專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于治療乳腺癌的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物及其制備方法，尤其是一種用于治療乳腺癌的藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
·乳腺癌是女性排名第一的常見(jiàn)惡性腫瘤。2011年美國(guó)CA:A Cancer Journal forClinicians雜志(2010年影響因子94. 262)公布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)2011年預(yù)計(jì)將有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30%，排名女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位。在我國(guó)北京、上海、天津等大城市的統(tǒng)計(jì)顯示乳腺癌同樣是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。現(xiàn)有的乳腺癌治療過(guò)程中對(duì)患者免疫系統(tǒng)的損害極大，導(dǎo)致腫瘤治療過(guò)程中遇到無(wú)法突破的瓶頸，腫瘤無(wú)法完全治愈。現(xiàn)階段細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells, CIK)是具有細(xì)胞毒作用的免疫活性細(xì)胞；樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)是最具潛力的抗原提呈細(xì)胞，在初始性免疫和獲得性免疫中具有重要作用。因此將CIK聯(lián)合DC進(jìn)行耐藥乳腺癌的聯(lián)合治療具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種用于治療乳腺癌的藥物。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供上述用于治療乳腺癌的藥物的制備方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種用于治療乳腺癌的藥物，為抗原沖擊的DC與CIK的共培養(yǎng)物(簡(jiǎn)稱(chēng)AP-DC+CIK的組合方式)，其中，所述抗原為凍融抗原，是由下述方法得到的收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，制成濃度為I X 107/mL的細(xì)胞懸液，加入100 u L生理鹽水中，放入液氣中，5min后,迅速放入37 C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氣中，反復(fù)3次，微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，4°C保存?zhèn)溆茫凰隹乖瓫_擊的DC是由下述方法得到的收集健康人外周血細(xì)胞，通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液體分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)2h后，收集黏附細(xì)胞，加培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為I X IOVmL,接種于24孔培養(yǎng)板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM_CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)，48h進(jìn)行半量換液并加入首次濃度1/2量的上述細(xì)胞因子，在培養(yǎng)到第5天時(shí)，部分DC和上述凍融抗原按原細(xì)胞數(shù)I : 5進(jìn)行凍融抗原沖擊，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續(xù)培養(yǎng)至第8天；所述CIK是由下述方法得到的收集單個(gè)核細(xì)胞中的非黏附細(xì)胞，并用R/MINI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為3 X 107mL，接種于24孔平底培養(yǎng)板，當(dāng)天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3單抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養(yǎng)液全量換液，培養(yǎng)到第7天。優(yōu)選的，上述用于治療乳腺癌的藥物，所述DC與CIK細(xì)胞的體積比為I : 10。上述用于治療乳腺癌的藥物的制備方法，將抗原沖擊的DC與CIK進(jìn)行共培養(yǎng)，具體步驟為(I)制備抗原收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，制成濃度為IXlOVmL的細(xì)胞懸液，加入IOOii L生理鹽水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)3次，微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，4°C保存?zhèn)溆茫玫絻鋈诳乖?
(2)制備抗原沖擊的DC :收集健康人外周血細(xì)胞，通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液體分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)2h后，收集黏附細(xì)胞，加培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為I X 106/mL,接種于24孔培養(yǎng)板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL-4，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)，48h進(jìn)行半量換液并加入首次濃度1/2量的上述細(xì)胞因子，在培養(yǎng)到第5天時(shí)，部分DC和上述凍融抗原按原細(xì)胞數(shù)I : 5進(jìn)行凍融抗原沖擊，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續(xù)培養(yǎng)至第8天；(3)所述CIK是由下述方法得到的收集單個(gè)核細(xì)胞中的非黏附細(xì)胞，并用R/MINI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為3 X 107mL，接種于24孔平底培養(yǎng)板，當(dāng)天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3單抗50 u g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養(yǎng)液全量換液，培養(yǎng)到第7天；(4)將上述CIK細(xì)胞與上述抗原沖擊的DC繼續(xù)共培養(yǎng)。優(yōu)選的，上述用于治療乳腺癌的藥物的制備方法，所述步驟(4)中DC與CIK細(xì)胞按照體積比I : 10的比例共培養(yǎng)15天。本發(fā)明的有益效果是上述用于治療乳腺癌的藥物，其中CIK細(xì)胞是來(lái)源于T淋巴細(xì)胞的具有免疫活性的異質(zhì)細(xì)胞群，具有較強(qiáng)的抗腫瘤毒性，可以殺傷對(duì)化療耐藥的腫瘤細(xì)胞，是治療多藥耐藥腫瘤的最具潛力的方法，DC細(xì)胞是最具潛力的抗原提呈細(xì)胞，可以識(shí)別、加工、提呈抗原給T細(xì)胞，是激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體，AP-DC+CIK的組合方式對(duì)于抑制腫瘤的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的效果突出；所述制備方法簡(jiǎn)單，適合規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)的需要。


圖I是各組腫瘤標(biāo)本RT-PCR檢測(cè)MDRl和P -actin結(jié)果，其中I :AP_DC+CIK治療組，2 DC+CIK治療組，3 :CIK單獨(dú)治療組，4 :生理鹽水對(duì)照組；圖2是TUNEL染色檢測(cè)示腫瘤細(xì)胞凋亡(TUNEL X 400)； 圖3是各組荷瘤標(biāo)本BCL-2染色結(jié)果(免疫組化X 200 );圖4是各組荷瘤標(biāo)本Bax免疫組化染色結(jié)果(免疫組化X 400)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明。
下述實(shí)施例中所用材料包括SPF級(jí)SCID裸鼠，5飛周齡，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所；R/MINI_1640粉劑(美國(guó)Hyclone公司)、新生牛血清(HycloneLaboratories Inc),淋巴細(xì)胞分離液(Sig_ma)、重組人巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF )、重組人白細(xì)胞介素(rh IL ) -4、重組人腫瘤壞死因子(rhTNF ) - a、rh IL-2、(Bioscience公司)、抗人⑶3單抗(北京思科達(dá)生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒、一步法 RT-PCR 試劑盒(QIAGEN 公司)，MDRl 引物上游 5’ -CCCATCAITGCAATAGCAGG-3’，下游 5’-TGITCAAACTTCTGCTCCTGA-3’，總長(zhǎng) 158bp ; P-actin 內(nèi)參引物上游5’ -GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3’，下游 5’ -GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3 ’，總長(zhǎng) 12 Ibp ;瓊脂糖凝膠(上海生工公司)，TUNEL試劑盒(羅氏公司)，抗人BAX單抗(北京中杉)，抗人BCL-2單抗、免疫組化二抗試劑盒(基因科技公司)。實(shí)施例I( I)靶細(xì)胞及細(xì)胞凍融抗原的制備 MCF-7/ADR細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，制成濃度為I X 107/mL的細(xì)胞懸液，加入100 u L生理鹽水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)3次，微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，4°C保存?zhèn)溆茫?2) DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)收集健康人外周血細(xì)胞，通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液體分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)2h后，收集黏附細(xì)胞，加培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為I X 106/mL,接種于24孔培養(yǎng)板(ImL/孔)，加入終濃度為1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)，48h進(jìn)行半量換液并加入首次濃度1/2量的上述細(xì)胞因子，在培養(yǎng)到第5天時(shí)，部分DC和上述凍融抗原按原細(xì)胞數(shù)I : 5進(jìn)行凍融抗原沖擊，與未沖擊的DC共同于第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續(xù)培養(yǎng)至第8天。(3)CIK細(xì)胞的分離及培養(yǎng)收集單個(gè)核細(xì)胞中的非黏附細(xì)胞，并用R/MINI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為3X 106/mL，接種于24孔平底培養(yǎng)板(ImL/孔)，當(dāng)天加入1000U/mL的rhINF- y，刺激24h后，加入抗CD3單抗50 u g/L及300U/mL的rhIL-2,以后每3d以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養(yǎng)液全量換液；培養(yǎng)到第7天，將CIK細(xì)胞分為3組繼續(xù)培養(yǎng)，分別是抗原沖擊的DC與CIK共培養(yǎng)組(AP-DC+CIK組)、DC與CIK共培養(yǎng)組(DC+CIK組)和CIK單獨(dú)培養(yǎng)組(CIK組)，其中DC與CIK細(xì)胞按照體積比I : 10的比例進(jìn)行共培養(yǎng)15天。實(shí)施例2I、建立荷瘤裸鼠模型收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，制成濃度為IXlOVmL的細(xì)胞懸液，按每只裸鼠接種ImL細(xì)胞懸液，在每只裸鼠右側(cè)腋下進(jìn)行接種，腫瘤體積生長(zhǎng)到直徑為0. 5cm為成瘤。2、分組第一組抗原沖擊的DC與CIK共培養(yǎng)組(AP-DC+CIK組)；第二組DC與CIK共培養(yǎng)組(DC+CIK組)；
第三組CIK單獨(dú)培養(yǎng)組(CIK組)；第四組生理鹽水(空白組)。3、實(shí)驗(yàn)裸鼠模型治療分組以接種MCF-7/ADR的SCID裸鼠腫瘤體積生長(zhǎng)到直徑為0. 5cm為成瘤，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分到4組中，分別注射AP-DC+CIK、DC+CIK、CIK和生理鹽水，從注射開(kāi)始每7天測(cè)量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b) I次，腫瘤體積=0. 5 XaXb2，觀察腫瘤生長(zhǎng)的情況；注射治療35天后 ，處死荷瘤裸鼠，取出瘤體，部分瘤體標(biāo)本中性甲醛液固定、石蠟包埋，留作免疫組化用，其余標(biāo)本稱(chēng)質(zhì)量，留做逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。( I ) RT-PCR測(cè)定MDRl基因表達(dá)情況標(biāo)本稱(chēng)質(zhì)量后，按不同治療組順序，取同質(zhì)量瘤體，研碎，并按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA，提取物定量檢測(cè)。然后按照一步法RT-PCR試劑盒步驟，配加25 u L反應(yīng)體系，包括總RNA 0. 5 u g, 5 X Buffer 5 u L, dNTPMix I u L,上下游引物各I u L, Enzyme Mix I u L, Rnase-free水補(bǔ)齊至25 u L。反應(yīng)條件為5(TC 30min, 95°C 15min, 94°C 45s,58°C 45s,72°C Imin 35 個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C。將PCR產(chǎn)物置I. 5%瓊脂糖中電泳，溴化乙錠染色，每次上樣量均為6 ii L，包括Marker，目的基因MDRl及內(nèi)參照P-actin，置紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照片。(II) TUNEL試劑盒檢測(cè)凋亡(I)石蠟包埋的切片的預(yù)處理常規(guī)脫蠟脫水，用蛋白酶K工作液(20mg/L溶于IOmmoI/L Tris/HCl 中，pH 7. 4 8. 0)室溫孵育 15 30min，PBS 洗 2 次；(2)標(biāo)記PBS沖洗2次，擦干樣品周?chē)乃渭?0 ii L的TUNEL反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37°C孵育60min (為防止蒸發(fā)和保證TUNEL反應(yīng)混合物均勻分布，可以在孵育過(guò)程中加蓋蓋玻片)，PBS沖洗3次，至此樣品可在熒光鏡下分析結(jié)果；(3)信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析擦干樣品周?chē)乃郑尤?0 ii L轉(zhuǎn)化劑-P0D，在濕盒中37°C孵育30min，為防止蒸發(fā)和保證轉(zhuǎn)化劑-POD均勻分布，可以在孵育過(guò)程中加蓋蓋玻片；PBS沖洗3次，加入5(Tl00 u L DAB底物溶液，室溫孵育lOmin，PBS沖洗3次；復(fù)染、封片，在光鏡下分析結(jié)果；同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組；光鏡下觀察結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)的胞核為棕黃色或棕褐色均勻或顆粒狀染色。觀察凋亡細(xì)胞的數(shù)量和分布，以20 X 10倍顯微鏡計(jì)數(shù)一個(gè)視野內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍(X400)視野，求出平均每個(gè)高倍視野內(nèi)凋亡細(xì)胞的凋亡指數(shù)(apoptotic index，Al)，Al=凋亡細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)；以凋亡指數(shù)計(jì)，〈O. I為陰性(_) ；0. I 0. 2為弱陽(yáng)性(+ ) ；0. 2 0. 3為中等陽(yáng)性(++) ；>0. 3為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。(III)免疫組化檢測(cè)Bcl-2和Bax表達(dá)(I)石蠟切片脫蠟、水化室溫放置60min，后置于二甲苯浸泡20min，無(wú)水乙醇、95%乙醇、70%乙醇序貫脫水，各5min，后PBS沖洗3次；
(2)抗原修復(fù)用3%H202室溫封閉lOmin，后將切片放入92°C 98°C的0. 01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液2次，后PBS沖洗3次；(3)血清封閉用與二抗同種屬動(dòng)物血清封閉30min后取出；
(4)抗原抗體反應(yīng)、染色按照免疫組化試劑盒步驟，先后加入一抗，4°C過(guò)夜，PBS沖洗3次，加二抗，室溫20min，PBS沖洗3次，加DBA顯色液，室溫5min，PBS沖洗3次。(5)蘇木素復(fù)染、酸乙醇分化、氨水反藍(lán)、沖洗切片、脫水、透明、封片，光鏡下分析結(jié)果，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10. 0軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x土s)表示，多組間均數(shù)比較進(jìn)行方差分析，組間多重比較用Tamhane法，P〈0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
5、結(jié)果(I) RT-PCR檢測(cè)MDRl基因表達(dá)各組均有MDRl基因表達(dá)，MDRl表達(dá)由I 4逐漸增強(qiáng)；4組P-actin表達(dá)無(wú)明顯區(qū)別，見(jiàn)圖I。I 4組MDRl/0-actin比值分別為0. 14、0. 57、0. 81 及 0. 98。(2) TUNEL凋亡評(píng)價(jià)生理鹽水組、CIK組、DC+CIK組和AP-DC+CIK組平均凋亡指數(shù)分別為 0. 088±0. 008,0. 297±0. 049,0. 390±0. 035 及 0. 565±0. 065，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=96. 931，P〈0. 001)。凋亡細(xì)胞胞核為棕黃色或棕褐色均勻或顆粒狀染色，見(jiàn)圖2。(3) Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)Bcl_2蛋白定位于細(xì)胞膜或胞衆(zhòng),Bax蛋白定位于細(xì)胞漿，陽(yáng)性細(xì)胞為包漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者，OD值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 01)，見(jiàn)表1，圖3、4。Bcl-2/Bax AP-DC+CIK 組為 0. 10，DC+CIK 組為 0. 46，CIK 組為 I. 44，生理鹽水組為 6. 16。·表I各組Bcl-2和Bax積分光密度值比較(n=10，OD值，f 士s)
組別Bcl-2Bax
生理鹽水組(I)_52.54±1.57_8.53±0.30_
CIK 組(2)_37.48 ±1.07_26.05 土 0.89_
DC+CIK 組(3)_22.45±0.45_48.66±1.89_
AP-DC+CIK 組(4) 6.25 土0.22_62.62±1.46_
_F_4052.21 林_3469.39**_**P<0. 01 ;各指標(biāo)間兩兩比較均P〈0. 001綜上，CIK細(xì)胞是來(lái)源于T淋巴細(xì)胞的具有免疫活性的異質(zhì)細(xì)胞群，具有較強(qiáng)的抗腫瘤毒性，可以殺傷對(duì)化療耐藥的腫瘤細(xì)胞，是治療多藥耐藥腫瘤的最具潛力的方法；DC細(xì)胞是最具潛力的抗原提呈細(xì)胞，可以識(shí)別、加工、提呈抗原給T細(xì)胞，是激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體。通過(guò)上述實(shí)施例的結(jié)果顯示，AP-DC+CIK組、DC+CIK組、CIK組和生理鹽水組均有MDRl基因表達(dá)，表達(dá)量無(wú)明顯差別，AP-DC+CIK組MDRl/^-actin最低，生理鹽水組最高，提示荷瘤裸鼠模型成瘤后，各自經(jīng)過(guò)CIK、DC+CIK和AP-DC+CIK治療后，MDRl基因表達(dá)均不同程度減少。在AP-DC+CIK治療后，MDRl基因減少最為明顯，其次為DC+CIK治療組，單獨(dú)CIK治療組減少的效果最弱，此現(xiàn)象亦表明負(fù)載乳腺癌抗原的DC激發(fā)出的CIK，其殺傷能力得到提高的同時(shí)，其逆轉(zhuǎn)MDRl基因表達(dá)的能力亦增強(qiáng)，提示耐藥腫瘤細(xì)胞在AP-DC+CIK組被殺傷程度強(qiáng)于DC+CIK組和CIK組，與腫瘤細(xì)胞在不同組別其MDRl基因逆轉(zhuǎn)程度不同有關(guān)，逆轉(zhuǎn)程度強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞被CIK殺傷程度大，逆轉(zhuǎn)程度差的腫瘤細(xì)胞被殺傷程度減低。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)體外細(xì)胞凋亡得出，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)治療組對(duì)荷瘤小鼠均具有促進(jìn)凋亡的治療作用，其中CIK組、DC+CIK組及AP-DC+CIK組對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡能力逐漸增強(qiáng)。Bcl-2基因是7 (14，18)染色體易位斷點(diǎn)處的一種原癌基因，其轉(zhuǎn)位造成Bcl-2蛋白水平增高。Bcl-2蛋白主要表達(dá)在線粒體的外膜、細(xì)胞核膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。Bcl-2基因是線粒體膜滲透性改變的內(nèi)源性抑制物，并可阻止線粒體內(nèi)Ca2+與細(xì)胞色素C向外釋放，具有抑制凋亡的作用。Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)的抗凋亡作用最強(qiáng)的基因之一。Bax也是Bcl-2基因家族重要成員之一，屬于抑癌基因，一般出現(xiàn)在胞質(zhì)中，機(jī)體出現(xiàn)損傷和刺激時(shí)重新定位于線粒體表面并破壞Bcl-2蛋白在正常狀態(tài)下的抗凋亡功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。它表達(dá)于許多腫瘤組織中，如乳腺癌、肺癌、大腸癌、白血病等。上述CIK組、DC+CIK組及AP-DC+CIK組均能抑制Bcl_2的表達(dá)，增加Bax的表達(dá)。其中各組間Bcl-2及Bax比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中在AP-DC+CIK組Bcl-2/Bax比值最低，表明其凋亡活性最強(qiáng)；生理鹽水組Bcl-2/Bax比值最高，表明其凋亡活性最低。因此，由于其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程度不同，腫瘤抗原負(fù)載的DC激活的CIK產(chǎn)生的殺傷作用要強(qiáng)于單純DC激活的CIK和單獨(dú)CIK。 上述參照實(shí)施例對(duì)該一種用于治療乳腺癌的藥物及其制備方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說(shuō)明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于治療乳腺癌的藥物，其特征在于為抗原沖擊的DC與CIK的共培養(yǎng)物，其中， 所述抗原為凍融抗原，是由下述方法得到的收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，制成濃度為I X 107/mL的細(xì)胞懸液，加入100 μ L生理鹽水中，放入液氣中，5min后,迅速放入37 C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氣中，反復(fù)3次，微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，4°C保存?zhèn)溆茫? 所述抗原沖擊的DC是由下述方法得到的收集健康人外周血細(xì)胞，通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液體分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)2h后，收集黏附細(xì)胞，加培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為I X IOVmL,接種于24孔培養(yǎng)板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM_CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)，48h進(jìn)行半量換液并加入首次濃度1/2量的上述細(xì)胞因子，在培養(yǎng)到第5天時(shí)，部分DC和上述凍融抗原按原細(xì)胞數(shù)I : 5進(jìn)行凍融抗原沖擊，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續(xù)培養(yǎng)至第8天； 所述CIK是由下述方法得到的收集單個(gè)核細(xì)胞中的非黏附細(xì)胞，并用R/MINI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為3 X 106/mL,接種于24孔平底培養(yǎng)板，當(dāng)天加入1000U/mL的rhINF- Y，刺激24h后，加入抗CD3單抗50 μ g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養(yǎng)液全量換液，培養(yǎng)到第7天。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于治療乳腺癌的藥物，其特征在于所述DC與CIK細(xì)胞的體積比為I : 10。
3.權(quán)利要求I或2所述的用于治療乳腺癌的藥物的制備方法，其特征在于將抗原沖擊的DC與CIK進(jìn)行共培養(yǎng)，具體步驟為 Cl)制備抗原收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，1800r/min離心，制成濃度為I X IOVmL的細(xì)胞懸液，加入100 μ L生理鹽水中，放入液氮中，5min后，迅速放入37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)3次，微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，4°C保存?zhèn)溆茫玫絻鋈诳乖? (2)制備抗原沖擊的DC:收集健康人外周血細(xì)胞，通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液體分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，置于含10%新生牛血清的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)a后，收集黏附細(xì)胞，加培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為IX 106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，加入終濃度為1000U/mL的rhGM-CSF、500U/mL的rhIL_4，在37°C飽和濕度、5%C02孵箱中培養(yǎng)，48h進(jìn)行半量換液并加入首次濃度1/2量的上述細(xì)胞因子，在培養(yǎng)到第5天時(shí)，部分DC和上述凍融抗原按原細(xì)胞數(shù)I : 5進(jìn)行凍融抗原沖擊，于第7天加入TNF- a 1000U/mL,繼續(xù)培養(yǎng)至第8天； (3)所述CIK是由下述方法得到的收集單個(gè)核細(xì)胞中的非黏附細(xì)胞，并用R/MINI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞數(shù)為3 X 107mL，接種于24孔平底培養(yǎng)板，當(dāng)天加入1000U/mL的rhINF- Y，刺激24h后，加入抗CD3單抗50 μ g/L及300U/mL的rhIL_2，以后每3天以含有300U/mL的rhIL-2的新鮮CIK培養(yǎng)液全量換液，培養(yǎng)到第7天； (4)將上述CIK細(xì)胞與上述抗原沖擊的DC繼續(xù)共培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于治療乳腺癌的藥物的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中DC與CIK細(xì)胞按照體積比I : 10的比例共培養(yǎng)15天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療乳腺癌的藥物及其制備方法，所述藥物為抗原沖擊的DC與CIK的共培養(yǎng)物，通過(guò)將抗原沖擊的DC與CIK進(jìn)行共培養(yǎng)獲得；所述用于治療乳腺癌的藥物，其中CIK細(xì)胞是來(lái)源于T淋巴細(xì)胞的具有免疫活性的異質(zhì)細(xì)胞群，具有較強(qiáng)的抗腫瘤毒性，可以殺傷對(duì)化療耐藥的腫瘤細(xì)胞，是治療多藥耐藥腫瘤的最具潛力的方法，DC細(xì)胞是最具潛力的抗原提呈細(xì)胞，可以識(shí)別、加工、提呈抗原給T細(xì)胞，是激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體，AP-DC+CIK的組合方式對(duì)于抑制腫瘤的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的效果突出；所述制備方法簡(jiǎn)單，適合規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)的需要。
文檔編號(hào)A61K35/14GK102949414SQ201210341248
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者龐華, 司玉玲, 孫雯雯 申請(qǐng)人:龐華, 司玉玲, 孫雯雯