植物微小核糖核酸的提取、制備及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種植物微小核糖核酸的提取、制備及其應用。具體地，本發明公開了一種分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物及其用途，所述的植物功能性microRNA是來源于某一植物的內源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因的功能。
【專利說明】植物微小核糖核酸的提取、制備及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物領域。具體地，本發明涉及提取植物HIiCT0RNA的方法及其應用。【背景技術】
[0002]微小核糖核酸(microRNA、miRNA或miR)是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子。它們廣泛存在于動植物細胞中，在進化上高度保守。MicroRNA通過識別靶信使RNA(mRNA)的3’端非翻譯序列，與之不完全互補，從而抑制相應蛋白質的翻譯。作為mRNA強有力的調節因子，microRNA與生理活動密切相關，涉及生物個體發育、組織分化、細胞調亡及能量代謝等生命活動；同時，microRNA也與許多疾病的發生和發展存在緊密聯系。
[0003]目前，對植物microRNA研究都集中在microRNA對植物本身的調控作用，包括對植物生長發育、信號轉導和逆境脅迫活動的作用。對研究成果的應用則集中于對植物物種的改良，如調節農作物在其食用部分對營養元素的表達。
[0004]專利PCT/CN2010/000677公開了源自水稻的MIR164對植株根系的調控作用，提出構建包括MIR164序列的核酸片段，并將其轉入水稻植株，從而獲得根系比普通水稻強大的轉基因水稻。專利PCT/IB2010/055600公開了上調包括MIR156的若干microRNAs可提高植物對環境脅迫因素的耐受能力，進而提高植物的生物質、活力和產量。
[0005]目前，現有的研究僅限于植物HiiCT0RNA對植物本身生理活動的調控作用，但植物microRNA對動物的生理活動的調控作用以及對植物microRNA的提取還有待研究。

【發明內容】

[0006]本發明的目的之一是提供一種具有調控非植物靶基因的功能的植物microRNA或含有所述microRNA的植物提提取物及其制法和用途。
[0007]本發明的另一目的是提供一種鑒定植物功能性microRNA的方法。
[0008]在本發明第一方面中，提供了一種分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，所述的植物功能性microRNA是來源于某一植物的內源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因的功能。
[0009]在另一優選例中，所述的調控包括抑制(下調)靶基因的表達、促進(上調)靶基因的表達。
[0010]在另一優選例中，所述的非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因。
[0011]在另一優選例中，所述的植物包括:藥用植物、果蔬植物、觀賞植物；更佳地包括:金銀花、菘藍、草大青、馬藍、胡楊、豇豆、棉花、大白菜或馬鈴薯。
[0012]優選地，所述植物為金銀花、菘藍、草大青、馬藍或胡楊；更優選地，所述植物為金銀花。[0013]在另一優選例中，所述的植物功能性microRNA是所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中富含的microRNA種類(如豐度列前20位，更佳地前10位的microRNA種類)。
[0014]在另一優選例中，所述的植物功能性microRNA包括選自下組的一種或多種:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440, MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916、MIR818d、MIR159e、MIR159c、MIRl56 j\ MIR1432、MIR166k、MIR167b、MIR396c、MIR156e、MIR169k、MIR167c、MIR160d、MIR399a、MIR156d、MIR160e、MIR169n、MIR1661、MIR159f、MIR166c、MIR159b、MIR166j、MIR1671、MIR169c、MIR164c、MIR167j、MIR167g、MIR160c、MIR399e、MIR399b、MIR529b、MIR164e、MIR166d、MIR166h、MIR164b、MIR156f、MIR164a、MIR1691、MIR166m、MIR164f、MIR156k、MIR166g、MIR166b、MIR160b、MIR166e、MIR159d、MIR818e、MIR172a、MIR156b、MIR399g、MIR169b、MIR399f、MIR167a、MIR394、MIR156a、MIR1661、MIR167f、MIR319a、MIR156g、MIR166n、MIR399c、MIR160a、MIR159a.1、MIR156c、MIR319b、MIR169o、MIR167h、MIR1561、MIR167d、MIR169a、MIR172d、MIR818b、MIR164d、MIR167e、MIR396b、MIR2914(表 I)。
[0015]在另一優選例中，所述的植物提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物。
[0016]在另一優選例中，所述的植物提取物包括植物的枝、葉、根、花、果和/或莖的提取物。
[0017]在本發明第二方面中，提供了一種如本發明第一方面所述的分離的植物功能性mi croRNA或含所述植物功能性mi croRNA的提取物的用途,它(a)用于制備調控非植物革巴基因的組合物；或(b)用于制備治療非植物靶基因相關疾病的藥物。
[0018]在另一優選例中 ，所述非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因。
[0019]在另一優選例中，所述的非植物靶基因是病原體(包括細菌、病毒、衣原體等)的基因。
[0020]在另一優選例中，所述非植物靶基因相關疾病包括:腫瘤(如肝癌、肺癌);急慢性傳染病(如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等的病毒性疾病，如結核、細菌性肺炎等的細菌性疾病，以及病原微生物導致的急慢性傳染病)；其它急慢性疾病(如呼吸系統疾病、免疫系統疾病、血液與造血系統疾病、如心腦血管疾病的循環系統疾病、內分泌系統代謝性疾病、消化系統疾病、神經系統疾病、泌尿系統疾病、生殖系統疾病和運動系統疾病)。[0021 ] 在另一優選例中，所述的植物功能性microRNA包括MIR2911。更佳地，所述的藥物用于治療病毒性感冒。
[0022]在本發明第三方面中，提供了一種組合物，其包含(a)藥學上可接受的載體或食品學上可接受的載體以及(b)本發明第一方面所述的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物。
[0023]在另一優選例中，所述的組合物由或基本上由組分(a)和(b)構成。
[0024]在另一優選例中，組分(b)的含量為組合物總重量0.01_99wt%，較佳地0.l-90wt% (按 microRNA 計)。
[0025]在另一優選例中，所述組合物包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。
[0026]在另一優選例中，所述組合物的制備方法包括步驟:將所述的植物功能性microRNA或含所述功能性microRNA的植物提取物與藥學上或食品學上可接受的載體混合，從而形成所述的組合物。
[0027]在另一優選例中，所述的植物功能性microRNA來自以下植物:藥用植物、果蔬植物、觀賞植物，并且調控選自下組的非植物靶基因:細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因。
[0028]在另一優選例中,所述的植物功能性microRNA來自金銀花、蔣藍、草大青、馬藍或胡楊。更佳地，植物功能性microRNA包括MIR2911。
[0029]在本發明第四方面中，提供了一種體外非治療性調控非植物靶基因表達的方法，其中，非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因，所述方法包括步驟:在本發明第一方面所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下，培養含所述靶基因的生物材料，從而調控所述非植物靶基因的表達。
[0030]在另一優選例中，所述的靶基因是病原體(包括細菌、病毒、衣原體等)的基因。[0031 ] 在另一優選例中，所述的生物材料包括病毒、細胞、組織。
[0032]在另一優選例中，所述的植物功能性microRNA來自以下植物:藥用植物、果蔬植物、觀賞植物。
[0033]在另一優選例中，所述的植物功能性microRNA來自金銀花、菘藍、草大青、馬藍或胡楊。更佳地，植物功能性microRNA包括MIR2911。
[0034]在本發明第五方面中，提供了一種植物功能性microRNA的鑒定方法，其中所述植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因的功能，所述方法包括步驟:
[0035](I)提供某一植物的提取物；
[0036](2)檢測所述提取物中植物內源性microRNA的種類或水平；
[0037](3)將被檢測到的植物microRNA的序列與非植物靶基因進行比對和分析，從而鑒定出具有調控非植物靶基因的功能的植物功能性mi croRNA。
[0038]在另一優選例中，所述的非植物靶基因包括基因數據庫中的基因。
[0039]在另一優選例中，所述非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因。
[0040]在另一優選例中，所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0041]在另一優選例中，所述的植物包括藥用植物，果蔬植物。
[0042]在另一優選例中，在步驟(3)中挑選提取物中豐度列前20位(更佳地前10位)的microRNA種類進行比對和分析。
[0043]在另一優選例中，在步驟(3)中挑選比值Lm/La≥130% (較佳地≥150% ;更佳地≥200%)的植物microRNA種類進行對比和分析，其中Lm為某一植物microRA在提取物中的豐度(或水平)，La為所述植物總microRNA的平均豐度(或水平)。
[0044]在本發明第六方面中，提供了一種由本發明第五方面所述的方法所鑒定出的植物功能性microRNA分子。
[0045]在另一優選例中，所述microRNA分子包括MIR2911。
[0046]在本發明第七方面中，提供了一種制備組合物的方法，包括步驟:
[0047]人工合成本發明第六方面所述的植物功能性microRNA分子；以及
[0048]將所述的植物功能性microRNA分子與藥學上或食品學上可接受的載體混合，從而形成組合物。
[0049]在本發明第八方面中，提供了一種microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，用于制備治療病毒性感冒的藥物。
[0050]在另一優選例中，所述的提取物(未濃縮或濃縮)中含0.01_100nM(較佳地0.1-20ηΜ)的 MIR2911。
[0051]在本發明第九方面中，提供了一種預防或治療疾病的方法，其中所述疾病是與非植物靶基因相關的疾病，所述方法包括步驟:給需要的對象施用本發明第一方面所述分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物、或本發明第三方面所述的組合物，從而預防或治療所述的疾病，其中所述的植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因的功能。
[0052]在另一優選例中，所述的對象包括哺乳動物(如人)。
[0053]在另一優選例中，所述的非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因。
[0054]在另一優選例中，所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0055]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1顯示植物microRNA在金銀花水提液中Solexa測序結果。
[0057]圖2A是小鼠灌胃金銀花水提液后，金銀花microRNA在不同時間點血清中表達量的Real-time PCR結果。檢測時間點為Oh (O小時)、2h(2小時)、4h(4小時)、6h(6小時)。
[0058]圖2B是小鼠灌胃金銀花水提液后，金銀花microRNA在不同時間點肝臟和肺中表達量的Real-time PCR結果。檢測時間點為Oh (O小時)、5h (5小時)、IOh (10小時)、15h (15小時)、20h(20小時)、25h(25小時)。
[0059]圖3顯示MIR2911預測祀基因的序列分析結果。mfe表示候選祀基因的最低折疊自由能，mfe絕對值越大，候選靶基因與Peu-MIR2911序列匹配度越高。
[0060]圖4顯示熒光素酶檢測預測靶基因的結果。預測基因包括ADV基因、HPIV基因、HlNl基因、H5N1基因。
[0061]圖5A是利用Real-time PCR技術檢測病毒基因ADV5在MDCK細胞中的含量。
[0062]圖5B是利用Real-time PCR技術檢測病毒基因HlNl在MDCK細胞中的含量。
[0063]圖5C是利用Real-time PCR技術檢測病毒基因H5N1在MDCK細胞中的含量。
[0064]圖5A、圖5B和圖5C中，“未感染”代表未侵染流感病毒的細胞；“感染未處理”代表侵染流感病毒且未用任何藥物處理的細胞；“MIR2911”代表侵染流感病毒且用MIR2911處理的細胞；“NC”代表侵染流感病毒且用MIR2911的無義序列RNA處理的細胞；“達菲”代表侵染流感病毒且用達菲(奧塞米韋，特異性流感病毒神經氨酸酶抑制藥)處理的細胞。
[0065]圖6顯示MIR2911在轉染MIR2911的HEK 293T細胞分泌的載有MIR2911的細胞微粒子中的Real-time PCR結果。以未轉染MIR2911的HEK 293T細胞分泌的細胞微粒子作為對照MV。[0066]圖7A是流感病毒ADV在載有MIR2911的細胞微粒子處理的HEK 293T細胞中的表達量。[0067]圖7B是流感病毒HlNl在載有MIR2911的細胞微粒子處理的HEK 293T細胞中的表達量。[0068]圖7A和圖7B中，以感染流感病毒后不作處理作為空白對照和未載有MIR2911的細胞微粒子處理的ffiK 293T細胞作為陰性對照。[0069]圖8A顯示小鼠飲用金銀花水提液、金銀花水提液+anti_MIR2911 ( 口服組)、灌肺金銀花水提液+ant1-MIR2911(灌肺組)后，感冒病毒ADV在肺表達的Real-time PCR結果。[0070]圖SB顯示小鼠飲用金銀花水提液、金銀花水提液+anti_MIR2911 ( 口服組)、灌肺金銀花水提液+ant1-MIR2911 (灌肺組)后，感冒病毒HlNl在肺表達的Real-time PCR結果。[0071]圖9顯示服用金銀花水提液后，人血液中MIR2911的Real-time PCR結果。[0072]檢測時間點為0h(0小時)、lh(l小時)、2h(2小時)、3h(3小時)、4h(4小時)、5h(5小時)、6h (6小時)。
【具體實施方式】[0073]本發明人通過長期而深入的研究，意外地發現一種穩定存在于植物提取物中的可分離的植物內源性microRNA或含有所述microRNA的植物提取物,可用于調控動物體內所述內源性miCToRNA靶基因的表達，進而用于調控動物的生理病理活動。因此，可用于指導制備藥物或功能性食物等。在此基礎上，發明人完成了本發明。[0074]如本文所用，“osa”表示水稻；“peu”表示胡楊。[0075]分離的植物功能性microRNA[0076]本發明所述的植物功能性microRNA為所述植物內源性的microRNA,可穩定存在于該植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中。優選為所述的植物功能性microRNA是所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中富含的microRNA種類(如豐度列前20位，更佳地前10位的microRNA種類)。此外，本發明的microRNA包括各種形式，例如pr1-microRNA、pre-mi croRNA 以及 microRNA 成熟體。[0077]所述植物功能性microRNA的例子包括(但并不限于)選自表1的一種或多種microRNA,尤其是選自下組的一種或多種:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916。[0078]在另一優選例中，所述的植物包括藥用植物、果蔬植物、觀賞植物；較佳地包括金銀花、菘藍、草大青、馬藍、胡楊、豇豆、棉花、大白菜或馬鈴薯；更佳地，所述植物為金銀花、菘藍、草大青、馬藍或胡楊；最佳地，所述植物為金銀花。[0079]本發明所述含所述植物功能性microRNA的提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物，例如植物的枝、葉、根、花、果和/或莖的提取物。[0080]提取方法(植物提取物的制法)[0081]本發明所述的植物microRNA的提取方法主要采用溶劑提取法，即采用溶劑從植物中提取其microRNA。其中，所述的溶劑包括水、親水性溶劑、或其組合。所述組合包括:在水中添加適量的親水性溶劑或在親水性溶劑中添加適量的水。應理解，溶劑中還可添加適量的輔助試劑，如pH調節劑(如酸或堿)等。
[0082]提取可以在任何適宜的溫度(如常溫~溶劑回流的溫度)下進行，優選采用浸潰法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續提取法等。
[0083]在提取過程中，可對植物進行預處理，例如將植物粉碎或進行酶處理(如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、以及夏合酶)等；也可對提取的混合物進行后處理，如將植物用水進行提取后，可在提取后的混合物中加入親水性溶劑(如乙醇等)，使得混合物經陳化沉淀。
[0084]提取后得到的液體物可直接使用，也可進行過濾、濃縮、干燥(如凍干)等處理后制得固體物，然后再使用。
[0085]優選地，本發明所述的植物microRNA的提取方法為水提法。
[0086]例如包括步驟:取適量金銀花，粉碎后，在一定溫度(如室溫~回流)下，將金銀花粉末置于水浴中，加熱若干次(如I~5次)，每次保溫一段時間(如0.1~10小時)，收集液體，備用。
[0087]或包括步驟:取適量金銀花，粉碎后，在一定溫度(如室溫~回流)下，將金銀花粉末置于水浴中，加熱若干次(如I~5次)，每次保溫一段時間(如0.1~10小時)，將提取液濃縮至一定體積后，加入適量乙醇，沉淀出大部分的粘液質，過濾，收集濾液，備用。
[0088]檢測
[0089]對植物進行提取后，收集植物提取物,檢測提取物中植物microRNA的種類及其含量。所用的測試方法可以是本領域常規方法，例如(但不限于)=Solexa測序技術，Real-time PCR、RT-PCR、微·陣列芯片、原位雜交、Northern Blotting、恒溫滾環擴增、基于共軛聚合物的microRNA檢測等。
[0090]所述Solexa測序技術方法,優選包括步驟:
[0091 ] 收集金銀花組織或湯藥樣本；
[0092]通過Trizol試劑提取樣本總RNA ；
[0093]進行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；
[0094]將接頭引物(adaptor primer)酶聯在小RNA分子的3’與5，端；
[0095]純化的DNA直接用于集群生成,利用Illumina Genome Analyzer進行測序分析。
[0096]Real-time PCR方法,優選包括步驟:
[0097]提取樣本中總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；
[0098]用植物mi croRNA設計引物；
[0099]加入TaqMan探針或者熒光染料進行PCR反應；
[0100]檢測樣本中植物microRNA的量的變化。
[0101]鑒定
[0102]本發明提供了一種植物功能性microRNA鑒定方法，其中所述植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因的功能，包括步驟:
[0103](I)提供某一植物(包括藥用植物，果蔬植物)的提取物；
[0104](2)檢測所述提取物中植物內源性microRNA的種類或水平；
[0105](3)將被檢測到的植物microRNA的序列與非植物靶基因進行比對和分析，從而鑒定出具有調控非植物靶基因的功能的植物功能性mi croRNA。[0106]在另一優選例中，所述的非植物靶基因包括基因數據庫中的基因。優選地，所述非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因；或所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0107]在另一優選例中，在步驟(3)中挑選提取物中豐度列前20位(更佳地前10位)的microRNA種類進行比對和分析。
[0108]在另一優選例中，在步驟(3)中挑選比值Lm/La≥130% (較佳地≥150% ;更佳地≥200%)的植物microRNA種類進行對比和分析，其中Lm為某一植物microRNA在提取物中的豐度(或水平)，La為所述植物總microRNA的平均豐度(或水平)。
[0109]由所述方法鑒定出的植物功能性microRNA分子包括MIR2911。
[0110]用途 [0111]本發明所述植物功能性microRNA或包含所述植物功能性microRNA的植物提取物具有如下多個應用:
[0112]一、指導功能性組合物的開發或制造
[0113]本發明所述組合物的活性成分為所述植物功能性microRNA或包含所述植物功能性microRNA的植物提取物。其中，所述的植物功能性microRNA (如MIR2911等)具有調控非植物靶基因的功能。可用于(a)制備調控非植物靶基因的組合物；或(b)制備治療非植物靶基因相關疾病的藥物。其中，所述的調控包括抑制(下調)靶基因的表達、促進(上調)靶基因的表達。
[0114]在另一優選例中，所述非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因；或所述的非植物靶基因是病原體(包括細菌、病毒、衣原體等)的基因。
[0115]在另一優選例中，所述非植物靶基因相關疾病包括:腫瘤(如肝癌、肺癌)；急慢性傳染病(如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等的病毒性疾病，如結核、細菌性肺炎等的細菌性疾病，以及病原微生物導致的急慢性傳染病)；其它急慢性疾病(如呼吸系統疾病、免疫系統疾病、血液與造血系統疾病、如心腦血管疾病的循環系統疾病、內分泌系統代謝性疾病、消化系統疾病、神經系統疾病、泌尿系統疾病、生殖系統疾病和運動系統疾病)。
[0116]組合物
[0117]本發明所述組合物(包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物)可包含:(a)藥學上可接受的載體或食品學上可接受的載體；以及(b)活性成分。
[0118]優選地，所述的組合物由或基本上由組分(a)和(b)構成。
[0119]在另一優選例中，組分(b)的含量為組合物總重量0.01_99wt%，較佳地0.l-90wt% (按 microRNA 計)。
[0120]所述組合物的制備方法包括步驟:將所述的植物功能性microRNA或含所述功能性microRNA的植物提取物與藥學上或食品學上可接受的載體混合，從而形成所述的組合物。
[0121]現以藥物組合物為例，對組合物作進一步說明:本發明的藥物組合物包含安全有效量范圍內的活性成分及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是:活性成分的量足以明顯改善病情，而不至于產生嚴重的副作用。通常，藥物組合物含有l-2000mg活性成分/劑，更佳地，含有10-200mg活性成分/劑。或者含有0.01~100微摩爾活性成分/劑，較佳地為0.1~10微摩爾/劑；較佳地，所述的“一劑”為一口服液。[0122]“藥學上可以接受的載體”指的是:一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能和本發明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥學上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫? )、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調味劑、穩定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。
[0123]本發明組合物的給藥方式包括:口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道給藥。
[0124]本發明組合物的劑型包括:片劑、膠囊劑、粉劑、丸劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液、混懸液、乳劑、混懸劑、噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑、揮發性液體、注射液、粉針劑、外用溶液劑、洗劑、澆淋劑、搽劑、巴布膏劑、膏藥、橡膠膏劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、滴眼劑、滴鼻劑、眼用軟膏劑、含漱劑、舌下片劑或栓劑。 [0125]優選地，本發明提供了一種microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，用于制備治療病毒性感冒的藥物。較佳地，所述的提取物(未濃縮或濃縮)中含0.01-1OOnM (較佳地 0.1_20ηΜ)的 MIR2911。
[0126]二、指導人工合成植物功能性microRNA
[0127]通過本發明所述的方法鑒定出植物中(尤其是植物提取中)存在的植物功能性microRNA,可直接指導技術人員對所述microRNA進行人工合成,從而提高所述的microRNA的生產。并將合成的植物功能性microRNA分子與藥學上或食品學上可接受的載體混合，從而形成組合物。
[0128]三、體外非治療性調控非植物靶基因表達
[0129]在本發明所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下，培養含非植物靶基因(如細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因)的生物材料(包括病毒、細胞、組織)，從而實現體外調控所述非植物靶基因的表達
[0130]在另一優選例中，所述的靶基因是病原體(包括細菌、病毒、衣原體等)的基因。
[0131]在另一優選例中，所述的植物功能性microRNA來自以下植物:藥用植物、果蔬植物、觀賞植物；較佳地，來自金銀花、菘藍、草大青、馬藍或胡楊；更佳地，所述植物功能性microRNA 包括 MIR2911。
[0132]四、疾病預防或治療方法
[0133]給需要的對象(如哺乳動物或人))施用本發明所述分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物、或本發明所述的組合物，從而實現預防或治療與非植物靶基因相關的疾病，其中所述的植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因(包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因)的功能。
[0134]在另一優選例中，所述的非植物靶基因是病原體基因。
[0135]發明人通過對植物功能性microRNA及其進入動物體內后的存在形式、遞送途徑和功能等一系列研究，1.形成了一套高效、穩定地提取植物功能性micix)RNA的方法，提供了一種包含植物功能性microRNA的植物提取物。2.發現了通過多種途徑(如攝食或靜脈注射等)，植物(如金銀花等)功能性microRNA可進入動物體并在血液中富集,并調節非植物靶基因，進而參與動物體(如人)的生理病理活動。3.形成了一套鑒定植物功能性microRNA的方法,可用于指導選擇性合成植物功能性microRNA的方法,有利于加快該microRNA的生產；還可用于指導篩選富含植物功能性microRNA的藥材,有利于鑒別藥材的優劣。4.形成了一套指導制造功能性食物或藥物的方法:4.1所述方法利用分離的植物功能性mi croRNA或包含植物功能性mi croRNA的植物提取物或篩選出的富含功能性mi croRNA的植物，可用于制造功能性食物或藥物等組合物；4.2所述方法通過提取植物microRNA并鑒定出植物功能性microRNA，并進行所述植物功能性microRNA的人工合成，然后將人工合成的microRNA用于制造功能性食物或藥物。
[0136]本發明主要優點包括:
[0137]1.提供了一種分離的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物及其用途。所述microRNA為可調控非植物靶基因的表達，具有多種用途(如可作為中草藥有效成分的標準，有利于指導功能性組合物的開發和制造等)。
[0138]2.提供了一種以分離的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物為活性成分的組合物。所述活性成分的作用機理明確，效果顯著，有利于對中醫藥的科學機制的探索，且制法簡單、成本低廉，適合工業化生產。
[0139]3.提供了一種鑒定植物功能性microRNA的方法。
[0140]下面結合具體實施，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0141]實施例1使用Solexa`測序技術檢測穩定存在于金銀花水提液中的植物microRNA
[0142]首先，利用水提法提取金銀花microRNA。取適量(50克)干燥金銀花藥材，在500ml (金銀花質量與水體積比為1:10)水的100°C水浴下加熱0.5小時，提取液在60°C下減壓濃縮至原體積的1/10。收集濃縮及未濃縮金銀花水提液，用于后續實驗。
[0143]然后，使用Solexa測序技術檢測穩定存在于經上述步驟制備出的金銀花水提液中的植物microRNA, Solexa上樣量為IOyg RNA。經測定,未濃縮水提液中總microRNA的濃度約為InM，濃縮水提液中總microRNA濃度約為ΙΟηΜ。
[0144]檢測結果顯示，金銀花水提液中穩定存在多種植物miCToRNA，能被檢測到的包括表1中所列出的85種microRNA,其序列詳見表1。其中MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916 含量較高，MIR2911 的含量最高。具體結果見圖1。表1中其他75種miRNA在提取物中檢測出拷貝數均較低(都在2-1000 之間)。
[0145]表1.穩定存在于金銀花中且可檢測的microRNAs
[0146]
【權利要求】
1.一種分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物,其特征在于，所述的植物功能性microRNA是來源于某一植物的內源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因的功能。
2.如權利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因。
3.如權利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的植物包括:藥用植物、果蔬植物、觀賞植物。
4.如權利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性mi croRNA的提取物，其特征在于，所述的植物功能性microRNA包括選自下組的一種或多種:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916、MIR818d、MIR159e、MIR159c、MIR156j、MIR1432、MIR166k、MIR167b、MIR396c、MIR156e、MIR169k、MIR167c、MIR160d、MIR399a、MIR156d、MIR160e、MIR169n、MIR1661、MIR159f、MIR166c、MIR159b、MIR166j、MIR1671、MIR169c、MIR164c、MIR167j、MIR167g、MIR160c、MIR399e、MIR399b、MIR529b、MIR164e、MIR166d、MIR166h、MIR164b、MIR156f、MIR164a、MIR1691、MIR166m、MIR164f、MIR156k、MIR166g、MIR 166b、MIR160b、MIR166e、MIR159d、MIR818e、MIR172a、MIR156b、MIR399g、MIR169b、MIR399f、MIR167a、MIR394、MIR156a、MIR1661、MIR167f、MIR319a、MIR156g、MIR166n、MIR399c、MIR160a、MIR159a.1、MIR156c、MIR319b、MIR169o、MIR167h、MIR1561、MIR167d、MIR169a、MIR172d、MIR818b、MIR164d、MIR167e、MIR396b、MIR2914。
5.如權利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的植 物提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物。
6.一種權利要求1所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物的用途，其特征在于，(a)用于制備調控非植物靶基因的組合物；或(b)用于制備治療非植物靶基因相關疾病的藥物。
7.一種組合物，其特征在于，包含(a)藥學上可接受的載體或食品學上可接受的載體以及(b)權利要求1所述的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物。
8.—種體外非治療性調控非植物靶基因表達的方法，其中，非植物靶基因包括細菌基因、病毒基因、衣原體基因、酵母基因、動物基因，其特征在于，包括步驟:在權利要求1所述的分離的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下,培養含所述靶基因的生物材料，從而調控所述非植物靶基因的表達。
9.一種植物功能性microRNA的鑒定方法，其中所述植物功能性microRNA具有調控非植物靶基因的功能，其特征在于，包括步驟: (1)提供某一植物的提取物； (2)檢測所述提取物中植物內源性miCToRNA的種類或水平； (3)將被檢測到的植物microRNA的序列與非植物靶基因進行比對和分析，從而鑒定出具有調控非植物靶基因的功能的植物功能性microRNA。
10.一種由權利要求9所述的方法所鑒定出的植物功能性microRNA分子。
11.一種制備組合物的方法，其特征在于，包括步驟: 人工合成權利要求10所述的植物功能性microRNA分子；以及將所述的植物功能性microRNA分子與藥學上或食品學上可接受的載體混合，從而形成組合物。
12.—種microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，其特征在于，用于制備治療病毒性感冒的藥物。
【文檔編號】A61P25/00GK103589721SQ201210291378
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月15日 優先權日:2012年8月15日
【發明者】張辰宇, 張峻峰, 曾科, 董磊 申請人:北京命碼生科科技有限公司