甲苯(擴孔劑)(TMB，國藥集團化學試劑有限公司，AR)，攪拌2h，至溶液成白色乳液，再將8ml正硅酸こ酯(TE0S，上海凌峰化學試劑有限公司，AR)、3. 75g Ca(NO3)2 4H20和2. 5g磷酸三こ酷(TEP，國藥集團化學試劑有限公司，AR)加入溶液反應體系中，將反應體系置于45°C水浴，再反應24h。用濃度為13M的氨水將溶液反應體系pH值調節至pH = 10，溶液反應體系置于100°C烘箱，靜置48h后，得到白色沉淀。將白色沉淀用去離子水洗滌至pH值為7，并于80°C干燥箱內干燥12小時，用馬弗爐將材料于550°C焙燒6h，升溫速率1°C /min，得到最終產品。介孔鈣硅凝膠制備流程如圖1(a)所示。采用同樣的方法，但不加入擴孔劑TMB，制備介孔鈣硅凝膠材料作為對照組；所制備的兩種介孔鈣硅凝膠材料的配方如表I所示。表I MCS的組成成分
權利要求
1.一種介孔鈣硅凝膠，其特征在于，所述介孔鈣硅凝膠的比表面積為257. 8m2/g 485. 6m2/g，平均孔徑為 3. 97nm 35nm，孔容為 O. 48cm3/g I. 43cm3/g。
2.如權利要求I所述的介孔鈣硅凝膠，其特征在于，所述介孔鈣硅凝膠粉末X-射線衍射圖譜在橫坐標2 Θ為10 40°有一個廣泛的吸收峰。
3.—種如權利要求I所述的介孔鈣硅凝膠的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟 (1)將結構導向劑溶解在水中，調節溶液PH值為I 3，加入擴孔劑攪拌溶解，再加入硅源、鈣源和磷源，30 50°C下進行反應； (2)將步驟⑴所得反應液pH值調節為9 13，80 120°C靜置12 48小時得到沉淀，將所得沉淀洗滌至PH7 7. 2，80 100°C干燥48 72小時后550°C 700°C焙燒2 8小時，得到最終產品。
4.如權利要求3所述的介孔鈣硅凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述結構導向劑包括非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑和陰離子表面活性劑中的一種或幾種。
5.如權利要求4所述的介孔鈣硅凝膠的制備方法，其特征在于，其中所述的非離子型表面活性劑包括EO20PO70EO20和EO106PO70EO106中的一種或兩種。
6.如權利要求3所述的介孔鈣硅凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述所述擴孔劑包括1，3，5-均三甲苯、癸烷和聚乙二醇中的一種或幾種，所述硅源包括正硅酸乙酯和正硅酸甲酯中的一種或兩種，所述鈣源包括Ca(NO3)2 · 4H20、氯化鈣和醋酸鈣中的一種或幾種，所述磷源包括磷酸三乙酯和磷酸三甲酯中的一種或兩種。
7.如權利要求3所述的介孔鈣硅凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述所述導向劑的添加量為2 4%,所述擴孔劑的添加量為2 4%,所述I丐源的添加量為I 3%,所述硅源的添加量為3 4%，所述磷源的添加量為O. 5 3 %，上述百分比均為質量百分比。
8.如權利要求3所述的介孔鈣硅凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述加入擴孔劑攪拌時間為2 4小時，30 50°C進行反應的時間為12 36小時；步驟⑵所述焙燒升溫速率是I 5°C /min。
9.權利要求I所述的介孔鈣硅凝膠在制備生物材料中的用途。
10.一種介孔鈣硅凝膠復合物，其特征在于，所述介孔鈣硅凝膠復合物中包含如權利要求I所述的介孔鈣硅凝膠以及該介孔鈣硅凝膠負載的蛋白質分子和/或生物活性因子。
全文摘要
本發明公開了一種大孔徑介孔鈣硅凝膠，該材料的比表面積257.8m2/g～485.6m2/g，平均孔徑3.97nm～35nm，孔容0.48cm3/g～1.43cm3/g。該材料的制備方法包括將結構導向劑、擴孔劑溶于水中，pH1～3下水浴加熱攪拌，加入鈣源、硅源和磷源，將所得反應液pH值調節為9～13，80～120℃靜置12～48小時得到沉淀，將所得沉淀洗滌至pH7～7.2，80～100℃干燥48～72小時后550℃～700℃焙燒2～8小時，得到最終產品。還公開了一種介孔鈣硅凝膠復合物，該材料能很好地吸附并緩釋生物活性因子，具有很好的細胞相容性并且能夠有效促進細胞增殖。
文檔編號A61L31/06GK102755650SQ20121026431
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月27日 優先權日2012年7月27日
發明者關曼, 劉昌勝, 吳釗英, 宋文華, 李享德, 王永麗, 鄧玉虎, 魏杰 申請人:華東理工大學