一種組織工程軟骨的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種組織工程軟骨的構建方法，所述方法包括步驟：（1）在Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片上加軟骨細胞懸液；（2）在步驟（1）產生的軟骨細胞懸液上加Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片；（3）重復步驟（1）和（2），得到復合物；（4）體外培養復合物得到組織工程軟骨。
【專利說明】一種組織工程軟骨的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織工程領域，尤其涉及一種應用可降解人工合成膜片材料構建組織工程軟骨。
【背景技術】
[0002]軟骨是一種無血管的組織，因其自我修復能力低下，所以軟骨損傷或畸形一直以來都是臨床治療的一大難題。組織工程技術為軟骨缺損修復提供了一種全新的治療手段。可降解生物支架材料是組織工程的基本要素之一，目前構建軟骨常用的支架材料有聚乳酸(polyglycolicacid, PGA), I型膠原、軟骨脫細胞基質等，其中軟骨脫細胞基質因其良好的細胞相容性，無免疫原性等優點而成為近年研究的熱點。軟骨脫細胞基質具有成分天然、力學強度與正常軟骨組織相似等優點，然而由于軟骨是非常致密的結締組織，因此存在脫細胞不全和新生細胞難以長入兩大障礙。為了解決上述難題，人們嘗試了多種方法，但效果都不理想。但大塊軟骨存在脫細胞不徹底以及細胞再次長入困難等問題，同時軟骨脫細胞膜片還存在制備過程復雜，不易標準化等問題。
[0003]因此，本領域迫切需要提供一種新的構建組織工程軟骨的方法。

【發明內容】

[0004]本發明旨在提供一種新的構建組織工程軟骨的方法。
[0005]本發明提供了一種組織工程軟骨的構建方法，所述方法包括步驟:
[0006](I)在Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片上加軟骨細胞懸液；
[0007](2)在步驟(1)產生的軟骨細胞懸液上加Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片；
[0008](3)重復步驟(1)和(2)，得到復合物；
[0009](4)體外培養復合物得到組織工程軟骨。
[0010]在另一優選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為 90: 10-10: 90。
[0011]在另一優選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為 70: 30-30: 70 ;更優選為 70: 30-50: 50。
[0012]在另一優選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7_12mm的圓形。
[0013]在另一優選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為10-30 y m。
[0014]在另一優選例中，所述軟骨細胞懸液中的軟骨細胞濃度為50-150X 106/ml。
[0015]在另一優選例中，每次所加軟骨細胞懸液為1-10 ill。
[0016]在另一優選例中，步驟(3)中重復步驟(1)和(2) 5-15次。
[0017]在另一優選例中，步驟(3)得到的復合物上覆蓋培養液后再進行體外培養。
[0018]在另一優選例中，所述軟骨細胞來自全身軟骨組織。
[0019]在另一優選例中，所述全身軟管組織是耳廓、肋骨、或關節等。[0020]據此，本發明提供了一種新的構建組織工程軟骨的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是三明治法構建軟骨組織操作示意圖。
[0022]圖2顯示了三種比例的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料的大體觀，電鏡微觀結構。
[0023]圖3顯示了經體外培養Iw+體內培養12w的組織工程軟骨大體觀(A)，細胞材料4h粘附率(B)，體外培養Iw+體內培養3w的組織工程軟骨生物力學分析(C)情況。
[0024]圖4顯示了三種材料體內外構建組織工程軟骨的組織學分析；拼圖標尺為500 iim，放大圖片標尺為100 iim。
【具體實施方式】
[0025]發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現可以使用一定比例的Gelatin (明膠)/PCL (polycaprolactone,聚己酸丙酯)納米纖維材料作為組織工程支架材料，并且通過“三明治法”將Gelatin/PCL納米纖維材料(膜片形式)和軟骨細胞按“膜片-細胞懸液_膜片-細胞懸液”的方式在培養皿中層 層疊加所得到的復合物，經過體外培養可以有效構建組織工程軟骨。
[0026]本發明提供的構建組織工程軟骨的方法是將種子細胞接種于生物可降解材料上形成種子細胞-材料復合物，然后在體外培養條件下(例如在常規的含5%C02的37°C培養箱中)進行體外培養可以得到可用于移植的組織工程化軟骨。也可以進一步地，在體外培養后植入體內使進一步地生長。在本發明的一個實施例中，是在體外培養后植入哺乳動物皮下。
[0027]在本發明提供的上述組織工程軟骨的構建方法中，所使用的生物可降解材料是Gelatin/PCL電紡納米纖維,較佳地是Gelatin/PCL納米纖維電紡膜,其中Gelatin和PCL的重量比為 90: 10-10: 90，優選 70: 30-30: 70，更優選 70: 30-50: 50。
[0028]如本文所用，“Gelatin/PCL納米纖維電紡膜”是一種電紡納米纖維材料，由Gelatin和PCL構成，成膜狀，厚度10-30 u m，優選橫切面為直徑7_12mm的圓形。
[0029]本發明提供的上述組織工程軟骨的構建方法中，所使用的種子細胞是軟骨細胞，可以使用本領域的常規方法獲得，例如但不限于，酶消化法從軟骨組織塊中消化獲得細胞。
[0030]本發明提供的上述組織工程軟骨的構建方法中，種子細胞-材料復合物的形成過程是將Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片和軟骨細胞按“膜片-細胞懸液_膜片_細胞懸液”的方式在培養皿中層層疊加。細胞懸液中軟骨細胞的濃度為50-150X 106/ml，優選為80-120X 106/ml ;每層細胞懸液1-10 iil，優選為3-7 ill ;疊加層數為10-30層，優選為15-25 層。
[0031]在本發明的一個實施例中，通過上述層層疊加的方式獲得復合物后，靜置0.5-2小時，將含有5-15%FBS的高糖DMEM培養液覆蓋復合物，再進行體外培養。
[0032]在本發明的一個實施例中，體外培養0.5-1.5周后植入哺乳動物皮下2-4周。
[0033]本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0034]本發明的主要優點在于:
[0035]1、本發明提供的構建方法可以依據對于Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的形狀或形態的處理獲得特定大小、特定形狀的軟骨。
[0036]2、本發明證實了膜片技術構建軟骨的可行性，理論上人工合成膜片只要具備良好的生物相容性、可降解性、通透性以及一定的力學強度，無論是用電紡絲技術制備還是其他技術制備的膜性材料，都適合于軟骨組織構建。
[0037]3、人工合成的可降解材料制備可實現標準化生產，有利于組織工程技術的推廣與 應用。
[0038]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按
重量計。
[0039]本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質的重量。
[0040]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0041]實施例
[0042]材料和方法
[0043]一、Gelatin/PCL納米纖維電紡膜的準備
[0044]本實施例所用Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料中Gelatin:PCL比例包括30:70，50:50,70:30三種，購自東華大學生物研究所。用角膜環鉆將該材料處理成直徑為9mm的圓形膜片，經真空冷凍干燥機24小時處理后備用(無菌)。
[0045]二、耳廓軟骨細胞培養
[0046]取新生豬耳廓軟骨組織，切成IX IX Imm大小，加入0.1%膠原酶消化過夜，用75 y m孔徑的濾網濾過后,加入高糖DMEM(Hyclone,美國)含10%胎牛血清(FBS) (Hyclone,美國)的培養液，置于含5%C02的37°C培養箱培養，培養至80%-90%融合后傳代。
[0047]三、三明治法構建軟骨
[0048]用0.25%胰蛋白酶消化收集培養的軟骨細胞，用含10%FBS的DMEM培養液重懸至濃度100X 106/ml，將Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片和軟骨細胞按“膜片-細胞懸液-膜片-細胞懸液”的方式在培養皿中層層疊加，細胞懸液每層I,共疊加20層膜片(圖1)。靜置I小時后加入含10%FBS的高糖DMEM培養液覆蓋復合物，置于含5%C02的37°C培養箱培養。隔天換液，體外培養I周后植入裸鼠皮下，體內3周后取材。
[0049]四、細胞粘附率檢測
[0050]將軟骨細胞按照2X 104/ml/孔(24孔板)的數量接種于三種比例的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。細胞-材料復合物在含5%C02的37°C培養箱培養4h后被轉移至另一24孔板，用0.25%的胰酶消化原24孔板內貼壁細胞，與原24孔板內培養液一同計數，全自動細胞計數儀計數后得出流失細胞數。[0051]細胞粘附率=(接種細胞數-流失細胞數)/接種細胞數X 100%。
[0052]五、構建軟骨的組織學檢測
[0053]HE染色:將切片脫蠟至水后蘇木素染色8分鐘，沖洗后鹽酸酒精分化數秒，自來水洗返藍30分鐘，伊紅染色2分鐘后乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0054]II型膠原免疫組織化學染色:切片脫蠟至水后，加入3%過氧化氫乙醇溶液室溫下放置10分鐘，(磷酸緩沖液)PBS漂洗3次，0.4%胃蛋白酶37°C消化30分鐘；PBS漂洗3次，山羊血清封閉30分鐘，吸去血清后加入1:200稀釋的一抗(abcam，美國)，4°C過夜后加入二抗，37°C溫箱I小時，后用3，3’ - 二氨基聯苯胺顯色。 [0055]Safranin’O染色:將切片脫臘至水后Safranin’O液染5分鐘；乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0056]六、構建軟骨的生物力學檢測
[0057]通過應力-應變力學測試來測定組織抗壓強度和壓模量。概述如下:組織放在特殊設計的一個容器中，首先加Ig壓力，并將此時作為零應變。然后持續施加2.5%應變的壓力一直達到80%應變為止。在每一步中，均記錄壓力-變形情況直到達到平衡。抗壓強度(平衡壓力與標本橫截面積的比值)表征組織承受最大應力的一個功能；通過應力-應變曲線中線性關系良好部分的斜率可以計算出壓模量，它同樣可作為組織生物力學的一個功能。
[0058]結果
[0059]1.Gelatin/PCL納米纖維電紡膜及其組織相容性
[0060]靜電紡絲法制備的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜顏色純白，厚度約20 ii m，具有良好的抗拉伸強度，用9mm角膜環鉆處理后成圓片狀，形狀規則，未出現皺縮現象(圖2A)。電鏡掃描顯示:納米纖維均勻、光滑、連續，其平均直徑(纖維橫切面的直徑)在379±146nm左右，接近于正常膠原纖維50-500nm的直徑，能很好地仿生了天然細胞外基質膠原的纖維細度(圖2B)，纖維中由于包含明膠成分，故具有良好的組織相容性，細胞粘附率檢測結果提示，PCL含量為30%與50%的材料細胞粘附率較高，且兩者不存在統計學差異(圖3B)。
[0061]2.構建軟骨的大體觀及力學強度
[0062]體內培養3周后取材顯示三組膜片均形成軟骨樣組織(圖3A)，Gelatin/PCL70:30和50:50組形成軟骨彈性好，力學強度分析顯示他們的楊氏膜量顯著高于Gelatin/PCL30:70 組(圖 3C)
[0063]3.構建軟骨的組織學檢測
[0064]經體外培養I周后移植入裸鼠皮下3周取材，組織學結果顯示，不同比例的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜構建軟骨的質量明顯不同。Gelatin/PCL70:30和50:50組形成軟骨質量好，材料膜片之間的軟骨細胞大量增殖，軟骨陷窩結構清晰，Safranin 0和Collagen II免疫組織化學染色結果提示分泌細胞外基質能力旺盛。Gelatin/PCL70:30組軟骨質量較差，組織不均一，軟骨陷窩較少，Safranin 0和Collagen II免疫組織化學染色結果提示分泌細胞外基質較少。(圖4)。
[0065]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
【權利要求】
1.一種組織工程軟骨的構建方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)在Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片上加軟骨細胞懸液； (2)在步驟(1)產生的軟骨細胞懸液上加Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片； (3 )重復步驟(1)和(2 )，得到復合物； (4)體外培養復合物得到組織工程軟骨。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin 和 PCL 的重量比為 90: 10-10: 90。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin 和 PCL 的重量比為 70: 30-30: 70 ;優選為 70: 30-50: 50。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7-12_的圓形。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為 10-30 u m。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細胞懸液中的軟骨細胞濃度為50-150 XlOVml o
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，每次所加軟骨細胞懸液為1-10yl。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中重復步驟(1)和(2)5-15次。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)得到的復合物上覆蓋培養液后再進行體外培養。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細胞來自全身軟骨組織。
【文檔編號】A61L27/24GK103622764SQ201210303026
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月23日 優先權日:2012年8月23日
【發明者】張文杰, 薛繼鑫, 周廣東, 劉偉, 曹誼林 申請人:上海國睿生命科技有限公司