一種銀杏葉提取物的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種銀杏葉提取物的制備方法，它公開了一種從天然銀杏葉中提取有效成分的制備方法，包括以下步驟：1)將銀杏葉投于提取罐中，用乙醇水溶液熱回流提取；2)將提取物溶液投入到大孔吸附樹脂柱中，用乙醇水溶液進行分離、純化；3)加入乙醇水溶液回流溶解，常溫過濾，取濾液，除去溶劑干燥得成品；本發明方法條件溫和、操作簡單，周期短，產品易于分離純化，收率、純度高，溶劑可回收利用、生產成本低，提取物中無有毒試劑殘留、環境污染小，適用于銀杏葉提取物工業化生產。
【專利說明】一種銀杏葉提取物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及天然藥物化學領域，尤其涉及一種銀杏葉提取物的制備方法。
【背景技術】
[0002]銀杏(Ginkgo biloba L.)又名公孫樹，白果，是裸子植物銀杏科植物，是當今地球上最古老的樹種之一。銀杏全身都是寶，集果用、葉用、材用、花粉用、防護用和觀賞用于一身。銀杏的藥用價值，我國古代就有記載，《本草綱目》記載，白果可“入肺經、益脾氣、定咳喘、縮小便、性平味甘苦潘，有小毒”，可治哮喘、痰咳、白帶、遺精、淋病、小便頻數等。銀杏是一種藥用價值極高的植物，而銀杏葉中的活性成分的研究備受親睞。
[0003]銀杏葉提取物的主要生物活性成分是總黃酮類和萜類內酯類，總黃酮以山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercitrin)、異鼠李素(Isorhamntin)的苷為主；職類內酯則以銀杏內酯(ginkgolide A.B.C)和白果內酯(bilodalide)為主。銀杏提取物具有強抗氧化性，能有效清除體生物內過剩的自由基，達到延緩衰老的功能；銀杏提取物的萜類化合物具有抗血小板凝集的功能。此外，銀杏葉提取物可擴張冠脈血管，增加腦血流量，拮抗血小板活化因子，可治療由于血管老化、腦血管供血不足所致的多種疾病。[0004]關于銀杏葉提取物的制備方法研究，國內外已經有大量報道。這些提取銀杏葉中活性成分的方法，具有操作繁瑣、成本高、有效成分流失嚴重、提取物收率較低、污染嚴重、不利于工業化生產等缺點。

【發明內容】

[0005]為了克服上述銀杏葉提取物制備方法的缺陷，本發明提供一種方法簡單、操作方便、收率極高、成本低廉、提取物中無有毒試劑殘留、污染小的銀杏提取物制備方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采取以下技術方案，具體操作方法為:
[0007]步驟I)將銀杏葉投于提取罐中，用乙醇水溶液熱回流提取，合并提取液，濃縮得到密度為0.7-1.2g/ml的濃縮物A ；
[0008]步驟2)濃縮物A用水溶解后投入到DM130、AB_8、DMl31或D318大孔吸附樹脂柱中充分吸附，依次用體積分數為O %、10-30 % >40-80 %的乙醇水溶液進行梯度洗脫，收集40-80%乙醇水洗脫液并濃縮得到濃縮物B ;濃縮物B用乙醇水溶液溶解后投入到DlOl、HPD100、LKY134或DM2大孔吸附樹脂柱中充分吸附，用體積分數為40-80%的乙醇水溶液進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至密度為0.7~1.2g/ml，得到濃縮物C ；
[0009]步驟3)濃縮物C中加入乙醇水溶液回流溶解，并常溫過濾除去不溶雜質，將濾液濃縮，干燥后到銀杏葉提取物成品。
[0010]將制備的銀杏葉提取物通過高效液相進行表征鑒定，與2010版中國藥典的表征數據一致；同時采用高效液相色譜法分析銀杏葉提取物成品總銀杏酸、總黃酮醇苷、萜類內酯的含量與收率。
[0011]所述步驟I)中，經過發明人多次預實驗，發現乙醇水體積分數為50-85%時，對銀杏葉中總黃酮類、萜類內酯化合物的提取比較完全。體積分數為50-85%乙醇水溶液的用量以投料的銀杏葉體積的8-15倍體積為宜，低于8倍體積時，提取液濃度過高，使得提取效率明顯降低；高于15倍體積時，很容易將其他雜質成分引入提取液中，增加了后續工作的難度，加之提取液總體積急劇增加，加大了濃縮的工作量。
[0012]所述步驟I)中，用乙醇水溶液熱回流提取銀杏葉的溫度控制在70-90°C為宜，溫度過低會降低提取效率，溫度過高容易破壞銀杏葉中的有效成分。
[0013]所述步驟I)中，用乙醇水溶液熱回流提取銀杏葉的次數優選2-4次，每次1.5-2.5小時，進一步的，優選為提取次數為2次，每次提取2小時。
[0014]所述步驟2)中，經發明人反復篩選，結合銀杏葉提取物有效成分的理化分析，最終選定以DM130、AB-8、DM131或D318大孔吸附樹脂柱對銀杏葉提取濃縮物進行乙醇水溶液梯度洗脫，用D101、HPD100、LKY134或DM2大孔吸附樹脂柱對濃縮物B進行進一步純化，其分離效果好，且溶劑可以回收利用，便于產業化生產。
[0015]所述步驟2)中，發明人對銀杏葉提取濃縮物進行梯度洗脫時，依次用I倍柱體積純水、2倍柱體積的體積分數為10-30%乙醇水溶液進行梯度洗脫，能有效去除濃縮物中的色素及其大極性成分，提高銀杏提取物有效成分的純度；用3倍柱體積的體積分數為40-80%乙醇水溶液梯度洗脫，能有效富集有效成分，提高有效成分的含量。
[0016]所述步驟3)中，結合銀杏葉中總黃酮類及其萜類內酯的理化性質，選用10-30倍體積分數為60-95%的乙醇水溶液對濃縮物C回流溶解，進一步除去雜質，增加總黃酮類及其萜類內酯的純度。
[0017]采用高效液相色譜法對銀杏葉提取物的色譜圖與2010年中國藥典進行表征比較，從而增加了對銀杏提取物各成分指認的準確性。
[0018]通過高效液相色譜法分析總銀杏酸、總黃酮醇苷、萜類內酯等的含量與收率，方法簡單,結果準確可靠。
[0019]高效液相色譜分析條件為:柱長及型號:Sapphire C18 4.6 X 250mm, 5 μ m,柱溫:30°C，流速:lml/min。總銀杏酸:流動相:A相:甲醇，B相:I %冰醋酸水溶液，A相:B相=90: 10，檢測波長:310nm ;總黃酮醇苷:流動相:A相:甲醇，B相:0.4%磷酸水溶液，A相:B相=50: 50，檢測波長:360nm ;萜類內酯:A相:正丙醇:四氫呋喃=I: 15，B相:水，A相:B相=16: 84，檢測器:蒸發光散射檢測器。
[0020]制備的銀杏葉提取物通過高效液相進行表征鑒定，與2010版中國藥典的表征數據一致。通過高效液相色譜法分析總銀杏酸、總黃酮醇苷、萜類內酯的含量與收率。其中，總銀杏酸< 2ppm，總黃酮醇苷含量為24.0% -27.5%，總萜類內酯≥6.0%，其中銀杏內酯A≥2.2%，銀杏內酯B≥1.2%，銀杏內酯C≥1.3%，收率≥2%。
[0021]本發明以天然植物銀杏葉為起始原料，用乙醇水溶液提取，大孔樹脂吸附，乙醇水溶液洗脫，乙醇溶液精制，可得到高收率、高質量的銀杏葉提取物。本發明方法與已報道文獻方法相比有如下優點:
[0022]1.以乙醇水溶液為提取溶劑，成本低，提取物中無有毒試劑殘留、無環境污染，試劑可回收利用；
[0023]2.以大孔樹脂為吸附劑，乙醇水溶液為洗脫劑，成本低，分離效果好；
[0024]3.銀杏葉提取物成品收率高，質量好，生產操作簡單，便于工業化生產；[0025]4.通過高效液相色譜法進行表征鑒定、并對銀杏提取物中總銀杏酸、總黃酮醇苷、萜類內酯的含量與收率進行分析，操作簡單，結果準確可靠。
【具體實施方式】[0026]下面將對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0027]實施例1
[0028]本實施例提取銀杏葉提取物的操作方法按照如下兩個步驟來進行:
[0029]銀杏葉提取物粗品的制備:將200g銀杏葉投于3L圓底燒瓶中，用2000g體積分數為65%乙醇熱回流提取2次，每次2小時。合并提取液，濃縮至密度為0.75g/ml，加入450g純化水溶解。將溶液投入到200g大孔樹脂(DM130)柱中。依次用375ml純水、750ml體積分數10%乙醇、1125ml體積分數80%乙醇洗脫，流速為3倍柱體積/小時。收集體積分數為80%的乙醇水洗脫液，濃縮，加入400L體積分數為50%乙醇溶解，將溶液投入到200g大孔樹脂(HPD100)柱中。上完樣后，加750ml體積分數為50%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮至密度為0.8g/ml，得銀杏葉提取物粗品。
[0030]銀杏葉提取物成品的制備:往濃縮物中加入100ml體積分數為80%乙醇回流溶解，常溫過濾，得濾液，回收溶劑，得成品。總黃酮醇苷含量為25.5 %，總萜類內酯含量為14.12%，其中銀杏內酯A含量為3.94%，銀杏內酯B含量為1.99 %，銀杏內酯C含量為
3.94%,總銀杏酸未檢出，收率2.23%。
[0031]實施例2
[0032]銀杏葉提取物粗品的制備:將200g銀杏葉投于3L圓底燒瓶中，用2200g體積分數為80%乙醇熱回流提取3次，每次2小時。合并提取液，濃縮至密度為0.9g/ml，加入600g純化水溶解。將溶液投入到300g大孔樹脂(AB-8)柱中。依次用375ml純水、750ml體積分數為20%乙醇、1125ml體積分數為80%乙醇洗脫，流速為3倍柱體積/小時。收集體積分數為80%的乙醇水洗脫液，濃縮，加入500L體積分數為50%乙醇溶解，將溶液投入到250g大孔樹脂(LKY134)柱中。上完樣后，加750ml體積分數為50%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮至密度為0.9g/ml，得銀杏葉提取物粗品。
[0033]銀杏葉提取物成品的制備:往濃縮物中加入150ml體積分數為80%乙醇回流溶解，常溫過濾，得濾液，回收溶劑，得成品。總黃酮醇苷含量為26.7 %，總萜類內酯含量為
14.89%，其中銀杏內酯A含量為3.75%，銀杏內酯B含量為1.93 %，銀杏內酯C含量為
4.71%,總銀杏酸未檢出，收率2.43%。
[0034]實施例3
[0035]銀杏葉提取物粗品的制備:將200g銀杏葉投于3L圓底燒瓶中，用3000g體積分數為65%乙醇熱回流提取兩次，每次2小時。合并提取液，濃縮至密度為1.1，加入600g純化水溶解。將溶液投入到400g大孔樹脂(DM131)柱中。依次用375ml純水、750ml體積分數為30%乙醇、1125ml體積分數為70%乙醇洗脫，流速為3倍柱體積/小時。收集體積分數為80%的乙醇水洗脫液，濃縮，加入500L體積分數為40%乙醇溶解，將溶液投入到300g大孔樹脂(DM2)柱中。上完樣后，加900ml體積分數為60%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮至密度為l.0g/ml，得銀杏葉提取物粗品。
[0036]銀杏葉提取物成品的制備:往濃縮物中加入300ml體積分數為90%乙醇回流溶解，常溫過濾，得濾液，回收溶劑，得成品。總黃酮醇苷含量為25.8 %，總萜類內酯含量為15.62%，其中銀杏內酯A含量為4.57%，銀杏內酯B含量為1.91 %，銀杏內酯C含量為
4.78%，總銀杏酸未檢出，收率2.40%。
[0037]實施例4
[0038]銀杏葉提取物粗品的制備:將IOkg銀杏葉投于提取罐中，用IOOkg體積分數為70%乙醇熱回流提取兩次，每次2小時。合并提取液，濃縮至密度為0.9，加入25kg純化水溶解。將溶解液投入到IOkg大孔樹脂(AB-8)柱中。依次用15kg純水、30kg體積分數為35%乙醇、45kg體積分數為80%乙醇洗脫，流速為3倍柱體積/小時。收集體積分數為80%的乙醇水洗脫液，濃縮，加入20kg體積分數為50%乙醇溶解，將溶液液投入到IOkg大孔樹月旨(DM130)柱中。上完樣后，加30kg體積分數為50%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮至密度為0.9g/ml，得銀杏葉提取物粗品。
[0039]銀杏葉提取物成品的制備:往濃縮物中加入6kg體積分數為75%乙醇回流溶解，常溫過濾，得濾液，回收溶劑，得成品。總黃酮醇苷含量為26.9%，總萜類內酯含量為14.30%，其中銀杏內酯A含量為4.25%，銀杏內酯B含量為1.94%，銀杏內酯C含量為
4.25%，總銀杏酸未檢出，收率2.23%`。
【權利要求】
1.一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟I)將銀杏葉投于提取罐中，用乙醇水溶液熱回流提取，合并提取液，濃縮得到密度為0.7-1.2g/ml的濃縮物A; 步驟2)濃縮物A用水溶解后投入到DMl30、AB-8、DMl31或D318大孔吸附樹脂柱中充分吸附，依次用體積分數為O %、10-30 % >40-80 %的乙醇水溶液進行梯度洗脫，收集40-80 %乙醇水洗脫液并濃縮得到濃縮物B ;濃縮物B用乙醇水溶液溶解后投入到D101、HPD100、LKY134或DM2大孔吸附樹脂柱中充分吸附，用體積分數為40-80%的乙醇水溶液進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至密度為0.7-1.2g/ml，得到濃縮物C ； 步驟3)濃縮物C中加入乙醇水溶液回流溶解，并常溫過濾除去不溶雜質，將濾液濃縮，干燥后到銀杏葉提取物成品。
2.如權利要求1所述的銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中，乙醇水溶液的體積分數為50-85%。
3.如權利要求2所述的銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中，乙醇水溶液的用量為提取物體積的8-15倍。
4.如權利要求1所述的銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中回流提取次數為2-4次，每次提取1.5-2.5小時，提取溫度為70-90°C。
5.如權利要求1所述的銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，銀杏葉濃縮物A用2-4倍純化水進行溶解。
6.如權利要求1所述的銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，大孔樹脂柱的體積:銀杏原葉質量 為l_2ml: Ig0
7.如權利要求1所述的銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，依次用體積分數為0^^10-30^30-80%的乙醇水溶液洗脫，所用洗脫體積分別是I倍柱體積、2倍柱體積、3倍柱體積，流速為3倍柱體積/小時。
8.如權利要求1所述的一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，D101/HPD100/LKY134/DM2大孔吸附樹脂用量為提取物質量的8_15倍，洗脫液為體積分數為40-80%乙醇水溶液，用量為1.5-2.5倍柱體積。
9.如權利要求1所述的一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中，乙醇水溶液的體積分數為60-95%，加入的乙醇水溶液體積為濃縮物C體積的10-30倍。
10.如權利要求1所述的一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中干燥為噴霧干燥、冷凍干燥或真空干燥。
【文檔編號】A61K36/16GK103655642SQ201210353451
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月21日 優先權日:2012年9月21日
【發明者】羅春, 黃麗絲 申請人:廣州白云山漢方現代藥業有限公司