專利名稱：一種小牛血去蛋白提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種小牛血去蛋白提取物及其制備方法，以及小牛血去蛋白提取物在制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小牛血去蛋白提取物由Jaeger KH于20世紀(jì)60年代研制成功，主要由無(wú)機(jī)離子鉀、氯、鈉等及小分子多肽、氨基酸、核苷酸、酮酸等物質(zhì)組成，能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氧的攝取和利用，促進(jìn)線粒體呼吸，促進(jìn)組織的復(fù)原和再生，能保護(hù)大腦神經(jīng)細(xì)胞，減輕腦缺血再灌注損傷，改善大腦中氧和能量供應(yīng)，消除氧自由基、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)等作用。特別對(duì)中風(fēng)、顱腦外傷等器質(zhì)性精神障礙有特殊的療效，對(duì)創(chuàng)傷、潰瘍、灼傷等損傷組織也有 促進(jìn)愈合的作用。小牛血去蛋白提取物進(jìn)口制劑如瑞士素高公司生產(chǎn)的素高捷療眼膏、奧地利奈科明的愛(ài)維治已進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，國(guó)產(chǎn)制劑生產(chǎn)商也有數(shù)家，如錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司、黑龍江江世藥業(yè)有限公司、吉林康乃爾藥業(yè)有限公司等等，其中制劑原料有來(lái)自血清、全血、紅細(xì)胞三種形式。專利96120777、200510132478. O公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復(fù)合蛋白酶水解，離心分離留上清，將上清液中的乙醇濃縮，濃縮液用超濾截留，即得到小牛血去蛋白提取液。該方法采用低溫離心方式進(jìn)行分離，對(duì)工藝設(shè)備要求較高，同時(shí)能耗也較大。專利200710194950. 2公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括采幼牛靜脈血，離心得到血清，加熱除蛋白，濾液濃縮后加乙醇進(jìn)行醇沉，過(guò)濾并濃縮濾液，得到醇沉后的濾液，濾液調(diào)酸性并加入活性炭脫色，過(guò)濾收集濾液，濾液調(diào)至堿性，冷凍除蛋白，過(guò)濾得到的濾液用纖維膜超濾除高分子物質(zhì)，反復(fù)2 5次，過(guò)濾即得到小牛血去蛋白提取物。該方法冷凍除蛋白的條件為-50 0°C，時(shí)間為12 72小時(shí)，且需反復(fù)2 5次，工序較長(zhǎng)，能耗較大。專利200610080520. 3公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括采幼牛靜脈血，分離出血清，用乙醇去蛋白，減壓去除乙醇，加入復(fù)合蛋白酶水解，離心分離留上清，上清液以截留分子量為5000道爾頓的中空纖維柱超濾，然后分別過(guò)葡聚糖G-15凝膠柱、Sephadex-50凝膠柱,特征性收集280nm處有特異吸收的懼分,最后采用微孔濾膜過(guò)濾和紫外線滅活。該方法采用葡聚糖G-15凝膠柱、Sephadex-50凝膠柱分離純化，分離效率偏低，產(chǎn)業(yè)化存在一定難度。專利200810094486. 4公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血清用96%乙醇進(jìn)行醇沉，離心后留上清濃縮后用截留分子量100000D的中空纖維柱粗濾，濾液依次用甲苯、乙酸乙酯、正丁醇萃取，保留水層，水層溶液濃縮后用BI0-GEL-P2凝膠層析分離；即為小牛血清去蛋白提取液。該方法采用有機(jī)溶劑萃取和柱層析結(jié)合的方式進(jìn)行分離純化，不僅會(huì)導(dǎo)致效率不高，同時(shí)甲苯二類溶劑會(huì)影響產(chǎn)品的安全性。專利200710117951. 7公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血清先用紗布粗濾，去除纖維蛋白后，以500(Tl0000rpm離心2min,然后依次用濾紙過(guò)濾、O. 2 μ m濾膜精濾、10000^20000分子量的超濾器進(jìn)行超濾、5000-8000分子量的超濾器進(jìn)行超濾，將超濾液濃縮后調(diào)PH值至6. 5^7. 5，滅菌后冷凍f 2d，緩化放置3 15d，調(diào)pH值至
5.5飛.5，再用6000分子量的超濾器進(jìn)行超濾，經(jīng)O. 2 μ m濾膜精濾和滅菌。該方法生產(chǎn)周期長(zhǎng)，會(huì)影響生產(chǎn)效率；滅菌冷凍后緩化3 15天對(duì)工作廠地大小和環(huán)境有較高要求，將制約生產(chǎn)產(chǎn)能和生產(chǎn)效率。專利200810148841. I公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血全血依次經(jīng)過(guò)酸沉、冷凍、融化、收集離心后上清液，上清液依次再經(jīng)過(guò)堿沉、冷凍、融化、離心，離心上清液再進(jìn)行酸沉，上清液依次進(jìn)行反滲透濃縮、中空纖維柱超濾。該方法需要冷凍至-20°C，再在40°C條件下融化，整個(gè)生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)效率不高。專利200910246717. 3,200510076914. 7制備方法中均加入了枸椽酸鈉，并在低溫保存后收集上清液，上清液加入胃蛋白酶酶解，并過(guò)活性碳柱或者殼聚糖改性活性碳柱。該 制備方法采用了酶解工藝，容易產(chǎn)生雜質(zhì)，同時(shí)上清液過(guò)活性炭柱無(wú)法控制產(chǎn)品的無(wú)菌。專利201010291699. 3公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血進(jìn)行反復(fù)低溫冷凍、升溫后再加入注射用水，離心得上清液，上清液冷卻至_5°C，攪拌加入-1(T-2(TC的冷丙酮，低溫環(huán)境下靜置后離心得上清液；上清液濃縮后依次調(diào)節(jié)pH值3. 5 4. 5,7. 5 8. 5離心得上清液，上清液然后pH值6. 5 7. 5后，然后再分別利用50KD，IOKD和5KD超濾膜逐級(jí)超濾澄清。該制備方法需在低溫條件下進(jìn)行，對(duì)工藝設(shè)備要求較高，同時(shí)該工藝存在多次調(diào)PH值工序的問(wèn)題，耗時(shí)較長(zhǎng)。專利200410062657. 7公開(kāi)了一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括小牛血離心得紅細(xì)胞，加水凍溶，破壞紅細(xì)胞膜，釋放出內(nèi)容物，離心，得到去除部分大分子量蛋白質(zhì)的上清液，對(duì)上清液進(jìn)行巴氏消毒，然后進(jìn)行超濾、納濾脫鹽、反滲透濃縮，最后醫(yī)用活性炭脫色。該方法采用超慮、納濾、反滲透濃縮技術(shù)，其中納濾對(duì)液體中分子量為數(shù)百的有機(jī)小分子具有分離性能，而小牛血去蛋白提取物分子量一般控制在5000道爾頓，其工藝會(huì)損失部分活性成分。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種制備小牛血去蛋白提取物的方法，應(yīng)用該方法制備的提取物總固體含量、呼吸活力、刺激指數(shù)均符合藥用要求，蛋白質(zhì)、高分子量物質(zhì)也能得到有效控制，從而保證了小牛血制劑的原料質(zhì)量，減低小牛血制劑臨床使用的風(fēng)險(xiǎn)，該制備方法同時(shí)具備操作簡(jiǎn)便，易于產(chǎn)業(yè)化的特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案制備小牛血去蛋白提取物
(1)取小牛全血,加入體積為I.5^2倍全血量的純化水，不斷攪拌,并加熱至體系(小牛全血與水的混合物)溫度達(dá)到80°C，對(duì)小牛血進(jìn)行滅活；
(2)滅活后的小牛血降至室溫，并向體系中加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離全部上清液；
(3)合并步驟(2)兩次得到的上清液，并對(duì)上清液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液倒入澄清過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾；(4)濾液用稀鹽酸調(diào)pH呈弱酸性，然后向弱酸性濾液中加入針用活性炭，進(jìn)行脫色；
(5)依次使用鈦棒過(guò)濾、微孔濾膜過(guò)濾、富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。所述步驟(I)加入I. 5 2倍全血量的純化水，不僅可以減低體系的粘度，便于攪拌，此外，純化水的加入降低細(xì)胞外溶液的濃度，在滲透壓的作用下，細(xì)胞發(fā)生吸水溶脹，在外力攪拌作用下利于細(xì)胞破裂而釋放內(nèi)容物，可提高小牛全血利用率。攪拌過(guò)程中加熱使體系溫度達(dá)到80°C，并保溫30mirT40min，以殺滅小牛全血中的病毒，同時(shí)使部分蛋白變
性。 所述步驟(2)向體系中加入80% 90% (v/v)乙醇量為小牛全血量的4飛倍，攪拌均勻，靜置36h，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入小牛全血量4飛倍80% 90% (v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置12h，分離全部上清液；
所述步驟(3)對(duì)上清液采用單效濃縮器進(jìn)行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa O. 08Mpa，蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在40°C 50°C，濃縮液與上清液的體積比控制在1:20(Γ250，濃縮液倒入澄清過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。所述步驟(4)濾液采用質(zhì)量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. O 5. O之間，按濾液體積O. 5 °/Γθ. 9%的量加入針劑用活性炭，攪拌，加熱至80°C并保溫30min。所述步驟(5)先用鈦棒濾炭后，再用裝有0.22 μ m微孔濾膜的平板濾器過(guò)濾，上述濾液再用富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。小牛血去蛋白提取物廣泛應(yīng)用于注射液、凍干粉針、膠囊劑、外用制劑或眼用制劑等制劑，采用本發(fā)明技術(shù)方案制備的小牛血去蛋白提取物所制備的小牛血去蛋白提取物注射液和注射用小牛血去蛋白提取物的呼吸活力、總固體含量、游離氨基酸等檢測(cè)項(xiàng)目均符合藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，尤其是本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的小牛血去蛋白提取物制備的注射用小牛血去蛋白提取物在不加任何制劑輔料即可制備出成型性良好的合格產(chǎn)品，可降低了輔料對(duì)制劑造成的安全隱患，可提高制劑的安全性。本發(fā)明能夠達(dá)到以下技術(shù)效果
本發(fā)明通過(guò)對(duì)醇沉工藝、脫色工藝、過(guò)濾材料組合使用來(lái)實(shí)現(xiàn)小牛血去蛋白提取物的制備，避免了現(xiàn)有提取技術(shù)中萃取、柱層析等不利于產(chǎn)業(yè)化的操作步驟，具有操作簡(jiǎn)便，便于工藝化大生產(chǎn)，條件溫和的特點(diǎn)，減少了小牛血活性成分的破壞，可有效提高提取物的內(nèi)在質(zhì)量；小牛血去蛋白提取物采用小牛全血作為提取原料，并通過(guò)加適量純化水使細(xì)胞溶脹，加速細(xì)胞的破裂釋放內(nèi)容物，在滿足制劑質(zhì)量要求的前提下，提高了小牛全血利用率；此外，本發(fā)明制備的小牛血去蛋白提取物制備注射用凍干粉針劑時(shí)可以不添加甘露醇等任何賦形劑即可達(dá)到理想的制備效果，可消除輔料的安全隱患。


圖I為小牛血去蛋白提取物制備工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。在本說(shuō)明書(shū)中，除非特別指明，否則所用技術(shù)術(shù)語(yǔ)為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員常用術(shù)語(yǔ)；本說(shuō)明書(shū)中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法；本說(shuō)明書(shū)中所用的試驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品，各種試劑的成分和配制方法可參見(jiàn)常規(guī)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中的操作。如圖I所示，一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括以下步驟 (1)取小牛全血(濉溪縣匯豐生物科技有限公司)，加入體積為I.5 2倍全血量的純化水(不僅可以減低體系的粘度，便于攪拌，此外，純化水的加入降低細(xì)胞外溶液的濃度，在滲透壓的作用下，細(xì)胞發(fā)生吸水溶脹，在外力攪拌作用下利于細(xì)胞破裂而釋放內(nèi)容物，可提高小牛全血利用率)，不斷攪拌，并加熱至體系(小牛全血與水的混合物)溫度達(dá)到80°C，并保溫30mirT40min，以殺滅小牛全血中的病毒，同時(shí)使部分蛋白變性；
(2)滅活后的小牛血降至室溫，并向體系(小牛全血與水的混合物)中加入體積為小牛全血量4 5倍的80% 90% (v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置36h，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入體積為小牛全血量4飛倍80% 90%(v/v)的乙醇，攪拌均勻，靜置12h，分離全部上清液；
(3)合并步驟(2)兩次得到的上清液，并對(duì)上清液采用單效濃縮器進(jìn)行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa O. 08Mpa,蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，料液濃縮溫度控制在400C 50°C，濃縮液與上清液的體積比控制在1:200^250,濃縮液倒入澄清過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾；
(4)濾液用質(zhì)量濃度為9.5^10. 5%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. O 5. O之間，按濾液體積O. 59Π). 9%的量加入針劑用活性炭，攪拌，加熱至80°C并保溫30min，進(jìn)行脫色；
(5)先用鈦棒濾炭后，再用裝有O.22 μ m微孔濾膜的平板濾器過(guò)濾，上述濾液再用FVRG75型富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例I :
取小牛全血(濉溪縣匯豐生物科技有限公司)2000ml，加純化水3000ml，升溫至80°C，不斷攪拌并保溫30min以滅活，冷卻至常溫后加入80% 90%(v/v)乙醇8000ml，攪拌3h后，靜置36h，分離約4000ml上清液，向母液再加入80% 90%(v/v)乙醇8000ml，攪拌3h后，靜置12h，分離上清液。上清液采用單效濃縮器進(jìn)行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa左右，蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在40°C左右，濃縮至濃縮液約50ml，即濃縮液與上清液的體積比控制約1:200，將濃縮液倒入澄清過(guò)濾器過(guò)濾，向?yàn)V液中加入質(zhì)量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸，調(diào)節(jié)pH至4. O,按濃縮液體積O. 5%加針劑用活性炭，不斷攪拌，加熱至80°C并保溫30min，濃縮液先用鈦棒濾炭，再用O. 22 μ m微孔濾膜的平板濾器進(jìn)行過(guò)濾，最后采用富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。實(shí)施例2
取小牛全血(濉溪縣匯豐生物科技有限公司)2000ml，加純化水4000ml，升溫至80°C，不斷攪拌并保溫30min以滅活，冷卻至常溫后加入80% 90%(v/v)乙醇10000ml，攪拌3h后，靜置36h,分離約7000ml上清液，向母液再加入80% 90%(v/v)乙醇10000ml,攪拌3h后，靜置12h，分離上清液。上清液采用單效濃縮器進(jìn)行減壓濃縮，真空壓力控制在O. OSMpa左右，蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在50°C左右，濃縮至濃縮液約60ml,即濃縮液與上清液的體積比控制約1:250，將濃縮液倒入澄清過(guò)濾器過(guò)濾，向?yàn)V液中加入質(zhì)量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸，調(diào)節(jié)pH至5. 0，按濃縮液體積O. 9%加針劑用活性炭，不斷攪拌，加熱至80°C并保溫30min，濃縮液先用鈦棒濾炭，再用O. 22 μ m微孔濾膜的平板濾器進(jìn)行過(guò)濾，最后采用富士濾器超濾，截留分子量約5000道爾頓，即得小牛血去蛋白提取物。
實(shí)施例 3
小牛血去蛋白提取物脫色采用活性碳吸附，為了達(dá)到理想的脫色效果，對(duì)活性炭使用量、溶液的PH值范圍進(jìn)行了考察，采用質(zhì)量濃度為9. 5^10. 5%的稀鹽酸使溶液呈弱酸性，然后向弱酸性溶液中加入針用活性炭，不斷攪拌下加熱至80°C并保溫30min，對(duì)比例的試驗(yàn)條件見(jiàn)表I，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表I對(duì)比例的試驗(yàn)條件
權(quán)利要求
1.一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)取小牛全血，加入I.5^2倍全血量的純化水，不斷攪拌，并加熱至體系溫度達(dá)到80°C，對(duì)小牛血進(jìn)行滅活； (2)滅活后的小牛血降至室溫，并向體系中加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置，分離全部上清液； (3)合并步驟(2)兩次得到的上清液，并對(duì)上清液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液倒入澄清過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾； (4)濾液用稀鹽酸調(diào)pH呈弱酸性，然后向弱酸性濾液中加入針用活性炭，進(jìn)行脫色； (5)依次使用鈦棒過(guò)濾、微孔濾膜過(guò)濾、富士濾器超濾，即得小牛血去蛋白提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，加入體積為1.5 2倍全血量的純化水，不斷攪拌，并加熱小牛全血與水的混合物體系達(dá)到80°C，并保溫30min、0min,以通過(guò)加熱對(duì)小牛血進(jìn)行滅活。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，向小牛全血與水的混合物體系中加入體積為小牛全血量4飛倍的80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置36h，分離1/3 1/2上清液，母液再次加入體積為小牛全血量4飛倍的80% 90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置12h，分離全部上清液。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，對(duì)上清液采用單效濃縮器進(jìn)行減壓濃縮，真空壓力控制在O. 06Mpa O. 08Mpa,蒸汽壓力控制在O. OlMPa以下，上清液濃縮溫度控制在40°C 50°C，濃縮液與上清液的體積比控制在1:200 250，濃縮液倒入澄清過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，濾液采用質(zhì)量濃度為9.5^10. 5%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. O 5. O之間，按濾液體積O. 5 °Γθ. 9%的量加入針劑用活性炭，攪拌，加熱至80°C并保溫30min。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，先用鈦棒濾炭后，再用裝有O. 22 μ m微孔濾膜的平板濾器過(guò)濾，上述濾液再用富士濾器超濾，即得小牛血去蛋白提取物。
7.一種小牛血去蛋白提取物，其特征在于，所述小牛血去蛋白提取物通過(guò)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法制得。
8.—種權(quán)利要求7所述小牛血去蛋白提取物在注射液、凍干粉針、膠囊劑、外用制劑或眼用制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小牛血去蛋白提取物及其制備方法，該方法包括取小牛全血，加入1.5~2倍全血量的純化水，不斷攪拌，并加熱至體系溫度達(dá)到80℃，對(duì)小牛血進(jìn)行滅活；滅活后的小牛血降至室溫，并向體系中加入80%～90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置36小時(shí)，分離1/3~1/2上清液，母液再次加入80%～90%(v/v)乙醇，攪拌均勻，靜置12小時(shí)，分離全部上清液；合并兩次得到的上清液，并對(duì)上清液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液倒入澄清過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾；濾液用稀鹽酸調(diào)pH呈弱酸性，然后向弱酸性濾液中加入針用活性炭進(jìn)行脫色；依次使用鈦棒過(guò)濾、微孔濾膜過(guò)濾、富士濾器超濾，即得小牛血去蛋白提取物。本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)便，便于工藝化大生產(chǎn)，條件溫和的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102846664SQ20121030511
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者鄧霞飛, 劉紅華, 李青, 盧山, 陸毅, 高光田 申請(qǐng)人:武漢人福藥業(yè)有限責(zé)任公司