專利名稱：京尼平苷的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥成分的應用，具體地，涉及京尼平苷在制備治療預防電離輻射引起的放射性肺損傷藥物中的應用。
背景技術：
隨著國民經濟及科學技術的迅速騰飛、人民生活水平的急劇提高，航空航天事業的飛速發展，核能和核技術等在醫療衛生、科學研究、工農業生產和國防中的大量應用，輻射與人們的工作和日常生活越來越密切，受輻射的人員也越來越多，損害也越來越嚴重，潛在的巨大危險不容忽視[叢悅，饒亞嵐，陳肖華等。輻射誘導對小鼠巨噬細胞鈣結合蛋白S100A8表達及調控影響的初步研究。解放軍醫學雜志，2009年第34期]。輻射對機體的損傷其本質是對細胞的滅活作用，當被滅活的細胞達到一定數量時，軀體細胞的損傷會導致人體器官組織發生疾病，最終可能導致人體死亡。軀體細胞一旦死亡，損傷細胞也隨之消失 了，不會轉移到下一代。在電離輻射或其他外界因素的影響下，可導致遺傳基因發生突變，當生殖細胞中的DNA受到損傷時，后代繼承母體改變了的基因，導致有缺陷的后代。胸部惡性腫瘤如肺癌、食管癌、乳腺癌等是我國最常見的惡性腫瘤，發病率呈逐年上升的趨勢，是我國居民最主要的死亡原因之一。作為腫瘤治療的基本手段之一，放射治療應用歷史已逾百年，其目的在于對確定的腫瘤給予精確的電離輻射以達到殺傷腫瘤作用，同時使周圍的正常組織受到最小的損傷，以最小的代價取得最佳的治療效果，提高患者的生活質量和生存期[王淑蓮，劉躍平，孫倩.放射腫瘤學治療策略與實施，天津天津科技翻譯出版公司，2001年第I期]。近年來，由于超高壓治療機的使用，輔助工具的改進和經驗的積累，治療效果得到顯著提高，其局部控制率和生存率都顯著提高，目前已成為癌癥治療中最重要的手段之一。據統計，我國約有70%以上的癌癥需用放射治療，美國統計也有50%以上的癌癥需用放射治療。然而，放射線在放療殺傷腫瘤細胞的同時也會無選擇性的損傷正常組織細胞，引起一系列全身和局部的副反應，而且放化療后，腫瘤患者的免疫力低下，腫瘤細胞很容易卷土重來，導致癌細胞轉移和擴散。因此，我們需采取相應的措施來防治及減少一些放療后副作用對機體的損傷，做好腫瘤放療護理。人類的活動空間正不斷擴大，已經走向太空，建立月球基地和飛往火星已被列入21世紀的航天計劃，而宇航員會受到地球帶電粒子、太陽宇宙射線等各種電離輻射的照射，造成不同程度的損傷。即使是處于低地軌道上，各種輻射對健康造成損傷的機會也要比地球表面大50倍。而在更遠的太空里，充滿了宇宙射線，由于失去了天然的防護，輻射對人的影響會更嚴重。總體而言，太空面臨的輻射危險有兩種。一種是長期、低劑量的銀河系宇宙射線，主要是質子和重離子對人體的損傷；另一種是有可能遇到偶發的、高劑量的太陽高能粒子輻射。這兩種輻射可能引起組織的物理損傷如引起皮膚、腸、骨髓、肺及其他組織的急性損傷，引起白內障和殺死人體細胞，降低人的免疫能力，增加癌癥的發病率和基因的破壞。如果不加防護裝置，在太陽的輻射下，航天員所受的輻射劑量可高達幾百拉德。美國航宇局已經認識到累積的輻射劑量“將有可能成為人類太空探險中的最大限制因素?！睘榱朔乐箍臻g輻射對航天員健康的影響，在以往的飛行中以物理防護為主，普遍采用的方法是增加艙壁的厚度。艙壁厚度增加，可以降低艙內的輻射劑量。此外，還有選擇合適的發射時間，進行飛行輻射危險性分析，及時檢測輻射環境的輻射劑量等。實驗證明一些藥物具有減輕輻射損傷的作用。在航天飛行中配備這些藥物，在輻射劑量超限時服用，可以阻止或減輕由于暴露于質子及重離子而產生的生物效應，包括由這些類型電離輻射引起的癌癥、免疫抑制和神經系統疾病等的誘導效應[雷筱芬，陳木森.黃酮類化合物抗輻射研究進展。江西農業大學學報，2007年第29期]。由于受到飛船載荷的限制及宇航員出艙工作時，單靠屏蔽等物理防護很難實現，所以應采用物理、藥物等綜合措施，來提高機體對輻射的抵抗能力，這是對抗輻射影響的一種積極有效的方法。核輻射，或通常稱之為放射性，存在于所有的物質之中，這是億萬年來存在的客觀事實，是正常現象。核輻射是原子核從一種結構或一種能量狀態轉變為另一種結構或另一種能量狀態過程中所釋放出來的微觀粒子流。核輻射可以使物質引起電離或激發，故稱為電離輻射。核輻射在我們生活的地球上無處不在。除來自宇宙的各種放射性射線外，在空氣中(氡)、地球表面(巖石和土壤)、建筑物、地板和墻壁、食物和水，以及我們身體的各 種組織器官內都存在放射性物質。自然界中存在的這些放射性物質的輻射，包括宇宙射線的福射，統稱為天然福射，也稱本底福射[Uniter Nations Scientific Committee onthe Effects of Atomic Radiation. Sources and Effects of Ionizi ng Radiation.UNSCEAR,2000, Report to the General Assembly, United Nations, New York, 2001]。自有地球以來，天然輻射就一直存在，人類正是在這種核輻射環境中生存、進步和發展。放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤放射治療最主要的并發癥，是影響腫瘤治愈患者生活質量的主要原因之一，是胸部腫瘤放射治療的主要劑量限制因素，也是航空航天事業和核工業發展的主要并發癥之一。文獻資料顯示，5%-20%的肺癌患者放療后出現放射性肺損傷，而在胸部淋巴瘤或食管癌的患者放療后放射性肺損傷的催患率為10%-30%。盡管國內外學者對放射性肺損傷的研究已有一百余年的歷史，對其病變發生規律進行了多角度多層次的研究，然而對其發病機理尚未完全闡明，到目前為止，主要分為三種假說①小血管及肺II型細胞損傷學說；②自由基學說；③細胞因子學說。但是，任何一種學說都不能解釋放射性肺損傷的整個病理生理過程〔Yang KY, Liu Li, Zhang Tao, et al. Inereasedexpressions of MMP-2 and MMP-9 in lung following 12Gy local irradiation. Chin JRadiol Med Prot, 2006 ； Yang K, Liu L, Zhang T, et al. TGF-betal transgenic mousemodel of thoracic irradiation: Modulation of MMP-2 and MMP-9 in the lung tissue.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2006〕。然而幸運的是,放射性肺損傷的病理學特征卻有比較一致的結論放射性肺損傷的發生過程中，肺泡基底膜的損傷導致炎癥因子和細胞在肺泡腔內及肺間質聚集，肺泡上皮細胞脫落、表面活性物質的丟失及膠原的沉積最終導致了肺泡塌陷及肺間質纖維化。顯然，在這一演變過程中，以IV型膠原為主要成分的肺泡基底膜損傷對于肺間質纖維化的形成是十分必要的，是放射性肺泡炎和肺間質纖維化病理變化的關鍵事件。而包括肺泡基底膜在內的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的代謝失衡在放射性肺損傷的發生過程中可能發揮了關鍵作用，這是通過調節ECM合成與分解代謝實現的。綜上所述，研究電離輻射引起的放射性肺損傷的發生發展機制，并以此為基礎尋找預防或治療放射性肺損傷的途徑，是目前國內外腫瘤放射治療學者熱切期待解決的問題〔RubinP, JohnstonCJ, WilliamsJP, et al. A Perpetual caseade of cytokinespostirradiation leads to Pulmonary fibrosis.Int J Radiat oncol Biol Phys. 1995 ；ShapiroDL, FinkelsteinJN, RubinP, et al. Radiation indueed secretion ofsurfactant from cell cultures of type II Pneumocytes: an invitro model ofradiation toxicity. Int J Radiat oncol Biol Phys. 1984]。面對這種現象，各種化學藥物和生物制劑應運而生，天然藥物制劑也在預防和治療輻射副反應中發揮了積極的作用，研究發現許多天然藥物及其代謝產物具有明顯的輻射防護作用[潘自強。輻射防護的現狀與未來.北京原子能出版社，1997年][趙斌，張軍帥，劉培勛。輻射防護劑研究現狀及其進展，核化學與放射化學。2012年第I期]。京尼平苷(geniposide),別名桅子苷,輕異桅子苷,桅子糖苷,異桅子苷等，白色結晶，分子式C17H24Oltl,分子量388. 37,是一種從杜仲科植物杜仲(Mucommia uImoides0/iMr )葉中提取的環烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是桅子的主要藥效成分，含量隨產地的不同在3%-8%左右，廣泛存在于植物組織細胞中，如杜仲科杜仲屬植物杜仲的皮、葉和雄花，茜草科植物龍船花葉和小枝，桅子的果實，傘房花耳草等[楊軼舜，張彤，于篩成。京尼平 的研究進展及其藥理價值。中成藥，2011年第I期]，目前，京尼平苷的提取方法一般采用氯仿、無水乙醇等有機溶劑在索氏提取瓶中提取，得到桅子中總的活性成分桅子總苷，然后再上硅膠柱分離，用一定比例的甲醇、氯仿混合液洗脫，洗脫液在丙酮中進行重結晶得京尼平苷晶體，一般IOOg桅子果中可分離得到4. Og左右的京尼平苷[朱冬春，黃趙剛，夏泉等。桅子中京尼平苷提取方法考察。時珍國醫國藥，2009年第7期]。京尼平苷結構如下
HO。
HO V ,°
i 々ο
.. W HO\ b^.CH
京尼平苷具有緩瀉、鎮痛、利膽、抗炎、治療軟組織損傷以及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用[倪慧艷，朝暉，傅海珍.桅子的研究與開發概述.中國中藥雜志，2006年第31期]，不同條件的發酵，可以制成天然食用著色劑桅子藍和桅子紅，也是用于治療心腦血管、肝膽等疾病及糖尿病的原料藥物。現代研究表明，京尼平苷及其代謝產物對消化系統、心血管系統和中樞神經系統疾病均有顯著療效[張陸勇，秀慧芳。桅子西紅花總甙對神經、心血管及呼吸系統的影響。中國藥科大學學報。2000年第31期]，此外，京尼平苷及其代謝產物還有一定的抗炎和治療軟組織損傷的作用[譚玉林，鮑同柱，柳琴等。京尼平苷對大鼠軟骨細胞增殖的影響。中國組織工程研究與臨床康復，2011年第41期]。京尼平苷除了藥用以夕卜，在其它領域也得到廣泛的應用，如可用作植物增產劑、生物檢測劑等。京尼平苷及其代謝產物具有很強的藥理活性，近十幾年來，國內外學者在京尼平苷的有效成份、提取物分析、藥理及應用方面做了大量的研究，取得了可喜的成績，但有關京尼平苷及其代謝產物對胸部腫瘤放射治療、航空航天和核輻射等電離輻射引起的放射性肺損傷影響的相關研究至今未見報道。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供了一種京尼平苷的新應用京尼平苷在制備治療預防電離輻射引起的放射性肺損傷藥物中的應用。京尼平苷作為制備治療預防航空航天，核輻射和胸部腫瘤放射治療時電離輻射引起的放射性肺損傷，增強機體免疫力從而減輕輻射損傷的藥物，可為航空航天事業，核科技發展和胸部腫瘤放射治療引起的放射性肺損傷提供一種可供選擇的輻射防護思路。為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案
京尼平苷在制備治療預防電離輻射引起的放射性肺損傷藥物中的應用。具體地，所述電離輻射為X射線照射。具體地，所述電離輻射為重離子照射。具體地，所述電離輻射為Y射線照射。具體地，所述治療預防電離輻射引起的放射性肺損傷藥物的劑型為片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、溶液、糖漿、注射劑、霜劑、軟膏、凝膠劑、噴霧劑、口嚼劑或貼劑。本發明所述的京尼平苷是從中藥杜仲葉中提取分離獲得，可采用任何已公開文獻或專利方法提取制備。本發明具有以下有益效果
本發明的有益效果是本發明所述的京尼平苷采用任何適合的方式應用于航空航天，核輻射和放射治療聯合應用于患者，都可以減輕因電離輻射所致的放射性肺損傷癥狀，如組織水腫、炎癥、疼痛、造血功能異常(如白細胞降低)、腺體功能障礙、致癌等等多種典型不良反應癥狀；并可明顯緩解航空航天，核輻射和腫瘤放射治療時引起的放射性肺損傷，增強機體免疫力，從而減輕輻射損傷的藥物，為航空航天事業，核科技發展和胸部腫瘤放射治療提供一種可供選擇的輻射防護思路。


附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中
圖I是京尼平苷對X射線照射所致小鼠放射性肺損傷的組織病理學變化 在圖I中，A:正常肺組織B:京尼平苷100 mg/kg C:單純放療組D:京尼平苷100mg/kg+ 放療；
圖2是京尼平苷對12C6+束照射所致小鼠放射性肺損傷的組織病理學變化 在圖2中，A:正常肺組織B:京尼平苷100 mg/kg C:單純放療組D:京尼平苷100mg/kg+ 放療；
圖3是京尼平苷對X射線照射所致小鼠正常肺組織損傷的病理學變化 在圖3中，A:正常肺組織B:京尼平苷100 mg/kg C:單純放療組D:京尼平苷100·mg/kg+放療。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例I :京尼平苷對X射線照射治療惡性腫瘤時引起的放射性肺損傷、機體免疫力下降的緩解作用。I. I實驗材料
京尼平苷，購自上海源葉生物科技有限公司，純度> 98%(HPLC法測定)。Lewis肺癌細胞株，購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)，接種于C57BL/6小鼠右腋部皮下傳代保存。I. 2實驗方法
于超凈工作臺上，取荷瘤傳代鼠脫頸椎處死，固定于板上。用碘酊及酒精消毒動物皮膚，切開皮膚，選擇腫瘤生長良好、無壞死或液化的瘤組織，加入無菌生理鹽水，用組織勻漿器制成含3000萬/ml左右的細胞懸液，于120只C57BL/6小鼠右后肢腹股溝部位皮下接種上述瘤細胞懸液0.2 ml/只，接種部位皮膚先用碘酊及酒精消毒。接種后10天，選擇已有腫瘤組織生長且瘤組織直徑大于Icm的小鼠，隨機分為9組，每組12只，分別為荷瘤對照組、單純放療組、順鉬組、京尼平苷I mg/kg組、京尼平苷10 mg/kg組、京尼平苷100 mg/kg組、京尼平苷I mg/kg+放療組、京尼平苷10 mg/kg+放療組、京尼平苷100 mg/kg+放療組。分組后放療各組小鼠每日以深部X射線治療機全身照射(Philips公司，德國)，照射劑量2Gy，照射后京尼平苷各組小鼠灌胃給予相應劑量京尼平苷，其余各組灌胃給予等體積蒸餾水。每天一次，連續5天。末次照射后24小時，脫頸椎處死小鼠，斷開氣管獲取全肺，取部分左肺中部組織放入4%中性甲醛固定，石蠟包埋，用于HE染色，觀察組織病理學變化，部分右肺用于羥脯氨酸，DNA損傷以及細胞凋亡等生化檢測。羥脯氨酸的測定采用南京建成生物技術公司的堿水解試劑盒，按照產品說明書進行操作。簡而言之，取30-100 mg肺組織，加入I ml水解液在100°C裂解20min，用活性炭吸附有色雜質后，離心，取上清I ml，依次加入試劑I、2、3，充分反應后取上清Iml在550 nm處，Icm光徑，蒸餾水調零，比色，測各管吸光度。羥脯氨酸含量(yg/mg)=(測定管吸光度一空白管吸光度)/(標準管吸光度一空白管吸光度)X標準管含量X水解液總體積/組織質量；剩余部分冰凍保存，用于細胞因子TNF-a，TGF-β的ELISA檢查，測定采用南京建成生物技術公司的羥脯氨酸測定試劑盒，按照產品說明書進行操作。具體操作步驟如下分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μ 1，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μ1，然后再加待測樣品10μ I (樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37°c溫育30分鐘。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μ 1，空白孔除外。37°C溫育30分鐘，將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干，每孔先加入顯色劑Α50μ 1，再加入顯色劑Β50μ 1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘，每孔加終止液50 μ 1，終止反應(此時藍色立轉黃色)。以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光(OD值)。小鼠肺組織細胞DNA損傷檢測采用堿性單細胞電泳分析法(Single cell microgel electrophoresis (SCGE),或稱comet assay)。這是一種測定單個哺乳動物細胞DNA損傷的快速、簡便和靈敏的方法[McKelvey-Martin VJ, Green MH, Schmezer P,Pool-Zobel BL, De Meo MP, Collins A. The single cell gel electrophoresis assay(comet assay) : a European review. Mutat Res. 1993 ;288 (I) :47-63.]。實驗按Franke等[Franke SI, Pra D, da Silva J, et al. Possible repair action of Vitamin Con DNA damage induced by methyl methanesulfonate, cyclophosphamide, FeS04 andCuS04 in mouse blood cells in vivo. Mutat Res. 2005 ；583(1) :75-84.]方案進行。具體內容如下在砂紙打磨過的或磨砂載玻片上涂一層O. 5%的常熔點瓊脂糖(normalmelting agarose, NMA) ,4° C下使其凝固。小鼠肺組織細胞10 μ I與100 μ I低融點瓊脂糖(LMA，O. 75% in PBS)在37° C混合均勻，滴在載玻片上。加上蓋玻片后于4° C放置一 段時間使其凝固。去掉蓋玻片，再加一層LMA并加蓋玻片，凝固后小心去掉蓋玻片。將包埋了細胞的載玻片小心置入細胞裂解液(內含1%月桂酰肌氨酸鈉、2. 5mol/L NaClUOOmmol/L EDTA-Na2 和 10mmol/L Tris-HCl，pHIO，臨用前加入 10%DMS0 和 l%Triton X-100)中，于4° C下放置約I小時。取出載玻片置于水平電泳槽中，加入電泳緩沖液(內含Immol/L EDTA-Na2和300mmol/L NaOH)，放置20分鐘后，調整緩沖液液面使電壓達25V，電流達300mA,電泳20min。電泳完畢，小心將載玻片浸于中和液(O. 4mol/L Tris-HCl，pH7. 5)，放置5分鐘，再換新的中和液，同樣放置5分鐘，以排除堿對EB (溴化乙錠)染色的干擾。取出后用20μ8/πι1ΕΒ染色，加蓋玻片，并盡快在熒光顯微鏡下進行觀察和拍照。熒光顯微鏡下激發光波長為515-560nm，濾光片波長為590nm。未損傷肺細胞的DNA為圓形，而受到損傷的肺細胞DNA帶有彗星樣尾巴。每只小鼠照片中隨機選用100個細胞，利用CASP軟件對DNA損傷情況進行分析。此軟件分析結果中拖尾細胞的平均尾長和拖尾率作為DNA損傷評價指標[Konca K, Lankoff A, Banasik A, et al. A cross-platform public domain PCimage-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 2003]。細胞平均尾長=Σ每個細胞拖尾長度/測定細胞數
細胞凋亡檢測采用流式細胞分析法。具體方法是將新鮮肺組織用眼科剪盡量剪碎，200目篩過濾。PBS洗滌2次后用75%冷乙醇在4° C冰箱固定24 h以上。離心除去固定液，力口碘化丙唆(Propidiumiodide, PI)染色液 O. 5mL(含 O. 3 mg/mL RNAase, 20 μ g / mL PI),常溫避光染色30min后，FASCan型流式細胞儀(USA)檢測，激發光波長為488nm，每個樣品測定10000個細胞。采用分析軟件FlowJo7. I(CA)計算出凋亡細胞的百分比。以t檢驗進行組間統計學分析。I. 3實驗結果
結果表明(表1)，X射線照射可致小鼠肺組織細胞DNA損傷，細胞凋亡率明顯升高，京尼平苷本身對DNA損傷和細胞凋亡率沒有明顯影響，但1-100 mg/kg的京尼平苷能夠抑制X射線照射所致肺組織細胞DNA損傷和細胞凋亡率的增加，且有明顯的劑量效應關系。此外，研究結果也表明(表2)，X射線照射可致小鼠肺組織中羥脯氨酸含量急劇升高，肺損傷關鍵細胞因子TNF-α和TGF-β含量迅速提高，京尼平苷本身對肺組織沒有損傷和副作用，但1-100 mg/kg的京尼平苷能夠抑制X射線照射所致肺組織中羥脯氨酸含量的提高，并抑制細胞因子TNF-α和TGF-β含量的升高，且有明顯的劑量效應關系；組織病理學結果也顯示(如圖I所示)，X射線照射可小鼠肺組織產生一定程度的損傷，肺泡壁有所增厚，產生大量炎性細胞(C)，京尼平苷本身對肺組織沒有損傷和副作用(B)，但和正常對照組相比，
1-100 mg/kg的京尼平苷能夠明顯減輕X射線照射所致肺組織的損傷程度(D)。表明京尼平苷對X射線照射所致的放射性肺組織電離損傷有明顯的保護作用。
權利要求
1.京尼平苷在制備治療預防電離輻射引起的放射性肺損傷藥物中的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述電離輻射為X射線照射。
3.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述電離輻射為重離子照射。
4.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述電離輻射為Y射線照射。
5.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述治療預防電離輻射引起的放射性肺損傷藥物的劑型為片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、溶液、糖漿、注射劑、霜劑、軟膏、凝膠齊U、噴霧劑、口嚼劑或貼劑。
全文摘要
本發明公開了京尼平苷在制備治療預防電離輻射引起的放射性肺損傷藥物中的應用。京尼平苷作為制備治療預防航空航天，核輻射和胸部腫瘤放射治療時引起的放射性肺損傷，增強機體免疫力從而減輕輻射損傷的藥物，可為航空航天事業，核科技發展和胸部腫瘤放射治療等電離輻射引起的放射性肺損傷提供一種可供選擇的輻射防護思路。
文檔編號A61P11/00GK102908356SQ20121035130
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者武振華, 張紅, 王振華, 王新宇 申請人:中國科學院近代物理研究所