專利名稱：無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌-AC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種吸附無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗。即由吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗聯(lián)合而成的六聯(lián)疫苗，用以預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)及由A、C群腦膜炎球菌引起的腦脊髓膜炎，由b型流感嗜血桿菌引起的中耳炎、腦膜炎等疫苗，屬于疫苗生產(chǎn)制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
傳染病至今仍是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的重要原因，在全世界可通過免疫接種來預(yù)防的疾病已達(dá)三十多種。據(jù)統(tǒng)計(jì)兒童入學(xué)前需接受預(yù)防注射達(dá)21次左右，按現(xiàn)行的免疫程序，免疫計(jì)劃很難安排。改進(jìn)現(xiàn)有疫苗，減少接種針次，提高疫苗的可接受性已勢在必行。聯(lián)合疫苗是新型疫苗研發(fā)的主要方向之一。聯(lián)合疫苗較之單價(jià)疫苗有如下優(yōu)點(diǎn)更少的針次；減少嬰幼兒創(chuàng)傷；提高復(fù)雜的免疫計(jì)劃表的實(shí)施效率，減少漏種；更高的疫苗覆蓋率；更低的空間存放要求；有助于新品種的疫苗增加到免疫計(jì)劃表中。以無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗(DTaP)為基礎(chǔ)的聯(lián)合疫苗是研究的熱點(diǎn)。不少新疫苗的出現(xiàn)，不僅使聯(lián)合疫苗的研制變得日趨迫切，使聯(lián)合疫苗的組成成分越來越多，百日咳(P)、白喉(D)、破傷風(fēng)(TT)等疾病在我國流行范圍廣，危害程度相當(dāng)嚴(yán)重，及時(shí)進(jìn)行疫苗接種，是唯一有效的預(yù)防保護(hù)性措施。侵襲性b型流感嗜血桿菌(Hib)是我國兒童呼吸道感染的重要致病菌，是引起細(xì)菌性腦膜炎和細(xì)菌性肺炎的主要病原菌。肺炎鏈球菌是兒童肺炎，急性中耳炎，腦膜炎，心內(nèi)膜炎，敗血癥的主要致病菌。我國每年有250萬人患肺炎球菌性肺炎，并造成12. 5萬人死亡。腦膜炎奈瑟氏球菌(Nm)是流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦)的主要病因，并且是唯一能引起腦膜炎大流行的細(xì)菌，在許多國家仍然嚴(yán)重威脅大眾健康。據(jù)WHO估計(jì)，全球每年由腦膜炎球菌引起約30萬一35萬的病例。與美國或西歐(發(fā)病率為14 / 10萬)相比，許多發(fā)展中國家發(fā)病率更高(約25 / 10萬)。因此開展吸附無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗是針對已有技術(shù)的拓展與延伸，可為我國兒童預(yù)防傳染病工作提供質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的聯(lián)合疫苗，創(chuàng)造較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。由于流行病分布的差異，國外還未上市包含DTaP、Hib莢膜多糖蛋白結(jié)合物與AC群腦膜炎球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物聯(lián)合的疫苗。目前國內(nèi)外的相關(guān)產(chǎn)品主要有GlaxoSmithKline Biologicals(GSK)公司生產(chǎn)的 Infanrix-Hib ,它是具有 DTaP/Hib 抗原的聯(lián)合疫苗。其中DTaP抗原為液體，Hib抗原為凍干制劑，兩部分抗原分開包裝。GSK還生產(chǎn)DTaP與IPV聯(lián)合的Kinrix 聯(lián)合疫苗，包含DTaP與乙肝抗原和IPV成分的Pediarix 。Sanofi Pasteur生產(chǎn)的Pentacel 是包含DTaP-IPV和Hib抗原的聯(lián)合疫苗。國內(nèi)雖有相似產(chǎn)品的專利(申請?zhí)?00910067156)，但說明書中僅描述流腦多糖生產(chǎn)工藝，過程公開不充分，且尚無產(chǎn)品上市。這是因?yàn)榱?lián)疫苗成分復(fù)雜，疫苗成分的簡單混合可能引起的抗原干擾，導(dǎo)致多糖特異性抗體滴度降低，加之各單組分疫苗混合后質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)難以確立，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)難以達(dá)到等因素所致。因此在疫苗配比過程中，需要長期疫苗生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的積累與國外臨床研究的反饋，并進(jìn)行免疫干擾相關(guān)研究，確認(rèn)其安全有效的范圍。由于疫苗成分復(fù)雜，除有效成分外，其他組分，如凍干賦形劑等組分，會(huì)對檢測方法造成一定的干擾。如乳糖就會(huì)對多種多糖的游離多糖檢測造成干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種吸附無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，使其具有安全、有效、可控及一針防多病的特點(diǎn)，并符合2010版《中國藥典》三部“吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗” “b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗” “A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”及擬定“吸附無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗制造與檢定規(guī)程”的相關(guān)要求，以實(shí)現(xiàn)能實(shí)際應(yīng)用的目的。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種聯(lián)合疫苗由以下組分(a)和組分 (b)組成(a)吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗；(b) b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗；(a)和(b)分別裝在分開的容器中。所述的(a)吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗是按以下方法制備的(I)制備各單價(jià)疫苗原液(I)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中國藥典》“吸附百白破聯(lián)合疫苗”中附錄I “百日咳疫苗原液制造及檢定要求”工作種子批經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)、皮膚壞死試驗(yàn)、毒力試驗(yàn)和效價(jià)測定后凍干保存，工作種子批菌種啟開后，接種于培養(yǎng)基，如改良包-姜培養(yǎng)基或活性炭半綜合培養(yǎng)基，于35 37°C培養(yǎng)不超過72小時(shí)，經(jīng)純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中；采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經(jīng)殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液；(II)白喉菌種工作種子批傳代至產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管2 3代，再傳至產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)制成生產(chǎn)用種子，采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制雜菌污染，檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于150Lf/ml時(shí)收獲，收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制，精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進(jìn)行脫毒,脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素；(III)破傷風(fēng)菌種工作種子批先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳廣3代，再轉(zhuǎn)至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經(jīng)加深水解后的培養(yǎng)基作為生產(chǎn)用培養(yǎng)基。采用培養(yǎng)罐液本培養(yǎng)，培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格控制雜菌污染，檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于40Lf/ml時(shí)收獲毒素,毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進(jìn)行脫毒,制成類毒素，即為破傷風(fēng)類毒素；(2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應(yīng)為淺藍(lán)色或乳白色膠體懸液，將白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素及無細(xì)胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調(diào)pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。
所述的(b) b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗是按以下方法制備的(I)制備各單價(jià)疫苗原液(I) A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；
依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存；(II) C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存；(III)b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”中檢定要求對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入一定濃度碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)一定時(shí)間，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存； (2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合原液與b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖計(jì))混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗。本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗的制備方法，包括以下步驟步驟一制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗 (I)制備各單價(jià)疫苗原液(I)百日咳菌種工作種子批啟開后，接種于培養(yǎng)基，如改良包-姜培養(yǎng)基或活性炭半綜合培養(yǎng)基，于35 37 °C培養(yǎng)不超過72小時(shí)，經(jīng)純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經(jīng)殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液；(II)白喉菌種工作種子批傳代至產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管2 3代，再傳至產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)制成生產(chǎn)用種子。采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制雜菌污染。檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于150Lf/ml時(shí)收獲。收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進(jìn)行脫毒。脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素；(III)破傷風(fēng)菌種工作種子批先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳f 3代，再轉(zhuǎn)至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經(jīng)加深水解后的培養(yǎng)基作為生產(chǎn)用培養(yǎng)基。采用培養(yǎng)罐液本培養(yǎng)，培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格控制雜菌污染。檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于40Lf/ml時(shí)收獲毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進(jìn)行脫毒,制成類毒素，即為破傷風(fēng)類毒素；(2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應(yīng)為淺藍(lán)色或乳白色膠體懸液。將白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素及無細(xì)胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調(diào)pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗；步驟二 制備b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗
(I)制備各單價(jià)疫苗原液(I) A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去 溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存；(II) C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存；(III) b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 - 8°C靜置I 一 3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ；離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”中檢定要求對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼( ADH)反應(yīng)適宜時(shí)間后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)1-4小時(shí)，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存；(2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液與b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖計(jì))混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗；步驟三分裝將上述制備的吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗與b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗分別分裝在預(yù)充式注射器與低硼硅西林瓶中。所述腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖與b型流感嗜血桿菌莢膜多糖為各自偶聯(lián)至載體蛋白上，如偶聯(lián)至破傷風(fēng)類毒素。其中，多糖蛋白偶聯(lián)物中，多糖蛋白比在I :2至I :4之間。載體蛋白的選擇上，可為破傷風(fēng)類毒素，也可為白喉類毒素載體或CRM197等適宜蛋白。本發(fā)明提供的疫苗在使用時(shí)將以下兩種組分臨用前混合(a)吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗；(b) b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗；(a)和(b)分別裝在分開的容器中。本發(fā)明聯(lián)合疫苗的制備工藝，包括以下步驟本發(fā)明疫苗可以O(shè). 5ml的劑量給予接種者。所述混合的偶聯(lián)物組分未經(jīng)佐劑處理；所述混合的偶聯(lián)物組分不含汞防腐劑；所述(b)部分的偶聯(lián)物為凍干制劑；所述(b)部分賦形劑包含乳糖或(和)甘氨酸。國內(nèi)雖有相似產(chǎn)品的專利(申請?zhí)?00910067156)，但說明書中僅描述流腦多糖生產(chǎn)工藝，過程公開不充分，且尚無產(chǎn)品上市。這是因?yàn)榱?lián)疫苗成分復(fù)雜，疫苗成分的簡單混合可能引起的抗原干擾，導(dǎo)致多糖特異性抗體滴度降低，加之各單組分疫苗混合后質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)難以確立，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)難以達(dá)到等因素所致。因此在疫苗配比過程中，需要長期疫苗生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的積累與國外臨床研究的反饋，并進(jìn)行免疫干擾相關(guān)研究，確認(rèn)其安全有效的范圍。由于疫苗成分復(fù)雜，除有效成分外，其他組分，如凍干賦形劑等組分，會(huì)對檢測方法造成一定的干擾。如乳糖就會(huì)對多種多糖的游離多糖檢測造成干擾。故本專利申請中采用甘氨酸作為賦形劑，以凍干曲線，探索出適宜的凍干方法，添加退火步驟，使凍干效果更佳。故本專利申請?zhí)峁┑氖且环N穩(wěn)定的吸附無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，所述生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品劑型與添加的輔料及效果與現(xiàn)有技術(shù)相比有實(shí)質(zhì)不同，具有顯著的進(jìn)步。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(I)接種一種疫苗就可預(yù)防百日咳，白喉，破傷風(fēng)，由A、C群腦膜炎球菌引起的腦脊髓膜炎，b型流感嗜血桿菌引起的腦膜炎，中耳炎等疾病。(2)提高疾覆蓋率，減少漏種。(3)減少疫苗的多次接種對兒童及其家長帶來的痛苦和負(fù)擔(dān)。(4)生產(chǎn)過程可控，產(chǎn)品安全有效。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包括但不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例I :一、吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗制備( I)制備各單價(jià)疫苗原液 (I)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中國藥典》“吸附百白破聯(lián)合疫苗”中附錄I “百日咳疫苗原液制造及檢定要求”工作種子批經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)、皮膚壞死試驗(yàn)、毒力試驗(yàn)和效價(jià)測定后凍干保存。工作種子批菌種啟開后，接種于培養(yǎng)基，如改良包-姜培養(yǎng)基或活性炭半綜合培養(yǎng)基，于35 37°C培養(yǎng)不超過72小時(shí)，經(jīng)純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經(jīng)殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液。(II)白喉菌種工作種子批傳代至產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管2 3代，再傳至產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)制成生產(chǎn)用種子。采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制雜菌污染。檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于150Lf/ml時(shí)收獲。收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進(jìn)行脫毒。脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素。(III)破傷風(fēng)菌種工作種子批先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳廣3代，再轉(zhuǎn)至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經(jīng)加深水解后的培養(yǎng)基作為生產(chǎn)用培養(yǎng)基。采用培養(yǎng)罐液本培養(yǎng)，培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格控制雜菌污染。檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于40Lf/ml時(shí)收獲毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進(jìn)行脫毒,制成類毒素，即為破傷風(fēng)類毒素。(2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應(yīng)為淺藍(lán)色或乳白色膠體懸液。將白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素及無細(xì)胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調(diào)pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。二、b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗的制備(I)制備各單價(jià)疫苗原液(I) A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%, 2 一 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液。依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，既為A群腦膜炎結(jié)合物原液，于2 8°C保存；(II) C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液。依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，既為C群腦膜炎結(jié)合物原液，于2 8°C保存；(III)b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液。依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”中檢定要求對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)適宜時(shí)間后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入一定濃度碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)一定時(shí)間，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，既b型流感嗜血桿菌結(jié)合物原液，于2 8°C保存；(2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合原液與b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖計(jì))混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗。三.分裝將上述制備的吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗與b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗分別分裝在預(yù)充式注射器與低硼硅西林瓶中再包裝至每人份市售獨(dú) 立包裝。四.成品檢定除水分測定外，按制品標(biāo)示量加入吸附無細(xì)胞百白破復(fù)溶后進(jìn)行其余各項(xiàng)檢定，其中檢測制品多糖含量時(shí)加入注射用水復(fù)溶后進(jìn)行檢測。成品檢定如下I物理檢查I. I外觀凍干制劑應(yīng)為白色疏松體，按標(biāo)示量加入吸附無細(xì)胞百白破后應(yīng)迅速復(fù)溶為白色混懸液，無搖之不散的異物。I. 2裝量差異依法檢查(2010版《中國藥典》三部，附錄I A)，裝量差異限度應(yīng)(±15% οI. 3鑒別試驗(yàn)采用免疫雙擴(kuò)散法(2010版《中國藥典》三部，附錄VDI C)，本品應(yīng)分別與A群、C群腦膜炎奈瑟氏菌、b型流感嗜血桿菌診斷血清和破傷風(fēng)抗毒素形成明顯沉淀線。無細(xì)胞百日咳疫苗注射動(dòng)物應(yīng)產(chǎn)生抗體(同效力檢測)白喉類毒素采用小鼠一 Veix)細(xì)胞法。破傷風(fēng)類毒素注射動(dòng)物后應(yīng)產(chǎn)生破傷風(fēng)抗體(同效力檢測)；疫苗加入枸椽酸鈉或絮狀反應(yīng)。2化學(xué)檢定2. I pH值應(yīng)為5. 8 7. 5《中國藥典》三部，2010版附錄V A)2. 2游離多糖A群腦膜炎球菌和C群腦膜炎球菌、Hib游離多糖含量均應(yīng)不高于20%。2. 3水分應(yīng)不高于3. 0%(2010版《中國藥典》三部，附錄YD D)。2. 4多糖含量:A群腦膜炎球菌多糖采用鑰酸銨法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄νπ A)，C群腦膜炎球菌多糖采用間苯二酚顯色法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄VI C)，b型流感嗜血桿菌多糖采用鑰酸銨法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄YD Α)或核糖法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄珊J)進(jìn)行檢測。其中A群腦膜炎球菌多糖根據(jù)WHO規(guī)程規(guī)定的計(jì)算公式(A群多糖含量磷含量為1000 75 ;C群多糖含量唾液酸含量為100 :75)，b型流感嗜血桿菌多糖根據(jù)WHO規(guī)程規(guī)定的計(jì)算公式(Hib多糖含量核糖含量為100 84)和2010版《中華人民共和國藥典》三部提供的計(jì)算公式(Hib多糖含量核糖含量為I :0. 41)，按照《A、C群腦膜炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗中各群多糖及游離多糖含量檢定方法》中的計(jì)算方法得出各群多糖含量。每I次人用劑量以多糖含量計(jì)算應(yīng)不低于30 μ g (A群、C群多糖和Hib多糖各應(yīng)不低于10 μ g)。裝量依法檢查(2010版《中國藥典》附錄I A),應(yīng)不低于標(biāo)示量。2. 5氯化鈉含量應(yīng)為7. 5 — 9. 5g/L (2010版《中國藥典》附錄VII G)。2. 6氫氧化鋁含量應(yīng)為1.0— I. 5mg/ml (2010版《中國藥典》附錄VII F)。2. 7硫柳汞含量應(yīng)不高于O. lg/L (2010版《中國藥典》附錄VII B)。2.8游離甲醛含量應(yīng)不高于0.28/1 (2010版《中國藥典》附錄VI L)2. 9戊二醛含量應(yīng)小于O. 01g/L (2010版《中國藥典》附錄VI I)2. 10熱原檢查用無菌生理氯化鈉溶液將供試品稀釋成半成品濃度的1/50，依法檢查(2010版《中國藥典》三部附錄ΧΠ D)，符合規(guī)定。注射量按家兔體重Ikg注射lml。 3.效價(jià)測定3.1無細(xì)胞百日咳疫苗按2010版《中國藥典》“吸附百白破聯(lián)合疫苗”中附錄2進(jìn)行。以適宜的稀釋倍數(shù)稀釋至第一個(gè)免疫劑量，再按5倍系列稀釋。免疫時(shí)間為21天。每I次人用劑量的免疫效價(jià)應(yīng)不低于4. 0IU,且95%可信限的低限應(yīng)不低于2. OIU0如達(dá)不到上述要求時(shí)可進(jìn)行復(fù)試，但所有的有效試驗(yàn)結(jié)果必須以幾何平均值(如用概率分析法時(shí)，應(yīng)用加權(quán)幾何平均)來計(jì)算。達(dá)到上述要求即判為合格。3. 2白喉疫苗每I次人用劑量中白喉類毒素的免疫效價(jià)應(yīng)不低于30IU(2010版《中國藥典》附錄XI C)。3. 3破傷風(fēng)疫苗每I次人用劑量中破傷風(fēng)類毒素的免疫效價(jià)應(yīng)不低于40IU (附錄XI B)。4.無菌檢查依法檢查(附錄XII A)，應(yīng)符合規(guī)定。5.特異性毒性檢查5. I無細(xì)胞百日咳疫苗按2010版《中國藥典》本品種附錄中2. 5項(xiàng)進(jìn)行。5. 2白喉、破傷風(fēng)疫苗用體重25(T350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2. 5ml，分兩側(cè)注射，每側(cè)I. 25ml，觀察30天。注射部位可有浸潤，經(jīng)5 10天變成硬結(jié)，可能30天不完全吸收。在第10天，第20天，每30天稱體重，到期體重比注射前增加，局部無化膿、無壞死、無破傷風(fēng)癥狀及無晚期麻痹癥者為合格。6.毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)供試品置37°C 4周，按2010版《中國藥典》本品種附錄中2. 6項(xiàng)進(jìn)行。檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合疫苗，由以下組分(a)和組分(b)組成 (a)吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗； (b)b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗； (a)和(b)分別裝在分開的容器中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的(a)吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗是按以下方法制備的 (I)制備各單價(jià)疫苗原液 (1)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中國藥典》“吸附百白破聯(lián)合疫苗”中附錄1“百日咳疫苗原液制造及檢定要求”工作種子批經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)、皮膚壞死試驗(yàn)、毒力試驗(yàn)和效價(jià)測定后凍干保存，工作種子批菌種啟開后，接種于培養(yǎng)基，如改良包-姜培養(yǎng)基或活性炭半綜合培養(yǎng)基，于35 37°C培養(yǎng)不超過72小時(shí)，經(jīng)純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中；采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經(jīng)殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液； (II)白喉菌種工作種子批傳代至產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管2 3代，再傳至產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)制成生產(chǎn)用種子，采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制雜菌污染，檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于150Lf/ml時(shí)收獲，收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制，精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進(jìn)行脫毒,脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素； (III)破傷風(fēng)菌種工作種子批先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳Γ3代，再轉(zhuǎn)至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經(jīng)加深水解后的培養(yǎng)基作為生產(chǎn)用培養(yǎng)基。采用培養(yǎng)罐液本培養(yǎng)，培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格控制雜菌污染，檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于40Lf/ml時(shí)收獲毒素,毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進(jìn)行脫毒,制成類毒素，即為破傷風(fēng)類毒素； (2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化鋁原液應(yīng)為淺藍(lán)色或乳白色膠體懸液，將白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素及無細(xì)胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調(diào)pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的(b)b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗是按以下方法制備的 (I)制備各單價(jià)疫苗原液 (I)A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存； (II)C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌·或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存； (III)b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”中檢定要求對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入一定濃度碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)一定時(shí)間，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液，于疒8°C保存； (2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合原液與b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液1:1:1 (w/w,以多糖計(jì))混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗。
4.權(quán)利要求I所述的聯(lián)合疫苗的制備方法，包括以下步驟 步驟一制備吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗 (I)制備各單價(jià)疫苗原液 (1)百日咳菌種工作種子批啟開后，接種于培養(yǎng)基，如改良包-姜培養(yǎng)基或活性炭半綜合培養(yǎng)基，于35 37°C培養(yǎng)不超過72小時(shí)，經(jīng)純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經(jīng)殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液； (II)白喉菌種工作種子批傳代至產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管2 3代，再傳至產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)制成生產(chǎn)用種子。采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制雜菌污染。檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于150Lf/ml時(shí)收獲。收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進(jìn)行脫毒。脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素； (III)破傷風(fēng)菌種工作種子批先在產(chǎn)毒培養(yǎng)基種子管中傳廣3代，再轉(zhuǎn)至產(chǎn)毒培養(yǎng)基制成生產(chǎn)用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經(jīng)加深水解后的培養(yǎng)基作為生產(chǎn)用培養(yǎng)基。采用培養(yǎng)罐液本培養(yǎng)，培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格控制雜菌污染。檢測培養(yǎng)物濾液，毒素效價(jià)不低于40Lf/ml時(shí)收獲毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進(jìn)行脫毒,制成類毒素，即為破傷風(fēng)類毒素； (2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應(yīng)為淺藍(lán)色或乳白色膠體懸液。將白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素及無細(xì)胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調(diào)pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗； 步驟二 制備b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗 (I)制備各單價(jià)疫苗原液 (I)A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%, 2 一 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存； (II)C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；· 依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)I 一 4小時(shí)，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液，于2l°C保存； (III)b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，于對數(shù)生長期后期或靜止期前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進(jìn)行殺菌，可在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，力口入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時(shí)或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)l(T20mg/ml ；按I :2容量用冷酚(IOOg結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據(jù)2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”中檢定要求對多糖進(jìn)行檢定，多糖原液經(jīng)溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應(yīng)適宜時(shí)間后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等質(zhì)量混合，然后加入過量碳二亞胺(EDAC)冰浴反應(yīng)1-4小時(shí)，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應(yīng)物經(jīng)Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結(jié)合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液，于疒8°C保存； (2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗原液與b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液1:1:1 (w/w,以多糖計(jì))混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗； 步驟三分裝將上述制備的吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗與b型流感嗜血桿菌-A、c群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗分別分裝在預(yù)充式注射器與低硼硅西林瓶中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗，其特征在于，白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳抗原被吸附到氫氧化鋁佐劑上。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述組分(a)可包含氫氧化鋁和/或磷酸招佐劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述白喉類毒素與破傷風(fēng)類毒素的比例在2 :1和3 :1之間，以Lf單位測量。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述疫苗，其特征在于，所述組分(b)中腦膜炎球菌莢膜多糖與b型流感嗜血桿菌莢膜多糖為各自偶聯(lián)至載體蛋白上，如偶聯(lián)至破傷風(fēng)類毒素。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的單位劑量包含每種偶聯(lián)物4一16Pg。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述疫苗，其特征在于，所述組分(b)包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A和C的多糖。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所疫苗，其特征在于，所述組分(b)的偶聯(lián)物，其多糖與蛋白的質(zhì)量比為O. 3至I. 2之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述組分(b)中A群、C群血清型多糖偶聯(lián)物比例為I :1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種吸附無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，使其具有安全、有效、可控及一針防多病的特點(diǎn)，并符合2010版《中國藥典》三部“吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗”“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”“A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”及擬定“吸附無細(xì)胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗制造與檢定規(guī)程”的相關(guān)要求，達(dá)到了可投入實(shí)際應(yīng)用的效果。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102813917SQ20121029554
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者楊曉明, 魏樹源, 段凱, 薛紅剛, 李新國, 項(xiàng)美娟, 盧佳麗 申請人:武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司