抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途
【專利摘要】本發明涉及抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途。具體地，本發明通過大量篩選和分析kozak序列，發現具有大幅度提高HPVL1蛋白表達水平的kozak序列；并對人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1(HPV?L1)的16、18和58基因進行重新設計和序列優化，排除影響翻譯的mRNA的二級結構，并據此構建高表達的HPV?L1基因表達盒，所述表達盒尤其適用于在畢赤酵母中表達，并具有蛋白表達量高、穩定性好的特點。
【專利說明】抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程和疫苗學領域，具體地，本發明涉及抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途。
【背景技術】
[0002]宮頸癌是常見的婦科惡性疾病，在最常見的婦女癌癥中，宮頸癌的發病率高居第二。HPV (乳頭瘤病毒)病毒感染與宮頸癌的發生密切相關，人類至今已經分離到了至少118種乳頭瘤病毒。目前已證實，在肛生殖系統癌癥中，由HPV感染所誘發的癌癥占3.7%。
[0003]在已被分離出的HPV病毒亞型中，已發現有15種具有誘導生殖系統癌癥的發生，因而被歸為高危性HPV病毒亞型(如HPV16, 18，31，33，52和58)，其中HPV16和HPV18兩種亞型在全世界占所有由HPV感染誘發宮頸癌的70%。繼HPV16和HPV18之后，HPV58和HPV52在亞洲和非洲具有高患病率，占全世界宮頸癌發病率的2-3%。大規模中國婦女HPV病毒亞型分布分析表明，整體上HPV的患病率(包括高危和低危HPV病毒亞型)在侵入性子宮頸癌(ICC)為82.7%，在高度鱗狀上皮內病變(HSIL)中為88.5%，在低度鱗狀上皮內病變(LSIL)為 69.3%ο
[0004]HPV是一種DNA病毒，直徑約為45_55nm，呈球形，無包膜，衣殼為72個殼微粒組成對稱偏斜的20面體，其病毒顆粒衣殼由主要衣殼蛋白(LI)和次要衣殼蛋白(L2)組成。主要衣殼蛋白LI在細胞中表達后能自動組裝成衣殼顆粒，稱為病毒樣顆粒(VLPs)，該顆粒與天然病毒有相似的空間構象、免疫特性和生物學活性，并可以大規模制備和純化。
[0005]含不同亞型或混合型HPV的VLPs/Ll蛋白預防性疫苗已相繼被成功研制并開始在臨床實驗上使用。美國默克 公司研究出了含有HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的四價疫苗(商品名Gardasil)，已獲FDA批準并在美國上市，英國的葛蘭素史克公司也研究出了含有HPV16和HPV18的兩價疫苗。
[0006]但是，就目前的HPV疫苗的生產工藝而言，大多采用大腸桿菌、釀酒酵母(如Merk公司)或昆蟲細胞(如葛蘭素史克公司)作為反應器進行生產。大腸桿菌表達的LI蛋白不能被正確折疊和修飾，并以包涵體的形式表達，因此要組裝成病毒樣顆粒LI蛋白需要經過變性和復性的過程，純化工藝復雜，同時體外組裝的病毒樣顆粒的免疫原性低于真核表達并自主組裝的病毒樣顆粒。用釀酒酵母生產HPV的VLP也存在一些明顯的缺點，例如，釀酒酵母中的外源HPVLl基因存在于質粒而非染色體上，導致分泌效率差、表達菌株不夠穩定、在生產過程中易發生質粒丟失等現象。此外，釀酒酵母的分泌蛋白平均每條側鏈有50-150個甘露糖殘基，這種過度的糖基化導致所生產的VLP在某些個體中產生不利的過敏反應；釀酒酵母無法采用高密度發酵，發酵成本很高。
[0007]目前為止，還沒有人體對具有不同基因型的各HPV病毒亞型之間存在交叉反應的報道，因此針對某一病毒亞型的特異性疫苗通常只能使得接種者對該特定病毒亞型有預防效果。為使易感人群或患者具有針對抗一種以上病毒亞型(尤其是多種高危HPV)的預防免疫功能或治療效果，迫切需要對該人群聯合施用針對幾種相應的不同病毒亞型疫苗。[0008]總之，本領域目前尚缺乏低成本、高效率的多種HPV LI蛋白或VLP的制備方法，因此迫切需要開發新的高效、簡便、低成本地制備HPV的LI蛋白或VLP的方法，尤其是制備同時含有HPV16、HPV18和HPV58的LI蛋白或VLP的方法，以便能夠開發針對多種特定亞型的疫苗。

【發明內容】

[0009]本發明的目的是提供非常適于在畢赤酵母中表達HPVLl蛋白的kozak序列以及HPVLl表達盒。
[0010]本發明的另一目的是提供一種優化的人乳頭瘤狀病毒16、18和58L1蛋白的核酸序列。
[0011]本發明的另一目的是提供一種制備抗人乳頭瘤狀病毒的疫苗的制備方法。
[0012]在本發明的第一方面，提供了一種編碼人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白LI的核酸分子，所述的核酸分子選自下組:
[0013](I)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 3所示，或與SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 2相同或基本相同；
[0014](2)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 6所示或，或與SEQ ID N0.: 6所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 5相同或基本相同；
[0015](3)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 9所示，或與SEQ ID N0.: 9所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
[0016]在另一優選例中，所述的基本相同為氨基酸序列的同源性> 98%，較佳地> 99%。
[0017]在另一優選例中，序列如SEQ ID N0.:3所示的核酸分子編碼野生型人乳頭瘤病毒HPV16L1 蛋白。
[0018]在另一優選例中，序列如SEQ ID N0.:6所示的核酸分子編碼野生型人乳頭瘤病毒HPV18L1 蛋白。
[0019]在另一優選例中，序列如SEQ ID N0.:9所示的核酸分子編碼野生型人乳頭瘤病毒HPV58L1 蛋白。
[0020]在本發明的第二方面，提供了一種人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白HPVLl的表達盒，所述表達盒的5’ -3’依次具有下述元件:kozak序列、HPVLl編碼序列、和終止子。[0021 ]在另一優選例中，所述的 kozak 序列為:5 ’ - (A/T) A (A/C) AA (A/C) ATGTC (T/C) _3 ’。
[0022]在另一優選例中，所述的kozak序列任選自SEQ ID N0.: 10-25，較佳地任選自SEQID NO: 10、12、14 或 22，更佳地為 SEQ ID NO: 10。
[0023]在另一優選例中，所述HPVLl編碼序列選自下組:
[0024](I)序列如SEQ ID N0.:3所示，或與SEQ ID N0.:3所示序列的同源性> 95% (較佳地≥98%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 2相同或基本相同；
[0025](2)序列如SEQ ID N0.:6所示，或與SEQ ID N0.:6所示序列的同源性> 95% (較佳地≥98%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 5相同或基本相同；[0026](3)序列如SEQ ID N0.:9所示，或與SEQ ID N0.:9所示序列的同源性≥95% (較佳地≥98%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
[0027]在本發明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發明第一方面所述的核酸分子或本發明第二方面所述的表達盒。
[0028]在另一優選例中，所述載體為pPIC3.5和pPIC3.5K，較佳地為pPIC3.5K。
[0029]在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有本發明的第三方面所述的載體或染色體整合有本發明第一方面所述的核酸分子或本發明第二方面所述的
表達盒。
[0030]在另一優選例中，所述宿主細胞為畢赤酵母。
[0031]在另一優選例中，所述宿主細胞的染色體具有1-50個拷貝的本發明第一方面所述的核酸分子或本發明第二方面所述的表達盒。
[0032]在另一優選例中，所述宿主細胞的染色體具有2-10個拷貝，較佳地3-7個拷貝的本發明第一方面所述的核酸分子或本發明第二方面所述的HPVLl基因表達盒。
[0033]在本發明的第五方面，提供了一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白的方法，包括步驟:
[0034](i)在適合的條件下，培養本發明的第四方面所述的宿主細胞，所述宿主細胞為畢赤酵母，從而表達出人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白；和
[0035](ii)分離所述蛋白。
[0036]在另一優選例中，所述的人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白選自下組:HPV16L1 ；HPV18L1 ；或 HPV58L1。
[0037]在本發明的第六方面，提供了一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒的方法，包括步驟:
[0038](a)在適合的條件下，培養本發明的第四方面所述的宿主細胞，所述宿主細胞為畢赤酵母，從而產生人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒；和
[0039](b)分離所述病毒樣顆粒。
[0040]在另一優選例中，所述的人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒選自下組:HPV16L1病毒樣顆粒；HPV18L1病毒樣顆粒；*HPV58L1病毒樣顆粒。
[0041]在本發明的第七方面，提供了一種制備疫苗組合物的方法，包括步驟:
[0042]將本發明的第五方面所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白或本發明的第六方面所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒與藥學上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成疫苗組合物。
[0043]在另一優選例中，所述的人乳頭瘤病毒LI蛋白為HPV16L1 ；HPV18L1 ;*HPV58L1。
[0044]在另一優選例中，所述的HPVLl病毒樣顆粒為:HPV16L1病毒樣顆粒；HPV18L1病毒樣顆粒；或HPV58L1病毒樣顆粒。
[0045]在另一優選例中，所述的佐劑為鋁佐劑、GLA佐劑，更佳的為GLA佐劑。
[0046]在本發明的第八方面，提供了一種制備人乳頭瘤三價疫苗的方法，包括步驟:
[0047](a)在適合的條件下，培養本發明的第四方面所述的宿主細胞，所述宿主細胞為畢赤酵母，從而分別產生HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒；和[0048](b)分離所述HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒，將所述病毒樣顆粒與藥學上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成三價疫苗。
[0049]在另一優選例中，所述的疫苗佐劑為鋁佐劑、GLA佐劑，更佳的為GLA佐劑。
[0050]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1顯示kozak序列優化結果，其中，圖1A為16個kozak序列對目的蛋白產量的提高效果，其中，第I個、第3個、第5個和第13個的kozak序列的效果最明顯，分別提高了
1.5倍-2.2倍,最優的kozak序列是第I個kozak序列；圖1B為相應的Western Blot實驗結果。
[0052]圖2顯示了宿主細胞的染色體中HPV16L1基因拷貝數對目的蛋白產量的影響，其中，圖2A顯示，拷貝數越多，HPV16L1蛋白的產量越高；圖2B為基因拷貝數對目的蛋白產量Western Blot實驗結果。
[0053]圖3顯示了宿主細胞的染色體中多拷貝HPV18L1基因鑒定結果見，圖3A顯示不同的基因拷貝數對目的蛋白產量的影響，結果表明，在不同的宿主中，HPV18L1基因的拷貝數為1-3，拷貝數越多，HPV18L1蛋白的產量越高；圖3B為基因拷貝數對目的蛋白產量的Western Blot實驗結果。
[0054]圖4顯示了宿主細胞的染色體中多拷貝HPV58L1基因鑒定結果，圖4A顯示，不同的基因拷貝數對目的蛋白產量的影響，在不同的宿主中，HPV18L1基因的拷貝數為1-3，拷貝數越多，HPV18L1蛋白的產量越高；圖4B為基因拷貝數對目的蛋白產量的Western Blot實驗結果。
`[0055]圖5顯示體外重組蛋白的表達結果；圖5A表明，目的蛋白在12h開始表達，到48h達到高峰，在48-96h表達穩定；圖5B顯示優化后的HPV16L1的表達體系在各個時間點其目的蛋白的Western Blot實驗結果。
[0056]圖6顯示HPV16L1表達蛋白電泳結果，泳道1_9分別代表不同洗脫組分，目的蛋白約56kD，其純度約為90.0%。
[0057]圖7顯示自組裝HPV16L1病毒樣顆粒鑒定結果，組裝HPV16L1病毒樣顆粒大小不均一，顆粒直徑分布在25nm至65nm之間，平均粒徑45nm，與基因序列未優化HPV的VLP的顆粒直徑分布相同。
【具體實施方式】
[0058]本發明人通過廣泛而深入的研究，篩選并優化了大量的kozak序列，意外地發現了可以在畢赤酵母中極大促進HPVLl蛋白表達的kozak序列，并據此構建了含有kozak序列的HPVLl基因表達盒；本發明人還對人乳頭瘤狀病毒HPV16L1、HPV18L1和HPV58L1的基因序列進行了針對性地優化設計，從而大大提高了目的蛋白產量；本發明還提供了具有高拷貝HPVLl基因的宿主細胞，所述宿主細胞生產HPVLl目的蛋白的能力可以提高16倍以上。在此基礎上完成了本發明。[0059]術語
[0060]如本文所用，術語“病毒樣顆粒”或“VLP”或“VLPs”指通過體外基因重組技術獲得的病毒樣顆粒(Virus-like particle, VLP),它具有天然病毒的外部結構,但不包含病毒DNA/RNA,因此VLP在體內不會復制，提高了疫苗應用的安全性，同時，VLP具有極好的免疫原性。
[0061]如本文所用，術語“HPVL1”指人乳頭瘤狀病毒HPV的主要衣殼蛋白LI。
[0062]如本文所用，術語“HPV VLP”指由人乳頭瘤狀病毒HPV的主要衣殼蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0063]如本文所用，術語“HPV16L1”和“HPV16L1VLP”分別指人乳頭瘤狀病毒HPV16的主要衣殼蛋白LI和由該LI蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0064]如本文所用，術語“HPV18L1”和“HPV18L1VLP”分別指人乳頭瘤病毒HPV18的主要衣殼蛋白LI和由該LI蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0065]如本文所用，術語“HPV58L1”和“HPV58L1VLP”分別指人乳頭瘤病毒HPV58的主要衣殼蛋白LI和由該LI蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0066]kozak序列篩選及優化
[0067]如本文所用，術語kozak序列(kozak consensus sequence)是指存在于起始密碼子AUG附近的一段序列，其在翻譯的起始中有重要作用。在真核細胞中，翻譯的起始位點大多在5'端的AUG密碼子位點。當與mRNA的5'端帽子結構結合后，核糖體的40S小亞基對mRNA進行掃描，直到遇到第一個AUG密碼子。核糖體的40S小亞基對AUG周圍核酸序列的識別在很大程度上引發翻譯的起始，并影響翻譯效率。
[0068]本發明提供了一類特別適合在畢赤酵母中調控HPV LI蛋白表達的kozak序列，所述的 kozak 序列為:5，- (A/T) A (A/C) AA (A/C) ATGTC (T/C) 3’。
[0069]本發明人篩選并優化了大量的kozak序列，各個kozak序列的信息見表1。并將所述kozak序列與編碼HPV16L1、HPV18L1、或HPV58L1的核苷酸序列連接。
[0070]測試所優化和篩選的kozak序列在畢赤酵母中對基因表達的影響，發現其中有4個經優化的kozak序列能夠大幅度提聞目的蛋白的表達效率(最聞可以達到2倍以上)。4個經優化的kozak序列為:第I個kozak序列(SEQ ID N0.10)、第3個kozak序列(SEQ IDN0.12)、第 5 個 kozak 序列(SEQ ID N0.14)、和第 13 個 kozak 序列(SEQ ID N0.22)。
[0071]表1
[0072]
【權利要求】
1.一種編碼人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白LI的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子選自下組: (1)核酸分子的序列如SEQID N0.:3所示，或與SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 2相同或基本相同； (2)核酸分子的序列如SEQID N0.:6所示或，或與SEQ ID N0.:6所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 5相同或基本相同； (3)核酸分子的序列如SEQID N0.:9所示，或與SEQ ID N0.:9所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
2.一種人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白HPVLl的表達盒，其特征在于，所述表達盒的5’ -3’依次具有下述元件:kozak序列、HPVLl編碼序列、和終止子。
3.如權利要求2所述的表達盒，其特征在于，所述的kozak序列為:5’-(A/T)A(A/C)AA (A/C)ATGTC(T/C) -3’。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1所述的核酸分子或權利要求2所述的表達盒。
5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求4所述的載體或染色體整合有權利要求1所述的核酸分子或權利要求2所述的表達盒。
6.如權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞的染色體具有1-50個拷貝的權利要求1所述的核酸分子或權利要求2所述的表達盒。
7.一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白的方法，其特征在于，包括步驟: (i)在適合的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞，所述宿主細胞為畢赤酵母，從而表達出人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白；和 (?)分離所述蛋白。
8.一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒的方法，其特征在于，包括步驟: (a)在適合的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞，所述宿主細胞為畢赤酵母，從而產生人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒；和 (b)分離所述病毒樣顆粒。
9.一種制備疫苗組合物的方法，其特征在于，包括步驟:將權利要求7所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白或權利要求8所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒與藥學上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成疫苗組合物。
10.一種制備人乳頭瘤三價疫苗的方法，其特征在于，包括步驟: (a)在適合的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞，所述宿主細胞為畢赤酵母，從而分別產生HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒；和 (b)分離所述HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒，將所述病毒樣顆粒與藥學上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成三價疫苗。
【文檔編號】A61P31/20GK103667319SQ201210333085
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優先權日:2012年9月10日
【發明者】潘衛慶, 徐新東, 張遠斌 申請人:同濟大學