專利名稱：龍膽苦苷藥物制劑及其在防治煙草花葉病毒病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物藥物及應用技術領域，具體涉及一種龍膽苦苷藥物制劑，從西南猜牙菜(Swertia cincta Burk)提取龍膽苦苷的方法、以及藥物制劑在制備防控煙草花葉病毒病及抗病毒制劑中的應用。
背景技術：
煙草花葉病毒(Tb如cco mosaicTMV)是煙草花葉病等的病原體,屬于披甲病毒科煙草花葉病毒屬TMV的寄主廣泛，能侵染30個科的300多種植物，在煙草、番茄等糧經作物上危害嚴重，全世界每年僅由TMV引起的花葉病造成的損失就超過I億美元，給農業生產造成巨大的經濟損失。然而，由于TMV對寄主具有絕對寄生性以及植物沒有像動物那樣完整的免疫代謝系統，因此，植物一旦被病毒感染就終生處于被危害·的狀態。這些因素都給高選擇性的抗植物病毒藥劑的研發帶來了很大的難度。在目前的農業生產中，化學農藥防治煙草花葉病毒病應用最為廣泛，但化學防治效果有限，且易造成農·殘超標，因此迫切需要開發新型抗病毒制劑。植物在進化過程中合成了類型豐富的具有抗微生物活性的次生代謝產物，它們可以選擇性的抵御包括TMV在內的病原物的侵害。由于是植物本身產生的抗病毒物質，植物源病毒抑制劑對寄主本身毒性小或沒有毒性，作用機制獨特且資源豐富。因此，篩選新型植物源抗病毒制劑具有重要意義。病毒對植物產生危害的過程可分為侵染寄主、體內復制和癥狀表達三個部分。因此，對其中任何部分的抑制均可減輕植物病毒病的危害。另外有些抗植物病毒劑雖然對這三個部分沒有作用，但卻能激活寄主產生系統抗性。同時，許多活性物質表現的抗病毒活性可能是其中一種或多種機制共同起作用的結果。本發明人前期研究表明，很多植物源病毒抑制劑是通過激活植物的系統獲得性抗性，從而增強植物對病毒的抵抗力。龍膽科獐牙菜屬植物主要產于云南、貴州、四川等地，是西南少數民族常用的植物藥源。該屬植物共有170個種，我國約有80個種，主要分布在西南地區，僅云南就有38種。該屬藥用植物大多具有清熱利膽、強心、舒肝健胃、解毒等功效，用于治療肝炎、黃疸型肝炎、肝膽等疾病，但尚未有文獻報道該屬植物具有抗植物病毒的作用。

發明內容
本發明的第一目的在于提供一種龍膽苦苷藥物制劑；第二目的在于提供一種提取龍膽苦苷的方法；第三的目的在于提供龍膽苦苷藥物制劑的劑型；第四目的在于提供龍膽苦苷藥物制劑在制備抗煙草花葉病毒病制劑中的應用。本發明的第一目的是這樣實現的，所述的龍膽苦苷藥物制劑含有龍膽苦苷O. f 99%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。本發明的第二目的是這樣實現的，以西南獐牙菜為原料，并按包括下列步驟的工藝提取龍膽苦苷化合物A、取陰干的西南獐牙菜粉碎，用7515%甲醇提取2 3次，每次f3h ；
B、合并提取液，過濾除渣，合并濾液，然后減壓濃縮得相對密度I.2^1. 3的浸膏；
C、浸膏加入f3倍體積的水攪拌至呈懸浮狀，用濃度95 100% 二氯甲烷溶液萃取2 3次，每次15 25min ；
D、合并萃取液，過MCI柱脫色，之后用濃度7(Γ80%的甲醇洗脫，收集洗脫液；
Ε、再用大孔樹脂柱脫糖，并用甲醇 /水(V/VXTlOO : 100、的溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮得含7(Γ80%甲醇的浸膏；
F、上HPLC進行分離，用7(Γ80%甲醇水溶液洗脫，最后用半制備柱進行純化，得到龍膽苦苷化合物。本發明的第三目的是這樣實現的，按配方要求比例將龍膽苦苷化合物與對人和動物無毒可藥用輔料和/或賦形劑混合，配制成水劑、片劑、顆粒劑或微乳劑。本發明的第四目的是這樣實現的，所述的龍膽苦苷藥物制劑在制備防治煙草花葉病毒病制劑中的應用。本發明運用現代分離技術從西南猜牙菜(Swertia cincta Burk)中分離得到一種環烯醚萜類化合物——龍膽苦苷。實驗證明龍膽苦苷具有顯著的抑制TMV侵染的活性，可作為新型抗植物病毒的活性成分，可用于制備防治煙草花葉病毒病的藥物制劑，其抑制效果要優于市售抗煙草花葉病植物藥劑，如寧南霉素等藥物，本發明藥物制劑不僅對人畜無毒、無害，使用安全可靠，對防治煙草花葉病毒病有顯著的效果。


圖I為TAS-ELISA法檢測病毒的含量柱狀圖。圖I中CK-為陰性對照，CK+為陽性對照，大于陽性對照為陽性，小于2倍陰性對照為陰性。寧南霉素為市售藥物對照，龍膽苦苷-I、5、10、15和20分別表示龍膽苦苷的濃度為Iy g/ml、5l·! g/ml、10l·! g/ml、15l·! g/ml和 20 μ g/ml。圖2為本發明的應用效果對比照片。其中左圖為本發明化合物與對照組效果對比；右圖為現有化合物與對照組藥物效果對比。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變更或改進，均屬于本發明的保護范圍。本發明所述的龍膽苦苷藥物制劑為含有龍膽苦苷O. f 99%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。作為優選實施方式
含有龍膽苦苷O. 5 90%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。含有龍膽苦苷f 50%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。含有龍膽苦苷5 20%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。本發明所述的用于制備上述龍膽苦苷藥物制劑的龍膽苦苷，其制備方法為以西南獐牙菜為原料，并按包括下列步驟的工藝提取龍膽苦苷化合物
A、取陰干的西南獐牙菜粉碎，用7515%甲醇提取2 3次，每次f 3h ；B、合并提取液，過濾除渣，合并濾液，然后減壓濃縮得相對密度I.2^1. 3的浸膏；
C、浸膏加入f3倍體積的水攪拌至呈懸浮狀，用濃度95 100% 二氯甲烷溶液萃取2 3次，每次15 25min ；
D、合并萃取液，過MCI柱脫色，之后用濃度7(Γ80%的甲醇洗脫，收集洗脫液；
Ε、再用大孔樹脂柱脫糖，并用甲醇/水(V/VXTlOO : 100、的溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮得含7(Γ80%甲醇的浸膏；
F、上HPLC進行分離，用7(Γ80%甲醇水溶液洗脫，最后用半制備柱進行純化，得到龍膽苦苷化合物。作為優選實施方式
所述的大孔樹脂柱為D900、D130、D101、D201或D301中的任意一種。 所述的半制備柱為艾杰爾半制備柱、HPLC半制備柱或日本唯美希半制備柱中的任意一種。所述的艾杰爾半制備柱進行純化，采用甲醇/水溶液進行洗脫，得到龍膽苦苷化合物。本發明所述的龍膽苦苷藥物制劑的劑型是按配方要求比例將龍膽苦苷化合物與對人和動物無毒可藥用輔料和/或賦形劑混合，配制成水劑、片劑、顆粒劑或微乳劑。所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。采用制藥和食品領域公認的方法制備成各種劑型、如液體制劑(注射劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑等)、固體制劑(片劑、膠囊劑、顆粒劑，沖劑等)、噴劑、氣霧劑等。上述制劑中可含有輔助物質、穩定劑、助濕劑和其他常用的添加劑，如淀粉、蛋白粉、果膠、蔗糖、糊精、硬脂酸鎂、甘露醇、十二烷基苯磺酸鈉等。上述的制劑可按照各種制劑常規的制備工藝制成。所述的龍膽苦苷藥物制劑在制備防治煙草花葉病毒病制劑中的應用，其中龍膽苦苷溶液濃度為llOyg/ml。實施例I
取陰干的西南獐牙菜粉碎，用75%甲醇提取2次，每次Ih ;合并提取液，過濾除渣，合并濾液，然后減壓濃縮得相對密度I. 2^1. 3的浸膏；浸膏加入I倍體積的水攪拌至呈懸浮狀，用濃度98%二氯甲烷溶液萃取2次，每次15min ;合并萃取液，過MCI脫色，之后用濃度75%的甲醇洗脫，收集洗脫液；再用D900大孔樹脂柱脫糖，用甲醇/水(V/V)10 :90的溶液洗脫，收集洗脫液；濃縮得浸膏，上HPLC進行分離，用70%的甲醇水溶液洗脫，最后艾杰爾半制備柱進行純化，用70%的甲醇水溶液洗脫，得到龍膽苦苷化合物。實施例2
取陰干的西南獐牙菜粉碎，用85%甲醇提取2次，每次3h ;合并提取液，過濾除渣，合并濾液，然后減壓濃縮得相對密度I. 2^1. 3的浸膏；浸膏加入3倍體積的水攪拌至呈懸浮狀，用濃度95% 二氯甲烷溶液萃取3次，每次25min ;合并萃取液，過MCI柱脫色，之后用濃度70%的甲醇洗脫，收集洗脫液；再用D130大孔樹脂柱脫糖，用甲醇/水(V/V) 30 70的溶液洗脫，收集洗脫液；濃縮得浸膏，上HPLC進行分離，80%的甲醇水溶液洗脫，最后HPLC半制備柱進行純化，用80%的甲醇水溶液洗脫，得到龍膽苦苷化合物。實施例3
取陰干的西南獐牙菜粉碎，用80%甲醇提取3次，每次2h ;合并提取液，過濾除渣，合并濾液，然后減壓濃縮得相對密度I. 2^1. 3的浸膏；浸膏加入2倍體積的水攪拌至呈懸浮狀，用濃度100% 二氯甲烷溶液萃取3次，每次20min ;合并萃取液，過MCI柱脫色，之后用濃度80%的甲醇洗脫，收集洗脫液；再用DlOl大孔樹脂柱脫糖，用甲醇/水(V/V) 70 30的溶液洗脫，收集洗脫液；濃縮得浸膏，上HPLC柱進行分離，75%的甲醇水溶液洗脫，最后日本唯美希半制備柱進行純化，用75%的甲醇水溶液洗脫，得到龍膽苦苷化合物。實施例4
采用D201大孔樹脂柱脫糖，其余同實施例I。實施例5
采用D301大孔樹脂柱脫糖，其余同實施例2。
實施例6
I μ g/ml的龍膽苦苷水溶液的配制。稱取分離提純的龍膽苦苷化合物2 μ g溶于少量DMSO溶液，充分攪拌混合，待其充分溶解后，加入余量的蒸餾水至終體積2ml，制成水劑，SP得I μ g/ml的龍膽苦苷水溶液。使用時按照所需濃度稀釋即可。實施例7
20 μ g/ml的龍膽苦苷水溶液的配制。稱取分離提純的龍膽苦苷化合物20 μ g溶于少量DMSO溶液，充分攪拌混合，待其充分溶解后，加入余量的蒸餾水至終體積1ml，制成水劑，即得20 μ g/ml的龍膽苦苷水溶液。使用時按照所需濃度稀釋即可。實施例8
100 μ g/ml的龍膽苦苷水溶液的配制。稱取分離提純的龍膽苦苷化合物100 μ g溶于少量DMSO溶液，充分攪拌混合，待其充分溶解后，加入余量的蒸餾水至終體積1ml，制成水劑，即得100 μ g/ml的龍膽苦苷水溶液。使用時按照所需濃度稀釋即可。實施例9
制備Ig龍膽苦苷粉劑，稱取IOmg龍膽苦苷，加入少許DMSO使之充分溶解；然后再加入O. Ig牛血清白蛋白粉，加水充分攪拌混勻，然后加入20%淀粉作為賦形劑，充分混勻，干燥后磨碎制成粉劑。使用時將粉劑稀釋至所需濃度即可。實施例10
制備Ig龍膽苦苷粉劑，稱取O. 95g龍膽苦苷，加入少許DMSO使之充分溶解；然后再加入O. Olg牛血清白蛋白粉，加水充分攪拌混勻，然后加入余量淀粉作為賦形劑，充分混勻，干燥后磨碎制成粉劑。使用時將粉劑稀釋至所需濃度即可。實施例11
制備Ig龍膽苦苷顆粒劑，稱取O. 15g龍膽苦苷，加入少許DMSO使之充分溶解；然后再加入O. 5g牛血清白蛋白粉，加水充分攪拌混勻，然后加入15%淀粉和15%果膠作為賦形劑，充分混勻，制粒并干燥后成為顆粒劑。使用時將顆粒劑稀釋至所需濃度即可。實施例12
制備Ig龍膽苦苷顆粒劑，稱取O. OOlg龍膽苦苷，加入少許DMSO使之充分溶解；然后再加入O. 5 g牛血清白蛋白粉，加水充分攪拌混勻，然后加入20%淀粉和20%果膠作為賦形齊U，充分混勻，制粒并干燥后成為顆粒劑。使用時將顆粒劑稀釋至所需濃度即可。實施例13
制備Ig龍膽苦苷乳劑，稱取O. 99g龍膽苦苷，加入少許DMSO使之充分溶解；然后加入10%十二烷基苯磺酸鈉作為乳化劑，充分混勻成為乳劑。使用時將乳劑稀釋至所需濃度即可。實施例14
制備Ig龍膽苦苷片劑，稱取O. 4g龍膽苦苷，加入少許DMSO使之充分溶解；然后再加入O. Ig小麥蛋白(粉)，加水充分攪拌混勻，然后加入40%淀粉作為賦形劑，充分混勻，干燥后壓制成為片劑。使用時將片劑稀釋至所需濃度即可。實施例15
10 μ g/ml的TMV溶液制備。吸取已經制備的100 μ g/ml的TMV母液Iml,加入余量的磷酸緩沖液至終體積10ml，即得10 μ g/ml的TMV溶液。 實施例16
龍膽苦苷對TMV初侵染的抑制試驗。采用半葉枯斑法對心葉煙人工接種TMV。選取健康且生長良好的心葉煙，在暗室放置一夜。每棵煙苗挑選水平位置相同的3個葉片。將每個葉片的右半部分均勻噴灑10μ g/ml的龍膽苦苷溶液100μ 1，左半部分噴灑100μ I含相同DMSO濃度的蒸餾水，噴灑量以葉面全部浸濕而不下滴為準。2 h后將整個葉片均勻摩擦接種10 μ g/ml的TMV 200 μ I。以8%寧南霉素水劑1000倍液為對照。每個處理3株煙共10片煙葉。5天后分別統計左右葉片的枯斑數目并根據葉片上的枯斑數計算枯斑抑制率。化合物對TMV侵染的抑制率=[(陽性對照枯斑數一化合物處理枯斑數)/陽性對照枯斑數]X 100%。實驗結果表I為化合物龍膽苦苷在10 μ g/ml濃度時與對照藥物寧南霉素在心葉煙上對TMV初侵染的抑制比較。由結果可知，化合物龍膽苦苷對TMV的平均抑制率為52. 5%，而寧南霉素對TMV的抑制率只有35%。因此，龍膽苦苷對TMV初侵染的抑制效果要優于市售藥物“寧南霉素”。表I龍膽苦苷與寧南霉素在心葉煙上對TMV初侵染的抑制率的比較
權利要求
1.一種龍膽苦苷藥物制劑，其特征在于含有龍膽苦苷O. f 99%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。
2.如權利要求I所述的龍膽苦苷藥物制劑，其特征在于含有龍膽苦苷O.5^90%,其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。
3.如權利要求I或2所述的龍膽苦苷藥物制劑，其特征在于含有龍膽苦苷f50%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。
4.如權利要求I或2所述的龍膽苦苷藥物制劑，其特征在于含有龍膽苦苷5 20%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。
5.ー種提取權利要求Γ4任意一項所述的龍膽苦苷的方法，其特征在于以西南獐牙菜為原料，并按包括下列步驟的エ藝提取龍膽苦苷化合物 A、取陰干的西南獐牙菜粉碎，用7515%甲醇提取2 3次，毎次f3h； B、合并提取液，過濾除渣，合并濾液，然后減壓濃縮得相對密度I.2^1. 3的浸膏； C、浸膏加入f3倍體積的水攪拌至呈懸浮狀，用濃度95 100% ニ氯甲烷溶液萃取2 3次，每次15 25min ； D、合并萃取液，過MCI柱脫色，之后用濃度7(Γ80%的甲醇洗脫，收集洗脫液； Ε、再用大孔樹脂柱脫糖，并用甲醇/水(V/VXTlOO : 100、的溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮得含7(Γ80%甲醇的浸膏； F、上HPLC進行分離，用7(Γ80%甲醇水溶液洗脫，最后用半制備柱進行純化，得到龍膽苦苷化合物。
6.如權利要求5所述的提取龍膽苦苷的方法，其特征在于所述的大孔樹脂柱為D900、D130、D101、D201 或 D301 中的任意ー種。
7.如權利要求5所述的提取龍膽苦苷的方法，其特征在于所述的半制備柱為艾杰爾半制備柱、HPLC半制備柱或日本唯美希半制備柱中的任意ー種。
8.—種權利要求Γ4所述的任意一項龍膽苦苷藥物制劑的劑型，其特征在于按配方要求比例將龍膽苦苷化合物與對人和動物無毒可藥用輔料和/或賦形劑混合，配制成水劑、片劑、顆粒劑或微乳劑。
9.一種權利要求1 4所述的任意一項龍膽苦苷藥物制劑在制備防治煙草花葉病毒病制劑中的應用。
10.如權利要求9所述的龍膽苦苷藥物制劑在制備防治煙草花葉病毒病應用中的龍膽苦苷溶液濃度為1 20μ g/ml。
全文摘要
本發明公開了一種龍膽苦苷藥物制劑及其在防治煙草花葉病毒病中的應用。所述的龍膽苦苷藥物制劑含有龍膽苦苷0.1~99%，其余為藥物學上可接受的藥用輔料和/或賦形劑。本發明采用的龍膽苦苷可從西南獐牙菜(SwertiacinctaBurk)中分離制備，方法簡便，提取率高。本發明龍膽苦苷藥物制劑在制備防治煙草花葉病毒病中的應用前景廣泛。本發明運用現代分離技術從西南獐牙菜中分離得到龍膽苦苷。實驗證明龍膽苦苷能顯著抑制TMV侵染的活性，可作為新型抗植物病毒的活性成分用于防治煙草花葉病毒病，其抑制效果優于市售抗煙草花葉病植物藥劑(寧南霉素等)，本發明制劑系純生物制劑，對人畜無害，對防治煙草花葉病毒病有顯著的效果，可用于有機煙葉的生產中。
文檔編號C07H1/08GK102696637SQ20121011556
公開日2012年10月3日 申請日期2012年4月19日 優先權日2012年4月19日
發明者余清, 張仲凱, 張廷金, 李婷婷, 李干鵬, 莫笑晗, 董家紅, 陳永對 申請人:云南民族大學, 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所, 云南省煙草農業科學研究院