專利名稱：納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽作為制備癌癥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于腫瘤過繼免疫治療(生物治療)領域,主要涉及一種復合刺激劑納曲酮(LDN)聯合蛋氨酸腦腓肽在體外刺激從患者血液中分離的淋巴細胞，待培養增殖到相當數量后，回輸體內作為治療癌癥藥物的應用。
背景技術：
腫瘤的生物治療是采用細胞生物學和分子生物學技術對腫瘤進行主動攻擊性治療。通過激活病人的自體免疫系統識別和殺傷腫瘤細胞，達到根治腫瘤的目的。而且沒有任何副作用。此項技術逐漸在各種有益的探索中脫穎而出，成為繼手術、放療、化療之后的第四種治療腫瘤的模式。腫瘤的生物治療是在明確提出了生物應答調節劑概念的基礎上產 生的，在各種實際運用中，又出現五大支柱性生物治療技術BRM細胞因子技術、免疫活性細胞過繼性輸注技術、單克隆抗體及其偶聯物技術、腫瘤疫苗技術、基因治療技術，它們的出現標志著腫瘤生物治療體系的形成。有些專家對這種技術稱作腫瘤免疫治療技術。既是通過調整或增強機體本來就有的內在防御機制來抑制或殺傷腫瘤細胞，或通過抑制腫瘤細胞轉化來降低腫瘤的惡性度。具體也可分為1，外源給予免疫刺激劑或調節劑，糾正免疫功能低下狀態。2，直接給予具有免疫效應的細胞或具有抗癌活性的細胞因子，或采用過繼性細胞免疫治療。3，增強腫瘤細胞對機體抗腫瘤效應的敏感性。4，增強機體由于腫瘤對機體所致損傷的耐受。5，抑制腫瘤細胞轉化或通過基因治療使腫瘤細胞凋亡。體細胞治療是最常用的一種療法,是通過分離獲取的患者自身免疫細胞,在細胞因子的誘導下，大量擴增出具有高度抗腫瘤活性的免疫細胞，再回輸到患者體內，此類細胞包括LAK細胞、TIL細胞、CIK細胞、DC細胞、⑶3AK細胞、AKM細胞等，此療法對惡性黑色素瘤、腎癌、非何杰金氏淋巴瘤等多種腫瘤及癌性胸腹水具有很好的療效，且毒副反應輕微。細胞因子是一類由活化的免疫細胞(單核/巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等)或間質細胞(血管內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等)所合成、分泌，具有調節細胞生長、分化成熟、調節免疫應答、參與炎癥反應、促進創傷愈合和參與腫瘤消長等功能的小分子多肽類活性分子。臨床應用較多的主要包括干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-Y )、白介素(IL_2、IL_4、IL-7、IL-12 等)、造血刺激因子(EPO、TPO、G-CSF, GM-CSF, IL-IU IL-3 等)、腫瘤壞死因子(TNF-a )、修復因子(GM1、EGF、BFGF等)。用于白血病、淋巴瘤、實體瘤、病毒感染、造血抑制、放射損傷等的治療。實際上體細胞療法與細胞因子療法常常具有互補性，更多的采取聯合應用的方式。如CIK/IL-2聯用、TIL/IL-2聯用、LAK/IL-2聯用、DC/IL-2/IFN-Y聯用、AKM/IFN- Y聯用、IL-2/IFN-a/TNF-a聯用，特別是可以用于造血干細胞定向分化擴增，目前這些治療方法已經能夠應用于臨床工作中，但是，近30年的臨床應用證明腫瘤生物治療方法有效，但是療效沒有突破。1975年Hughes等從豬腦抽提液中分離的、具有內源性嗎啡樣活性的蛋氨酸腦啡肽。后來研究發現是由腎上腺產生的前激素和前腦啡肽衍生來，釋放入血，由五個氨基酸構成的五肽。正常體內含量極低，每毫升血衆50-150pg。
蛋氨酸腦啡肽是一種神經肽，是連接神經和免疫兩個系統重要的轉導信號分子之一。能夠和阿片受體結合而使人或動物(類似內啡肽)產生鎮定和止痛作用，并且有直接抑制腫瘤生長的功能。后繼研究發現正常的T淋巴細胞，樹突狀細胞，巨噬細胞，自然殺傷細胞(NK)含有阿片受體。大量研究證明蛋氨酸腦啡肽對免疫系統具有如下作用增加T淋巴細胞活性，增加⑶2，⑶4，⑶8等受體分子的表達，特別是增加⑶4分子的表達，增加T細胞玫瑰花節形成率，增加NK細胞活性，增加有絲分裂素誘導的細胞增殖，增加單核細胞(巨噬細胞)和中性粒細胞的趨化作用，對樹突狀細胞的成熟和活性有明顯的促進作用。還可以增加Y-干擾素，白介素-2和腫瘤壞死因子等多種細胞因子的產生。在與白細胞介素-2比較時顯示出，用量小，副作用小，活性高，安全性高。

發明內容
I、發明目的
本發明提供一種納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽作為制備癌癥藥物中的應用，其目的在于解決現有的放化療方法副作用大、療效差，以及目前采用的腫瘤生物療法，療效一般，沒有突破性等方面存在的問題。2、技術方案本發明是通過以下技術方案來實現的I、納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽作為制備癌癥藥物中的應用，所述納曲酮學名為17-環丙甲基-4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，分子式C20H23N04，分子量341. 4，為人工合成鹽酸鹽白色粉末；蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，為采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量760 780 ;抽取患者靜脈血液20 100毫升，力口2毫升125單位/ml肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到培養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，調整納曲酮濃度為KT1Io,克分子/升，蛋氨酸腦啡肽的使用濃度范圍為10_510_16克分子/升，在35 40°C用7%C02培養3 10天，待檢測到細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，確定增殖后作為回輸體內的藥物。抽取靜脈血液，加125單位/ml肝素抗凝，血液與肝素的體積比為10: I。該應用還適用于免疫功能低下者或需要免疫治療的患者。回輸的淋巴細胞中包含有⑶4+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，Y δ T細胞和樹突狀細胞。3、優點及效果本發明具有如下優點主要涉及納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽在刺激免疫細胞增殖回輸治療癌癥中的應用，利用納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽對樹突狀細胞和CD4+T細胞的明顯的促進作用，在體外刺激淋巴細胞亞群活性，形成具有突破性療效的腫瘤生物治療新方法。具有用量小，副作用小，活性高，安全性高等優點。(特別是能促進樹突狀細胞增殖，抑制調節性T細胞增殖，這些都是現行免疫回輸療法不具備的)


圖I為患者納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽刺激前后樹突狀細胞成熟比較圖；圖2是患者樹突狀細胞增殖標志分子變化曲線圖；圖3是電子顯微鏡下患者納曲酮結合蛋氨酸腦啡肽刺激前后樹突狀細胞成熟比較圖。
具體實施例方式經過系統研究了納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽對樹突狀細胞和CD4+T細胞作用，做了對多例免疫系統遭受放化療損傷的癌癥患者免疫系統作用觀察，在此基礎上形成了具有突破性療效的新的腫瘤免疫治療方法的藥物。納曲酮(LDN)學名為17-環丙甲基-4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4，為人工合成鹽酸鹽白色粉，調整納曲酮濃度為 10 1^lO 10克分子/升。蛋氨酸腦啡肽在刺激免疫細胞增殖回輸治療癌癥中的應用,所述蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met,可作為刺激劑單獨使用或者與干擾素或白細胞介素-2聯合使用，體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內用于臨床治療癌癥。蛋氨酸腦啡肽為采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量760 780。蛋氨酸腦啡肽的使用濃度范圍為1(Γ5 1(Γ16克分子/升,淋巴細胞培養3 10天，待到細胞生長到IO8/毫升時回輸。體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內是指抽取靜脈血液，加125單位/ml肝素抗凝，血液與肝素的體積比為10:1，分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到營養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，使納曲酮的濃度為KT1Io,克分子/升，蛋氨酸腦啡肽的濃度為10_5 10_16克分子/升，在35 40°C用7%C02培養3 10天，待細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，確定增殖后作為治療癌癥的藥物回輸體內。所述回輸體內的方法可以用于癌癥患者、免疫功能低下者或需要免疫治療的患者?；剌敿毎邪孝?+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，Y δ T細胞和樹突狀細胞。實施技術路線患者外周血-------分離淋巴細胞------不同濃度蛋氨酸腦啡肽刺激------MTS
法測定細胞增殖--------用單克隆抗體結合流式細胞術檢測淋巴細胞亞群——確定增
殖------回輸體內。具體為抽取病人靜脈血液20 100毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到培養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，在35 40°C用7%C02培養3 10天，待到細胞生長到IO8/毫升時檢測，回輸體內。下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明實施例I :納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽在刺激免疫細胞增殖回輸治療癌癥中的應用，所述納曲酮(LDN)學名為17-(環丙甲基)-4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4為人工合成鹽酸鹽白色粉。所述蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量為760，二者作為聯合刺激劑，體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內用于臨床治療癌癥，即抽取靜脈血液20毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到營養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，使納曲酮的濃度為10_6克分子/升和10_5克分子/升的蛋氨酸腦啡肽，在35°C用7%C02培養淋巴細胞10天，待細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，回輸細胞中包含有⑶4+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，γ δ T細胞和樹突狀細胞，確定增殖后回輸體內。癌癥患者接受治療后免疫系統指標穩定。實施例2 納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽在刺激免疫細胞增殖回輸治療癌癥中的應用，所述納曲酮學名為17_(環丙甲基)_4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，白色粉末，分子 式C20H23N04，分子量341. 4為人工合成鹽酸鹽白色粉。所述蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量為760，二者作為聯合刺激劑，體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內用于臨床治療癌癥，即抽取靜脈血液50毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到營養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，使納曲酮的濃度為10_1(1克分子/升和10_16克分子/升的蛋氨酸腦啡肽，在40°C用7%C02培養淋巴細胞3天，待細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，回輸細胞中包含有⑶4+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，γ δ T細胞和樹突狀細胞，確定增殖后回輸體內。癌癥患者接受治療后免疫系統指標穩定。實施例3 納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽在刺激免疫細胞增殖回輸治療癌癥中的應用，所述納曲酮學名為17_(環丙甲基)_4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4為人工合成鹽酸鹽白色粉。所述蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量為760，二者作為聯合刺激劑，體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內用于臨床治療癌癥，即抽取靜脈血液100毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到營養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，使納曲酮的濃度為10_6克分子/升和10,克分子/升的蛋氨酸腦啡肽，在37°C用7%C02培養淋巴細胞6天，待細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，回輸細胞中包含有⑶4+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，γ δ T細胞和樹突狀細胞，確定增殖后回輸體內。癌癥患者接受治療后免疫系統指標穩定。實施例4:納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽在刺激免疫細胞增殖回輸治療癌癥中的應用，所述納曲酮學名為17_(環丙甲基)_4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4為人工合成鹽酸鹽白色粉。所述蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量為760，二者作為聯合刺激劑，體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內用于臨床治療，即抽取靜脈血液80毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到營養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，使納曲酮的濃度為10_3克分子/升和10_12克分子/升的蛋氨酸腦啡肽，在38°C用7%C02培養淋巴細胞7天，待細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，回輸細胞中包含有⑶4+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，γ δ T細胞和樹突狀細胞，確定增殖后回輸體內。免疫功能低下者接受治療后，免疫系統指標恢復近正常值。實施例5 納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽在刺激 免疫細胞增殖回輸治療癌癥中的應用，所述納曲酮學名為17_(環丙甲基)_4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4為人工合成鹽酸鹽白色粉。所述蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量為760，二者作為聯合刺激劑，體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內用于臨床治療，即抽取靜脈血液20毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到營養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，使納曲酮的濃度為10_6克分子/升和10_8克分子/升的蛋氨酸腦啡肽，在36°C用7%C02培養淋巴細胞5天，待細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，回輸細胞中包含有⑶4+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，γ δ T細胞和樹突狀細胞，確定增殖后回輸體內。需要免疫治療的患者接受治療后，免疫系統指標恢復近正常值。要求保護單獨使用蛋氨酸腦啡肽作為刺激劑。實施例6 抽取病人靜脈血液20毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到培養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，使納曲酮的濃度為10_8克分子/升和10_14克分子/升蛋氨酸腦啡肽，在37°C用7%C02培養3 10天，待到細胞生長到IO8/毫升時，電鏡結合流式技術檢測樹突狀細胞，結果如下( I)患者蛋氨酸腦啡肽刺激前后樹突狀細胞成熟比較；如圖I中所示為患者蛋氨酸腦啡肽刺激前后樹突狀細胞成熟比較圖，左側為蛋氨酸腦啡肽刺激前的樹突狀細胞圖，右側為蛋氨酸腦啡肽刺激后的樹突狀細胞圖。納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽刺激后細胞表面關鍵分子表達顯著增加，結合圖I證明納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽刺激后樹突狀細胞明顯成熟。圖2為用流式細胞技術檢測培養刺激前后的細胞表面分子變化；圖3是電子顯微鏡下患者納曲酮結合蛋氨酸腦啡肽刺激前后樹突狀細胞成熟比較圖。(2)患者外周血淋巴細胞亞群比較分析；五名癌癥患者，其中肺癌I例，腸癌2例，肝癌I例，胰腺癌I例。每人抽取靜脈血液20毫升，加2毫升125單位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到培養瓶中，加入一定的納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，在37°C用7%C02培養3 10天，待到細胞生長到IO8/毫升時，用流式技術結合單克隆抗體檢測外周血淋巴細胞亞群變化，取得平均值如下
權利要求
1.納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽作為制備癌癥藥物中的應用，所述納曲酮學名為17-環丙甲基-4，5-環氧-3，14-二羥基嗎啡烷-6-酮，分子式:C20H23N04，分子量:341. 4，為人工合成鹽酸鹽白色粉末；蛋氨酸腦啡肽分子結構為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，為采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量760 780 ;抽取患者靜脈血液20 100暈升,加2暈升125單位/ml肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，計數細胞，調整細胞濃度在IO5/毫升，轉移到培養瓶中，加入納曲酮和蛋氨酸腦啡肽，調整納曲酮濃度為KT1Krw克分子/升，蛋氨酸腦啡肽的使用濃度范圍為10_5 10_16克分子/升，在35 40°C用7%C02培養3 10天，待檢測到細胞生長到IO8/毫升時，檢測淋巴細胞亞群，確定增殖后作為回輸體內的藥物。
2.根據權利要求I所述的納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽作為制備癌癥藥物中的應用，其特征在于抽取靜脈血液，加125單位/ml肝素抗凝，血液與肝素的體積比為10: I。
3.根據權利要求I所述的納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽作為制備癌癥藥物中的應用，其特征在于該應用還適用于免疫功能低下者或需要免疫治療的患者。
4.根據權利要求I所述的納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽作為制備癌癥藥物中的應用，其特征在于回輸的淋巴細胞中包含有⑶4+T細胞，⑶8+T細胞，NK細胞，NET細胞，γ δ T細胞和樹突狀細胞。
全文摘要
本發明涉及納曲酮聯合蛋氨酸腦啡肽在刺激免疫細胞增殖作為藥物回輸治療癌癥的應用，將納曲酮蛋氨酸腦啡肽作為刺激劑，體外刺激免疫細胞增殖后回輸體內用于臨床治療，利用蛋氨酸腦啡肽對樹突狀細胞和CD4+T細胞的明顯的促進作用，在體外刺激淋巴細胞亞群活性，形成具有突破性療效的腫瘤生物治療新方法。具有用量小，副作用小，活性高，安全性高等優點。
文檔編號A61P35/00GK102772784SQ201210290150
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者單風平, 尼古拉菠蘿尼科夫, 諾瑞.格瑞芬 申請人:單風平