一種組織工程軟骨的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種組織工程軟骨的構建方法，所述方法包括步驟：（1）將膜片加至具有三維結構的耳廓形狀支架上；（2）在膜片上加軟骨細胞懸液；（3）在步驟（2）產生的軟骨細胞懸液上加膜片；（4）重復步驟（2）和（3），得到復合物；（5）體外培養復合物得到組織工程軟骨。
【專利說明】一種組織工程軟骨的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織工程領域，尤其涉及一種應用預制具有三維結構的耳廓形狀支架構建組織工程軟骨。
【背景技術】
[0002]軟骨是一種無血管的組織，因其自我修復能力低下，所以軟骨損傷或畸形一直以來都是臨床治療的一大難題。組織工程技術為軟骨缺損修復提供了一種全新的治療手段。軟骨構建中除了解決細胞、材料這兩個關鍵問題以外，如何構建具有三維精細結構的軟骨組織是一難點。機體軟骨的缺損形態多種多樣，如關節軟骨的運動損傷性缺損，尤其是臨床上非常常見的先天性小耳畸形，這就要求組織工程軟骨也能預制成不同的形狀。目前臨床修復先天性小耳畸形的主要手段是利用肋軟骨進行雕琢形成人耳樣結構修補損傷位置，其往往是拆東墻補西墻，且容易造成氣胸或軟骨缺損引起的呼吸反常等缺點。傳統方法是先將材料預制成特定的三維形狀，然后接種細胞，從而實現特定形狀組織的構建。而膜片本身不具備三維結構，如何應用膜片實現具有三維結構組織的構建成為研究的重點。
[0003]因此，本領域迫切需要提供一種新的可實現特定形狀組織構建的方法。

【發明內容】

[0004]本發明旨在提供一種新的構建組織工程軟骨的方法。
[0005]本發明提供了一種組織工程軟骨的構建方法，所述方法包括步驟:
[0006](I)將膜片加至具有三維結構的形狀支架上；
`[0007](2)在膜片上加軟骨細胞懸液；
[0008](3)在步驟(2)產生的軟骨細胞懸液上加膜片；
[0009](4)重復步驟(2)和(3)，得到復合物；
[0010](5)體外培養復合物得到組織工程軟骨。
[0011]在另一優選例中，所述具有三維結構的形狀支架的材質選自鈦合金、金屬材料、或高分子合成材料。
[0012]在另一優選例中，所述支架的特點是要有一定力學強度，可塑型，不變形，不對細胞產生毒副作用。
[0013]在另一優選例中，所述具有三維結構的形狀選自耳廓形狀、鼻翼或下頜。
[0014]在另一優選例中，所述耳廓形狀可以是正常耳廓形狀，也可以是畸形耳廓形狀。
[0015]在另一優選例中，所述膜片選自軟管脫細胞基質膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。
[0016]在另一優選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為90: 10-10: 90 ;更佳地，重量比為70: 30-30: 70;最佳地，為70: 30-50: 50。
[0017]在另一優選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7_12mm的圓形。[0018]在另一優選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為10-30 ii m。
[0019]在另一優選例中，所述軟骨細胞懸液中的軟骨細胞濃度為50-150 X 106/ml，每次所加軟骨細胞懸液為1-1Oii I。
[0020]在另一優選例中，步驟(4)中重復步驟(2)和(3) 5-15次。
[0021]在另一優選例中，步驟(4)得到的復合物上覆蓋培養液后再進行體外培養。
[0022]在另一優選例中，所述軟骨細胞來自全身軟骨組織。
[0023]在另一優選例中，所述全身軟管組織是耳廓、肋骨、或關節等。
[0024]據此，本發明提供了一種新的可實現特定形狀組織構建的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是鈦合金人耳廓支架大體觀(A)，軟骨脫細胞膜片大體觀(B)，Gelatin/PCL納米纖維電紡膜大體觀(C)以及軟骨細胞鏡下觀(D)。
[0026]圖2顯示了鈦合金人耳廓支架大體觀(A)，軟骨脫細胞膜片復合軟骨細胞構建人耳軟骨即刻大體觀(B)以及Gelatin/PCL納米纖維電紡膜復合軟骨細胞構建人耳軟骨即刻大體觀(C)。
[0027]圖3 軟骨脫細胞膜片(Acellular cartilage sheets, ACS)和 Gelatin/PCL 納米纖維電紡膜復合軟骨細胞構建人耳軟骨體外培養2周大體觀(A)，植入體內6周后大體觀(B，C)以及體內6周HE染色(D)。
[0028]圖4組織工程構建人耳軟骨與鈦合金支架激光掃描的結構吻合度比較。
【具體實施方式】
[0029]發明人經過廣泛而深入的研究，發現利用膜片濕潤后柔軟的特性，先預制特定耳廓三維結構的剛性材質支架，以該支架為模板，將膜片與細胞復合，構建立體結構與預制模板一致的三維軟骨組織。同時發現，可以使用一定比例的Gelatin (明膠)/PCL(polycaprolactone,聚己酸丙酯)納米纖維材料作為組織工程支架材料,并且通過“三明治法”將Gelatin/PCL納米纖維材料(膜片形式)和軟骨細胞按“膜片_細胞懸液-膜片-細胞懸液”的方式在培養皿中層層疊加所得到的復合物，經過體外培養可以有效構建組織工程軟骨。
[0030]本發明提供的構建組織工程軟骨的方法是壓制得到具有三維結構的耳廓形狀支架，然后將種子細胞接種于在該支架上的生物可降解材料上，形成種子細胞-材料-支架復合物，然后在體外培養條件下(例如在常規的含5%C02的37°C培養箱中)進行體外培養可以得到可用于移植的組織工程化軟骨。也可以進一步地，在體外培養后植入體內使進一步地生長。在本發明的一個實施例中，是在體外培養后植入哺乳動物皮下。
[0031]在本發明提供的上述組織工程軟管的構建方法中，是以鈦合金為材料壓制出具有三維結構的耳廓形狀支架。在一實施例中，CT掃描正常成人耳朵，根據掃描數據通過三維打印技術制備微縮版耳廓模具，以鈦合金為材料壓制出具有三維結構的耳廓形狀支架。
[0032] 在本發明提供的上述組織工程軟骨的構建方法中，所使用的生物可降解材料優選膜片，所述膜片選自軟管脫細胞基質膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。
[0033]如本文所用，“膜片”是指天然或合成的厚度在5-50 U m的膜狀材料。[0034]本發明所述軟管脫細胞基質膜片可以使用常規方法獲得，例如但不限于，將動物耳廓軟骨，用角膜環鉆切成圓柱狀，冰凍切片機切成厚度8-12 μ m的圓形薄片，置入十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，震蕩，切片用水漂洗數次，凍干備用。
[0035]本發明所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜中，Gelatin和PCL的重量比為90: 10-10: 90，優選 70: 30-30: 70，更優選 70: 30-50: 50。
[0036]如本文所用，“Gelatin/PCL納米纖維電紡膜”是一種電紡納米纖維材料，由Gelatin和PCL構成，成膜狀，厚度10-30 μ m，優選橫切面為直徑7_12mm的圓形。
[0037]本發明提供的上述組織工程軟骨的構建方法中，所使用的種子細胞可以是成熟的軟骨細胞，也可以是具有成軟骨分化能力的干細胞。軟骨細胞可以使用本領域的常規方法獲得，例如但不限于，酶消化法從軟骨組織塊中消化獲得細胞。
[0038]本發明提供的上述組織工程軟骨的構建方法中，種子細胞-材料-支架復合物的形成過程是將鈦合金耳廓支架凸面朝上至于培養皿中，將膜片和軟骨細胞按“膜片-細胞懸液-膜片-細胞懸液”的方式在鈦合金耳廓支架上層層疊加，均勻覆蓋支架。細胞懸液中軟骨細胞的濃度為50-150 X 106/ml，優選為80-120 X 106/ml ;每層細胞懸液1_10μ 1，優選為3-7 μ 1，每層細胞懸液量以濕潤每張膜片為準；疊加層數為10-30層，優選為15-25層。
[0039]在本發明的一個實施例中，通過上述層層疊加的方式獲得復合物后，靜置0.5-2小時，將含有5-15%FBS的高糖DMEM培養液覆蓋復合物，再進行體外培養。
[0040]在本發明的一個實施例中，體外培養1-3周后植入哺乳動物皮下4-8周。
[0041]本發明提供的方法適用于構建不同三維形狀的軟骨，不僅限于耳廓，并且支架形態決定構建組織形態。
[0042]本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0043]本發明的主要優點在于:
[0044]1、本發明利用膜片濕潤后柔軟的特性，先預制特定三維結構的鈦合金耳廓支架，以鈦合金支架為模板，三明治法將膜片與細胞復合，經過體外和體內的培養，最終構建出立體結構與預制模板一致的三維軟骨組織。結果顯示該構建方式得到的人耳廓軟骨三維形態維持良好，所形成的軟骨組織成熟均一。
[0045]2、本發明建立了一個全新的構建特定形狀三維精細結構軟骨的方法:利用膜片材料柔軟的特性，先預制特殊形態的三維支架模版(這一模版可以使用不同的材質)，然后以模板為支架貼付一定層數的膜片類生物可降解材料，層與層之間接種具有成軟骨能力的細胞(軟骨細胞、間充質干細胞等)，最終可在體外和體內構建特定形狀的軟骨組織。
[0046]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按重量計。
[0047]本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質的重量。[0048]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0049]實施例
[0050]材料和方法:
[0051]一、耳廓形狀鈦合金支架的制備
[0052]CT掃描正常成人耳朵，根據掃描數據通過三維打印技術制備微縮版(2:1)耳廓模具，以鈦合金為材料壓制出具有三維結構的耳廓形狀支架(圖1A)，75%酒精消毒備用。
[0053]二、軟骨脫細胞基質膜片制備
[0054]取新鮮成年豬耳廓軟骨，用角膜環鉆切成直徑9mm的圓柱狀，冰凍切片機切成厚度IOiim的圓形薄片，置入1%SDS (上海生工)溶液，于搖床震蕩過夜。切片用蒸餾水漂洗數次，用冷凍干燥機(Virtis，美國)凍干備用(圖1B)。
[0055]三、Gelatin/PCL納米纖維電紡膜的準備
[0056]本實驗所用的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料中Gelatin:PCL比例為50:50，購自東華大學生物研究所。將該材料裁減成近橢圓形，大小比金屬耳廓支架略大，材料經真空冷凍干燥24小時處理后備用(圖1C)。
[0057]四、耳廓軟骨細胞培養
[0058]取新生豬耳廓軟骨組`織，切成IX IX Imm大小，加入0.1%膠原酶消化過夜，用75 y m孔徑的濾網濾過后,加入高糖DMEM(Hyclone,美國)含10%胎牛血清(FBS) (Hyclone,美國)的培養液，置于含5%C02的37°C培養箱培養，培養至80%-90%融合后傳代(圖1D)。
[0059]五、三明治法構建軟骨
[0060]用0.25%胰蛋白酶消化收集培養的軟骨細胞，用含10%FBS的DMEM培養液重懸至濃度100X 106/ml，將鈦合金耳廓支架凸面朝上至于培養皿中(圖2A)，將膜片和軟骨細胞按“膜片-細胞懸液-膜片-細胞懸液”的方式在鈦合金耳廓支架上層層疊加，均勻覆蓋支架(圖2B，C)，細胞懸液量以濕潤每張膜片為標準，共疊加15層膜片。靜置I小時后加入含10%FBS的高糖DMEM培養液覆蓋復合物，置于含5%C02的37°C培養箱培養。隔天換液，體外培養2周后植入裸鼠皮下，體內6周后取材。
[0061]六、構建軟骨的組織學檢測
[0062]HE染色:將切片脫蠟至水后，蘇木素染色8分鐘，沖洗后鹽酸酒精分化數秒，自來水洗返藍30分鐘，伊紅染色2分鐘后乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0063]II型膠原免疫組織化學染色:切片脫蠟至水后，加入3%過氧化氫乙醇溶液室溫下放置10分鐘，(磷酸緩沖液)PBS漂洗3次，0.4%胃蛋白酶37°C消化30分鐘；PBS漂洗3次，山羊血清封閉30分鐘，吸去血清后加入1:200稀釋的一抗(abcam，美國)，4°C過夜后加入二抗，37°C溫箱I小時，后用3，3’ - 二氨基聯苯胺顯色。
[0064]Safranin’O染色:將切片脫臘至水后Safranin’O液染5分鐘；乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0065]甲苯胺藍染色:將切片脫蠟至水后甲苯胺藍染液5分鐘，乙醇脫水，二甲苯透明后封片觀察。
[0066]七、三維立體激光掃描[0067] 為了檢測所構建的耳廓軟骨外形與鈦合金耳廓支架的吻合度，利用三維立體激光掃描系統(Konica Minolta, Tokyo, Japan)分別對鈦合金耳廓支架和以軟骨脫細胞膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜構建的耳廓軟骨進行立體掃描成像，掃描得到的數據經系統處理后可以得出構建所得的耳廓軟骨與鈦合金耳廓支架的吻合度情況。
[0068]結果
[0069]1.三明治法構建耳廓形態軟骨
[0070]應用CT掃描、三維打印和模壓技術，可以制備出特定人耳廓形狀的鈦合金支架(圖2A)，以此支架為模板應，應用軟骨脫細胞膜片或人工合成可降解Gelatin/PCL納米纖維電紡膜，以三明治法接種軟骨細胞后，可以得到與鈦合金支架立體結構吻合的細胞-材料復合物(圖2B，C)，在鈦合金支架的依托下體外培養或移植裸鼠皮下，細胞-材料復合物均維持良好的三維結構(圖3)，經三維立體激光掃描成像檢測，以軟骨脫細胞膜片和Gelatin/PCL納米纖維電紡膜構建的耳廓軟骨與鈦合金耳廓支架和吻合度分別達到了84.1% 和 85.6% (圖 4)。
[0071]2.構建軟骨的組織學檢測
[0072]經過體外或體內培養的組織切片顯示為軟骨組織，軟骨陷窩清晰可見，分泌細胞外基質能力旺盛。組織中仍然可見未完全降解的脫細胞膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料但膜片和細胞交界模糊，多處可見細胞長入膜片內部形成陷窩，連通了不同層膜片之間的細胞群體(圖3D)。
[0073]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
【權利要求】
1.一種組織工程軟骨的構建方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)將膜片加至具有三維結構的形狀支架上； (2)在膜片上加軟骨細胞懸液； (3)在步驟(2)產生的軟骨細胞懸液上加膜片； (4)重復步驟(2)和(3)，得到復合物； (5)體外培養復合物得到組織工程軟骨。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有三維結構的形狀支架的材質選自鈦合金、金屬材料、或高分子合成材料。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜片選自軟管脫細胞基質膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為90: 10-10: 90 ;優選重量比為70: 30-30: 70 ;更優選為70: 30-50: 50。
5.如權利要求3 所述的方法,其特征在于,所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7-12mm的圓形。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為 10-30 u m。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細胞懸液中的軟骨細胞濃度為50-150 X 106/ml，每次所加軟骨細胞懸液為1-10 yl。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中重復步驟(2)和(3)5-15次。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)得到的復合物上覆蓋培養液后再進行體外培養。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細胞來自全身軟骨組織。
【文檔編號】A61F2/00GK103622762SQ201210303600
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月23日 優先權日:2012年8月23日
【發明者】張文杰, 薛繼鑫, 龔軼一, 鄭蕊, 周廣東, 劉偉, 曹誼林 申請人:上海國睿生命科技有限公司