專利名稱：Klotho腺相關病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，具體的說，涉及一種Klotho腺相關病毒的新用途。
背景技術：
研究表明高血壓病及其相關的心血管疾病已成為危及人群健康的常見病；而老年人因罹患心血管病而致的死亡明顯高于年輕人。因此，高血壓病以及相關心血管并發癥與衰老密切相關，也是影響其預后的重要因素。已有研究證實自發性高血壓(spontaneoushypertensive rat, SHR)大鼠具有許多人類自發性高血壓的特征,是一種很好的高血壓模型動物，其血壓水平有隨年齡增長而增高的特點，常伴發心、腎及血管等靶器官損傷，其中高血壓心臟病以心肌肥大、心肌纖維化、心室重塑等損害更為重要。 Klotho基因作為一種于1997年被KuiX)等人發現的新型衰老相關基因，其研究發現在Klotho基因敲除小鼠模型上Klotho可以抑制多種類似人類衰老相關表型，如動脈硬化、骨質疏松、生殖功能減退、肺氣腫、壽命縮短等。而Klotho的過表達可以延長壽命。研究發現Klotho基因可以抑制胰島素IGF-I信號通路，增加NO活性，調節離子通道活性。Klotho還可以對抗內皮功能障礙。肖明能等研究報道40歲以后血漿Klotho蛋白水平隨年齡增加而有下降趨勢。Wang等報道Klotho在體內的基因轉導可以阻止高血壓的進程和保護腎臟功能。但就Klotho在心臟靶器官損傷中是否也發揮了作用，以及是否對高血壓心臟病有治療作用，目前尚未見報道。

發明內容
為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種Klotho腺相關病毒作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物的新用途。本發明目的是這樣實現的=Klotho腺相關病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應用。動物實驗I.材料I. I實驗動物10周齡雄性SHR大鼠購自北京維通利華實驗動物公司，10周齡雄性SD大鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心。I. 2 試劑多克隆兔來源IGF-I、IGF-1R、p-Akt (Ser473)、t-Akt—抗購自北京博奧森生物公司；IGF-U Rat Insulin ELISA kit為R&D公司分裝產品；RIPA蛋白裂解液(漿)、PMSF、SDS-PAGE配膠試劑盒、轉膜液、電泳液、蛋白Maker、PVDF膜均為碧云天產品。2.方法2. I動物實驗方案
實驗研究分4組，實驗組A、B、C 3組均為SHR大鼠，對照組(D組)為年齡、性別一致的SD大鼠，每組5只。所有大鼠均在重慶醫科大學附屬第一醫院中心實驗室動物房SPF級飼養，標準大鼠飼料喂養，飲水中加復合維生素B。自由取食飲水。采用無創尾動脈袖帶法測量大鼠靜息收縮壓。無創尾動脈袖帶法是一種常用的血壓檢測方法[6，7]。所有大鼠在實驗前檢測血壓、體重。實驗組即A、B、C組SHR大鼠分別行尾靜脈注射PBS(0. 5ml/只)、rAAV. mKL (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml)和 rAAV. EGFP (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml);對照組 SD 大鼠尾靜脈注射PBS 0.5ml作為對照研究。隨后每兩周測體重、血壓一次，連續觀察12周。實驗結束時處死全部大鼠。處死前用水合氯醛腹腔注射麻醉，采血分離血漿。分離心臟，去除血液、大血管稱重。取部分左心室用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片做HE、MaSSon染色；部分OCT包埋，做冰凍切片，熒光顯微鏡觀察熒光。2. 2免疫組化檢測心臟klotho蛋白表達使用博奧森SP免疫組化染色試劑盒，步驟如下大鼠心臟組織切片脫蠟至水，1%胰酶37°C 25min抗原修復，3 %過氧化氫孵育lOmin，封閉液37°C封閉25min，4°C孵育一抗 (Anti-Klotho,l 50)過夜，I 100 二抗37°C孵育30min，HRP標記鏈霉卵白素工作液孵育30min，DAB顯色l-5min。復染、脫水、透明、封片、晾干。Leica正置顯微鏡觀察、采圖，Image-Pro Plus 6. O 軟件分析陽性異染顆粒 IOD (Integrated Optical Density)值。2. 3 心臟 HE 及 Masson 染色各組大鼠心臟組織切片，常規HEQiematoxylin)染色觀察心肌細胞，同時進行Masson三色法膠原纖維染色，Leica正置顯微鏡觀察并采圖。2. 4RT-PCR法檢測心臟小鼠Klotho mRNA表達用RNAiso Plus按說明書提取心臟總RNA，Nanodrop2000微量分光光度計檢測總RNA濃度計A260/A280比值。總RNA濃度在3-5 μ g/μ L，Α260/Α280比值在I. 8-2. O之間，無明顯降解及蛋白污染，滿足逆轉錄需要。取I μ g總RNA,用PrimeScriptRT reagent Kit按說明書20 μ L體系逆轉錄，逆轉錄所得cDNA-20°C保存。根據NCBI GenBank收錄mRNA蛋白編碼區序列設計引物。小鼠Klotho (NCBI Reference Sequence NM_013823. 2):上游5，-GGG TCA CTG GGTCAA TCT-3，;下游 5’ -GCA AAG TAG CCA CAA AGG-3，，PCR 產物長度為 710bp。取 2μ L逆轉錄所得 cDNA，用 Premix Taq Version 2. OPCR 擴增小鼠 Klotho 基因。小鼠Klotho PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳觀察分析。β-actin PCR產物長度為157bp。2.5GFP蛋白檢測新鮮心臟組織用OCT包埋，冰凍切片(20 μ m)。用Leica DM6000熒光正置顯微鏡觀察綠色熒光表達情況，并采圖。2. OTestern blot 檢測 Klotho 蛋白表達取新鮮心臟組織約lOOmg，盡量剪碎，加400 μ L RIPA蛋白裂解液(含4 μ L ImMPMSF)冰上充分裂解30min，14，000g 4°C離心5min。收集上清，取IyL BCA法測蛋白濃度。另取20(^1^加同體積蛋白上樣緩沖液，沸水煮511^11，-201保存備用。配制8% SDS-PAGE分離膠，每孔加總蛋白40 μ g，蛋白電泳分離，根據蛋白Maker切膠，轉至PVDF膜。在含5 % BSA的TBST中37°C封閉lh。I : 750稀釋的Klotho—抗4°C孵育過夜。GAPDH—抗I : 1000稀釋后孵育。次日HRP標記二抗(I 3000) 37°C孵育Ihour。加ECL后X膠片曝光、顯影、定影。Quantity One軟件測定蛋白條帶灰度值。Klotho蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值為Klotho蛋白相對表達量。2. 7心臟體重指數大鼠處死前稱體重，處死后分離心臟，去除血液、大血管后稱重。心臟左心室體重指數=大鼠心臟左心室重量(g) XlOOO+大鼠體重(g)。2. 8數據分析所有數據應用PASW 18軟件分析。體重、血壓數據應用one-way ANOV A分析，其余數據應用two-ways ANOVA分析,其顯著性檢驗設置為95%可信區間，P < O. 05即為顯著性。3.結果3. IKlotho基因轉導對SHR大鼠血壓的影響在rAAV轉導前，17周齡的SHR大鼠基礎血壓明顯高于17周齡的SD大鼠(圖I)。12周實驗結束時，SHR-mKL組SHR大鼠其血壓與干預前相比并無明顯升高，而SHR-PBS組和SHR-EGFP組血壓則繼續升高，在實驗12周結束時血壓高達204. 2±10. 6mmHg。本研究證實單劑量的rAAV. mKL (3 X IO8Vg)能阻止SHR大鼠高血壓的進展至少12周。如圖I所示.rAAV. mKL轉導對SHR大鼠血壓的影響。SHR和SD大鼠在17周齡時，尾靜脈注射rAAV. mKL、rAAV. EGFP及PBS。數據為均值土標準差，* :與SHR-PBS組相比P< O. 05。N = 5 只 / 組。3. 2檢測大鼠心臟GFP及mKL mRNA表達情況在rAAV. mKL和rAAV. EGFP轉導12周后，在SHR-mKL組和SHR-EGFP組大鼠心臟中仍觀察到綠色熒光EGFP表達。而SHR-PBS組和SD-PBS組大鼠心臟中未觀察到綠色熒光。此結果提示rAAV介導的基因轉導可以在心臟中較長時間表達，并維持到12周實驗結束之時。rAAV. mKL轉導SHR大鼠12周后，心臟中檢測到小鼠Klotho mRNA表達，提示rAAV成功地將小鼠Klotho基因轉導至心臟。而其他三組中未檢測到小鼠mKLmRNA表達。GFP和小鼠Klotho mRNA在心臟中的表達。在熒光顯微鏡下，可見rAAV. mKL和rAAV. EGFP轉導的大鼠心臟有GFP表達，PBS注射大鼠心臟未見綠色熒光(如圖2)。用小鼠Klotho特異性引物RT-PCR檢測小鼠心臟Klotho mRNA表達(如圖3)，發現除rAAV. mKL轉導SHR大鼠外，其余三組均未見小鼠mKL mRNA表達3. 3Klotho基因轉導對SHR大鼠心肌肥大、心肌纖維化及心臟左心室重量指數的影響。rAAV. mKL對心肌肥大、心肌纖維化及Klotho蛋白表達的影響。如圖4所示，rAAV.mKL對心肌肥大的影響(HE染色)。如圖5所示,rAAV. mKL對心臟膠原纖維(Masson染色)表達的影響。如圖6所示，rAAV.mKL對大鼠心臟體重指數的影響。數據=均數土標準差。* 與 SHR-PBS 組相比 P < O. 05 ;林 與 SHR-PBS 相比 P < O. 01，N = 5 只 / 組。3組SHR大鼠心臟切片HE染色后，均可見肥大心肌細胞，但是在SD大鼠心臟切片未見明顯肥大心肌細胞(如圖4)。上述各組相互比較后，發現轉導rAAV.mKL大鼠心臟中肥大心肌細胞明顯少于PBS和rAAV. EGFP處理大鼠。Masson三色染色后看到，SHR大鼠心臟比SD大鼠心臟膠原纖維明顯增生(如圖5)。但經rAAV. mKL處理后大鼠心臟膠原纖維表達明顯少于rAAV. EGFP和PBS處理組，即提示Klotho基因明顯抑制心臟膠原纖維表達。3組SHR大鼠心臟左心室體重指數明顯高于SD大鼠(如圖6)，其中SHR-mKL組心臟體重指數也明顯低于SHR-EGFP組和SHR-PBS組(p < O. 05)。另外在SHR-EGFP組和SHR-PBS組之間心臟體重指數無明顯差異，即提示rAAV載體本身不影響SHR大鼠心臟體重指數。3. 4Klotho基因轉導對SHR心臟Klotho蛋白的影響SHR大鼠心臟Klotho蛋白表達較同齡SD大鼠少，其中SHR-mKL組Klotho蛋白表達較其他兩組明顯增加，Klotho蛋白表達在SHR-mKL組和SD-PBS組之間無顯著差異(見圖 7、8)。rAAV. mKL對大鼠心臟Klotho蛋白表達的影響。如圖7所示,Klotho、GAPDHWesternblot條帶；如圖8所示，Klotho蛋白表達定量分析。 三·結論本研究采用的重組腺相關病毒載體與其他基因轉導載體相比，有許多特有的優勢首先，由于腺相關病毒可以將外源基因插入到宿主基因組，rAAV介導的基因轉導可以穩定持續表達。本研究采用rAAV. mKL轉導SHR大鼠12周后，其心肌中仍可檢測到GFP表達及mKL mRNA表達，也證明了這一特點；而rAAV. mKL的長效作用主要歸功于長效的AAV載體。其次，AAV載體在體內轉導沒發現明顯免疫反應，在組織學檢查中沒發現免疫反應跡象，在后期數據分析中也沒觀察到AAV載體的毒性反應；而上述這些特征對于像高血壓這種慢性疾病的治療至關重要。因此，AAV介導的Klotho基因轉導為高血壓及相關心血管疾病的長期治療提供了新的方向。本實驗研究證實rAAV. mKL可以顯著增加SHR大鼠心臟Klotho mRNA及蛋白的表達，同時Klotho基因轉導可以阻止SHR大鼠血壓的升高，與文獻報道一致。通過對自發性高血壓大鼠行Klotho基因轉導實驗，發現rAAV. mKL轉導的SHR大鼠其心臟組織的心肌肥大和心肌纖維化較SHR對照組明顯受到抑制、其心臟體重指數也較對照組降低，由此推測，Klotho基因表達上調在SHR大鼠心肌肥大和心肌纖維化進程中發揮了作用，降低了左心室質量指數，而這三方面也是高血壓心臟病的重要病理過程和評價指標。同時研究也證實了心臟是Klotho作用的靶器官之一。眾所周知，高血壓病持續發展可導致心肌肥大、心肌纖維化、心臟增大，這正是其發生心肌重塑、心肌損害的重要表現。國內學者研究報道血漿Klotho蛋白水平隨年齡增加而降低，同時研究證實高血壓病發病隨著年齡增加而增加。為此，研究Klotho基因在高血壓以及心肌肥大、心肌纖維化進程中的作用及機制具有重要意義。本實驗研究發現Klotho基因轉導組SHR大鼠其肥大心肌細胞和心肌膠原纖維較對照組減少，心臟體重指數也較對照組降低。上述結果表明Klotho基因及蛋白不僅在心臟組織中的表達，而且對心臟靶器官損傷也有保護作用=Klotho可以抑制心肌肥大，減少肥大心肌細胞，進而減少心臟體重指數。此外，Klotho可以抑制心臟膠原纖維增生即抑制心肌纖維化。研究證實AAV介導的Klotho基因轉導可以長時表達，為長期有效的心臟保護提供了一條新的干預途徑。有益效果本實驗研究結果顯不,通過Klotho基因轉導可以控制SHR大鼠血壓進一步升高，減輕高血壓心臟病心臟損害即可以保護SHR大鼠心臟，至少可以持續12周，Klotho腺相關病毒完全可以作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物對高血壓及相關心血管疾病進行治療。


圖I為尾靜脈收縮壓與大鼠周齡坐標圖；圖2為4組大鼠心臟切片熒光顯微鏡圖；圖3為4組大鼠心臟組織的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4為4組大鼠心臟常規HE染色顯微鏡圖；圖5為4組大鼠Masson三色染色顯微鏡圖；圖6為4組大鼠心臟體重坐標圖；圖7為4組大鼠心臟蛋白條帶灰度值圖；圖8為4組大鼠心臟蛋白表達定量坐標圖。
具體實施例方式實施例一、Klotho腺相關病毒制備I.材料I. I實驗動物5周齡昆明小鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心。I. 2 試劑RNAiso Plus>PrimeScript RT reagent Kit、加A尾試劑盒、pMD19_T vector>EcoR
I和 Xho I 限制性內切酶 Premix Taq Version 2. O, SYBR Premix Ex Taq II,DLIOOODNAMaker購自大連寶生物公司；pAAV-IRES_HnGFP質粒為Stratagene公司產品。2 方法參照本課題組研究，用RNAiso Plus從新鮮小鼠腎臟組織提取總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit按使用說明，用Klotho特異性下游引物替代隨機引物和Oligo dT引物逆轉錄。從NCBI GenBank獲取小鼠Klotho mRNA編碼區序列(ΝΜ_013823· 2),設計小鼠Klotho特異性引物上游 5' ccggaattcatgctagcccg 3',下游51 gccgctcgagttacttataacttctc 31。取 2 μ L 逆轉錄產物，25 μ L 體系擴增小鼠 Klotho編碼序列。PCR產物加A尾后連接至pMD19-T載體，EcoR I and Xho I雙酶切及寶生物公司基因測序鑒定。EcoR I and Xho I雙酶切pMD19_T. mKL,獲得小鼠Klotho全長cDNA,亞克隆至pAAV-IRES-HnGFP多克隆位點EcoR I和Xho I之間，獲得質粒AAV. mKL (pAAV. mKL)，經測序鑒定pAAV. mKL符合實驗要求。pAAV. mkl與RC、Phelpr質粒共轉染AAV-293細胞包裝 AAV. EGFP rAAV. mKL ;pAAV_IRES-HnGFP 空質粒與 RC、Phelpr 質粒共轉染 AAV-293 細胞包裝rAAV. EGFP，rAAV. EGFP做為空白對照病毒。3 結果成功獲得rAAV. mKL和rAAV. EGFP，測定rAAV. mKL和rAAV. EGFP的滴度分別為3 X 10nvg/ml 和 I X 1012vg/ml。兩次基因測序結果與NCBI GenBank中小鼠Klotho mRNA蛋白編碼區(⑶S)序列(編號NM—013823. 2，網址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM—013823. 2)完全
—致111-3155，atg起始，taa結束。測序結果與以下序列一致。I gataatcatt gctcgtgggg cggcgggagc gggggtgggc accgcgtagggagggcggcg61 gggcgcgggc atataggggc gcggcgcggt gccctcccgg ctcccgcagc atg ctagccc121 gcgcccctcc tcgccgcccg ccgcggctgg tgctgctccg tttgctgttgctgcatctgc181 tgctgctcgc cctgcgcgcc cgctgcctga gcgctgagcc gggtcagggcgcgcagacct 241 gggctcgctt cgcgcgcgct cctgccccag aggccgctgg cctcctccacgacaccttcc301 ccgacggttt cctctgggcg gtaggcagcg ccgcctatca gaccgagggcggctggcgac361 agcacggcaa aggcgcgtcc atctgggaca ctttcaccca tcactctggggcggccccgt421 ccgactcccc gatcgtcgtg gcgccgtcgg gtgccccgtc gcctcccctgtcctccactg481 gagatgtggc cagcgatagt tacaacaacg tctaccgcga cacagaggggctgcgcgaac541 tgggggtcac ccactaccgc ttctccatat cgtgggcgcg ggtgctccccaatggcaccg601 cgggcactcc caaccgcgag gggctgcgct actaccggcg gctgctggagcggctgcggg661 agctgggcgt gcagccggtg gttaccctgt accattggga cctgccacagcgcctgcagg721 acacctatgg cggatgggcc aatcgcgccc tggccgacca tttcagggattatgccgagc781 tctgcttccg ccacttcggt ggtcaggtca agtactggat caccattgacaacccctacg841 tggtggcctg gcacgggtat gccaccgggc gcctggcccc gggcgtgaggggcagctcca901 ggctcgggta cctggttgcc cacaacctac ttttggctca tgccaaagtctggcatctct961 acaacacctc tttccgcccc acacagggag gccgggtgtc tatcgccttaagctcccatt1021 ggatcaatcc tcgaagaatg actgactata atatcagaga atgccagaagtctcttgact1081 ttgtgctagg ctggtttgcc aaacccatat ttattgatgg cgactacccagagagtatga1141 agaacaacct ctcgtctctt ctgcctgatt ttactgaatc tgagaagaggctcatcagag1201 gaactgctga cttttttgct ctctccttcg gaccaacctt gagctttcagctattggacc1261 ctaacatgaa gttccgccaa ttggagtctc ccaacctgag gcagcttctgtcttggatag1321 atctggaata taaccaccct ccaatattta ttgtggaaaa tggctggtttgtctcgggaa1381 ccaccaaaag ggatgatgcc aaatatatgt attatctcaa gaagttcataatggaaacct1441 taaaagcaat cagactggat ggggtcgacg tcattgggta caccgcgtggtcgctcatgg1501 acggtttcga gtggcatagg ggctacagca tccggcgagg actcttctacgttgactttc1561 tgagtcagga caaggagctg ttgccaaagt cttcggcctt gttctaccaaaagctgatag1621 aggacaatgg ctttcctcct ttacctgaaa accagcccct tgaagggacatttccctgtg1681 actttgcttg gggagttgtt gacaactacg ttcaagtgga cactactctctctcagttta1741 ctgacccgaa tgtctatctg tgggatgtgc atcacagtaa gaggcttattaaagtagacg1801 gggttgtagc caagaagaga aaaccttact gtgttgattt ctctgccatccggcctcaga1861 taaccttact tcgagaaatg cgggtcaccc actttcgctt ctccctggactgggccctga1921 tcttgcctct gggtaaccag acccaagtga accacacggt tctgcacttctaccgctgca1981 tgatcagcga gctggtgcac gccaacatca ctccagtggt ggccctgtggcagccagcag2041 ccccgcacca aggcctgcca catgcccttg caaaacatgg ggcctgggagaacccgcaca2101 ctgctctggc gtttgcagac tacgcaaacc tgtgttttaa agagttgggtcactgggtca
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權利要求
1. Klotho腺相關病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應用。
全文摘要
本發明為一種Klotho腺相關病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應用。通過實驗研究結果顯示，通過Klotho基因轉導可以控制SHR大鼠血壓進一步升高，減輕高血壓心臟病心臟損害即可以保護SHR大鼠心臟，至少可以持續12周，Klotho腺相關病毒完全可以作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物對高血壓及相關心血管疾病進行治療。
文檔編號A61K48/00GK102886051SQ20121027913
公開日2013年1月23日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者馬厚勛, 李寶善, 王艷嬌, 吳平, 鄧明洪, 羅玉梅, 李運奎, 周婷, 楊秋晨, 鄧小琴 申請人:重慶醫科大學附屬第一醫院