專利名稱：3,5-二硝基苯甲酰胺在制備抗結核藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及化合物的新用途，具體地說，涉及3，5- 二硝基苯甲酰胺在制備抗結核藥物中的應用。
背景技術：
目前，抗結核藥物在臨床上的濫用現象，使結核菌耐藥性的問題日益突出，而曾使肺結核的死亡率降低了 80%的抗結核藥物現在對大多數的肺炎球菌都無效。據統計，在我國結核病每年新發病例145萬，每年新發肺結核患者的耐多藥(對利福平和異煙肼兩種或兩種以上抗結核藥物耐藥)率為8. 32%，廣泛耐藥(幾乎對所有的抗結核藥物都耐藥)率為O. 68%。因此，尋找新的抗結核藥物是目前抗結核工作的重點。而在抗結核藥物研發中，多數的藥物作用靶點，都是從抑制結核菌的生存為出發點，而采用該模式篩選到的抗結核藥物， 很容易使結核菌在藥物的選擇壓力下，產生對藥物的耐受。所以，尋找不容易導致耐藥產生的新靶點，并以此為靶點篩選出活性化合物，給結核病的治療提供了新思路。以結核分枝桿菌ESX-I分泌系統為靶點，開展抗結核藥物的研究。ESX-I分泌系統(VII型分泌系統)主要由RDl (region of difference I)區編碼,包括9個基因(Rv3871 Rv3879c)，全長約9. 5kb。該基因區在BCG疫苗株和一些非致病性結核分枝桿菌如田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti)中是缺失的，因此,該基因區在體外不影響結核菌的生長。但是在體內，結核分枝桿菌的ESX-I分泌系統介導多種毒力因子的分泌,在結核桿菌的致病性中起著關鍵作用，ESX-I分泌系統參與了結核分枝桿菌與宿主細胞的結合，引起細胞溶解，促進肉芽腫的形成，抑制吞噬體成熟；同時能夠調節宿主細胞的相關免疫反應，對減少感染的巨噬細胞的細胞因子分泌反應起重要作用。如果將完整的RDl區整合入BCG疫苗株中，整合株在小鼠肺內的持留或增殖能力大大增強，并且也增強了其在宿主細胞內的存活能力。在ESX-I系統中，Rv3869、Rv3870和Rv3877分別有1、3和11個跨膜區，這三種蛋白同ESX-I分泌系統具有ATP酶活性的Rv3871共同形成一個膜結合的ESX-I分泌復合體，Rv3871與CFP-10的C末端信號肽結合，將CFP-10和ESAT-6轉運到胞外。CFP-10和ESAT-6通常以二聚體的形式存在，CFP-10的C端具有信號序列，其C末端的七個氨基酸是CFP-10蛋白分泌所必須的，它還可以介導異源蛋白的分泌，如果將泛素的C末端連接這七個氨基酸，泛素能夠被分泌至胞外。以ESX-I分泌系統為靶點，尋找能夠抑制該系統發揮功能，又不抑制分枝桿菌生長的抗結核藥物，這樣既可以降低結核菌的毒力和細胞內的生存力，又能夠減少產生耐藥性的可能性。相對結核分枝桿菌而言，海分枝桿菌生長速度相對較快、存在ESX-I分泌系統且生物安全性較高，目前已廣泛用于結核病發病機制的研究。選擇內源性表達ESX-I分泌系統的海分枝桿菌為模式生物，以CFP-10與熒光素酶(Luciferase簡稱LUC)融合作為報告基因，構建外源表達CFP-10和熒光素酶融合蛋白的重組海分枝桿菌，建立ESX-I分泌系統抑制劑的篩選模型。3，5 二硝基苯甲酰胺又名硝苯酰胺，一般用作抗球蟲藥，優點是抗藥性產生得較慢，而對于其抗結核的作用從未有過報道。

發明內容
本發明的目的是提供3，5- 二硝基苯甲酰胺在制備抗結核藥物中的應用。為了實現本發明目的，本發明通過構建外源表達來自于結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和報告蛋白的融合蛋白的重組海分枝桿菌，以該重組菌作為針對ESX-I分泌系統的抗結核病藥物高通量篩選模型，向含有該重組菌的培養液中加入一定濃度的3，5- 二硝基苯甲酰胺，培養一段時間后離心取上清測定報告蛋白的表達量或活性，以此來評價3，5- 二硝基苯甲酰胺對ESX-I分泌系統的抑制活性。前述的報告蛋白為熒光素酶、氯霉素乙?；D移酶、β_半乳糖苷酶、分泌型堿性磷酸酶或熒光蛋白家族中的成員，優選報告蛋白為熒光素酶。進一步地，本發明提供一種抗結核藥物，其有效成分為3，5- 二硝基苯甲酰胺。任選含有藥用賦形劑。優選所述抗結核藥物為液體劑型、注射劑型、片劑、丸劑、顆粒劑或膠囊劑等。本發明選擇結核分枝桿菌生長非必需但與其致病性密切相關的ESX-I分泌系統為藥物靶點，構建抗結核病藥物高通量篩選模型，利用該模型首次篩選出既能降低結核分枝桿菌的致病性又不抑制其體外生長，即不易誘發耐藥的新型抗結核活性化合物一3，5- 二硝基苯甲酰胺，為進一步研究該化合物在抗結核藥物的臨床應用奠定了基礎。


圖I為本發明重組質粒PMV261-LUC-CFP-10的結構示意圖。圖2為本發明陽性化合物IMB-BZ的活性分析，其中A和C為抑制胞外熒光素酶分泌的活性，B為抑菌活性。圖3為本發明陽性化合物MB-BZ對Raw 264. 7細胞的毒性。圖4A和B為感染了海分枝桿菌的巨噬細胞Raw 264. 7的抗酸染色結果。圖5為本發明陽性化合物MB-BZ對海分枝桿菌生長的抑制，其中，A為加藥48h、96h后CFU值，B為加藥48h、96h后涂布平板結果。圖6為本發明陽性化合物IMB-BZ的細胞內抗海分枝桿菌活性，其中，A為隨著藥物濃度的增加，細胞內海分枝桿菌的存活率逐漸下降，B為涂布平板結果；C為感染48h、72h、96h后海分桿菌在細胞內的存活率，D為涂布平板結果；E為陽性化合物IMB-BZ對海分枝桿菌M株以及三個突變株M3、M7和M8生長的抑制，F為涂布平板結果。圖7為本發明陽性化合物MB-BZ對ESX-I分泌系統的底物CFP-10分泌的影響，其中，M為DMSO對照組，M+為給藥MB-BZ50 μ M組，以Hsp65表達水平為內參評價陽性藥物作用效果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。以下實施中使用的質粒pMV261已在C. K. Stover等，New use of BCGfor recombinant vaccines. Nature 1991, 351:456-460 中公開，該質粒由法國UniversiteMontpellier II Laurent 博士惠贈。實施例I抗結核病藥物高通量篩選模型的構建I. I 質粒 pMV261-LUC-CFP-10 的構建以質粒pGL4 (購自 Promega 公司)為模板，以 5' -TTCCGAATTCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA-3'為上游引物，以 5' -CTTCATCTCTGCCATCACGGCGATCTTG-3'為下游引物進行PCR擴增得到LUC片段，以結核分枝桿菌基因組DNA為模板，以Y -CAAGATCGCCGTGATGGCAGAGATGAAG-3'為上游引物，以 5' -AATTAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3'為下游引物得到 CFP-IO 片段，再以 LUC 和 CFP-IO 為模板，以 5' -TTCCGAATTCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA-3'為上游引物，以 5' -AATTAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3'為下游引物進行 PCR擴增得到LUC-CFP-IO片段，在質粒pMV261上的酶切位點EcoR I和Hind III之間插入此片 段，得到重組質粒，命名為pMV261-LUC-CFP-10(重組質粒的結構如圖I所示，其核苷酸序列如 Seq ID No:7 所示)。I. 2海分枝桿菌的培養取凍存的海分枝桿菌ATCC 927 (購自美國典型培養物保藏中心)，加入7H9液體培養基(購自BD公司)中，28°C，180r/min培養活化。用接種環蘸少許菌液，在7H11固體培養基(購自BD公司)平板上劃線，28°C靜置培養數天后挑取單菌落于7H9液體培養基中，28°C，180r/min振搖培養A_ (600nm處的吸光度值)約O. 8。I. 3重組海分枝桿菌的構建I. 3. I海分枝桿菌感受態細胞的制備將培養至A6tltl約O. 8的海分枝桿菌菌液置于冰浴30min后，4°C，8000r/min離心15min收集菌體，并用預冷的10%甘油洗滌4次后重懸于Iml 10%甘油中，即得到海分枝桿菌感受態細胞。I. 3. 2重組質粒的電穿孔轉化取1μ g重組質粒加入到500 μ I感受態細胞中，以空白質粒pMV261作為對照，充分混勻，冰浴30min后轉入預冷的直徑為2mm電穿孔杯中，在電壓2. 5kV，電容50 μ F，電阻720Ω的條件下進行電穿孔轉化，脈沖時間4ms，放電完畢后立即冰浴lOmin。將轉化后的海分枝桿菌轉入不含抗生素的7H9液體培養液中于28°C，180r/min培養4_5小時后，取200 μ I涂布于含有50μ g/ml卡那霉素(購自Sigma公司)的7H11固體培養基平板表面，于28°C靜置培養5-7d，篩選陽性克隆。將含有質粒pMV261-LUC-CFP-10的重組海分枝桿菌命名為 MM-pMV261-LUC-CFP-10。I. 4待篩選的藥物化合物樣品的制備 化合物樣品將IOmg純品化合物溶于Iml DMSO中，用50%DMS0稀釋到lmg/ml，取
2μ I作用于198 μ I菌體上清中，使其終濃度為10 μ g/ml。發酵液樣品菌種發酵,從斜面上挑取一小塊培養物接入盛有50ml發酵培養基的250ml三角瓶中，28°C，190rpm旋轉搖床培養4d。取IOml發酵液用IOml的丙酮抽提，揮干后，用Iml的DMSO溶解。取10μ I加10μ I水倍比稀釋，取2μ I作用于198 μ I菌體上清中。I. 5樣品活性檢測
將培養至A6tltl約為O. 8的重組海分枝桿菌離心收集菌體，換新的培養基稀釋A6tltl約為0.1，按以下分組進行操作?？瞻讓φ战M加入2 μ I 50%DMS0于198 μ I海分枝桿菌(ATCC927)中。實驗組分為兩組對照組加入2 μ I 50%DMS0 于 198 μ I 重組海分枝桿菌(MM-pMV261-LUC-CFP_10)菌液中，以此來反映DMSO對LUC-CFP-10分泌的影響。樣品組取待篩選的樣品2 μ I于198 μ I上述重組海分枝桿菌菌液中，該組反映篩選樣品對ESX-I分泌系統的抑制程度，同時反映對菌體生長的抑制程度。96孔板密封培養48h后離心收集上清，吸取20 μ I上清至白色酶標板中，加入50 μ I熒光素酶底物(購自Promega公司)測定熒光素酶活性，并測定Α_。
I. 6數據處理分泌效率=(樣品組一空白對照組)/ (對照組一空白對照組)X 100%抑制率=100 —分泌效率I. 7測試樣品對重組海分枝桿菌體外生長的影響。為了獲得能抑制ESX-I系統的分泌效率，但是對重組海分枝桿菌的生長抑制作用卻很小，因此不易產生耐藥的活性化合物，將已加入樣品并且培養了 48小時的重組海分枝桿菌取100 μ I測定其Α_，以此來監測測試樣品對重組海分枝桿菌生長狀況的影響。實驗數據用x±s表示，顯著性分析采用Excel軟件中的數據分析工具進行t檢驗(η > 3)。I. 8測試樣品對LUC酶活性的影響ESX-I系統是結核分枝桿菌及海分枝桿菌等引發致病性的重要分泌系統，許多重要的毒力蛋白都是通過該分泌系統分泌到胞外。為了得到抑制ESX-I分泌系統分泌效率的活性化合物，以期能降低結核分枝桿菌的毒力。將接種時加入樣品并培養了 48小時的重組海分枝桿菌，離心吸取上清20 μ I于白色酶標板中，加入50 μ I底物測定Luciferase活性。實驗數據用x±s表示，顯著性分析采用Excel軟件中的數據分析工具進行t檢驗(η > 3)。實施例23，5- 二硝基苯甲酰胺的篩選I材料與方法 I.陽性化合物的篩選I. I培養時間的確定將培養至A6tltl約為O. 8的海分枝桿菌及重組海分枝桿菌5000g離心5min收集菌體，換新鮮蘇通培養基稀釋A_約為O. 1，分別接種到96孔板中，每個樣品重復32孔，周邊孔加水防止培養基蒸發，96孔板密封培養48h、72h、96h后離心收集上清，吸取20 μ I上清至白色酶標板中，加入35μ I熒光素酶底物，測定熒光素酶活性。確定最佳培養時間，以此為依據，進行藥物篩選。1. 2化合物樣品的制備化合物樣品將純品化合物溶解于Iml DMSO,用50%DMS0稀釋到2mM，取2 μ I作用于198 μ I菌體上清中，使其終濃度為20 μ MoI. 3重組海分枝桿菌熒光素酶活性的測定
將培養至A_約為O. 8的重組海分枝桿菌5000g離心5min收集菌體,換新鮮蘇通培養基稀釋A6tltl約為O. I。藥物篩選按以下分組進行操作I)空白對照組加入2 μ I 50%DMS0于198 μ I海分枝桿菌中。2)對照組力卩Λ 2μ I 50%DMS0于198 μ I重組海分枝桿菌(MM-pMV261-LUC-CFP-10 )菌液中，以此來反映DMSO對LUC-CFP-10分泌的影響。3)樣品組取待篩選的樣品2μ I加入198 μ I上述重組海分枝桿菌菌液中，該組反映篩選樣品對ESX-I分泌系統的抑制程度，同時反映對菌體生長的抑制程度。4) 96孔板密封培養48h后離心收集上清，吸取20 μ I上清至白色酶標板中，加入35 μ I熒光素酶底物，測定熒光素酶活性。
I. 4測試樣品對重組海分枝桿菌體外生長狀況的影響為了獲得能抑制ESX-I系統的分泌效率，但是對重組海分枝桿菌的生長抑制作用卻很小，因此不易產生耐藥的活性化合物，將熒光值下降50%并且培養了 48小時的重組海分枝桿菌重懸，取100 μ I測定其Α_，以此來監測測試樣品對重組海分枝桿菌生長狀況的影響，選擇A6tltl下降小于10%的樣品作為有意義的陽性化合物。I. 5非特異性陽性化合物的排除將培養至Α_約為O. 8的重組海分枝桿菌5000g離心5min收集菌體，取上清198 μ I于96孔板中，加入2 μ I挑選出的既可以使熒光素酶活性下降，又不影響菌體生長的陽性化合物，28°C放置2-3h，測定上清中熒光素酶活性。選擇酶活性下降小于10%的陽性化合物作為篩選有意義的陽性化合物。I. 6數據處理分泌效率=(樣品組一空白對照組)/ (對照組一空白對照組)X 100%抑制率=100 —分泌效率2.陽性化合物對重組海分枝桿菌中LUC-CFP-10分泌活性的影響將重組海分枝桿菌置于3ml 7H9液體培養基培養A_約為O. 4左右，離心收集菌體，換新鮮的蘇通培養基，培養A6tltl約為O. 8左右，5000g離心5min，收集上清，加入到MWCO30000離心超濾管(Amicon Ultra_4ml, Millipore)中，4000g離心25分鐘，至終體積為100 μ I。將離心收集后的菌體細胞加入溶菌裂解液重懸，進行超聲破碎，功率20%，超聲5s，停8s，工作時間15min，5000g離心10分鐘，去除未破碎的菌體及細胞碎片。將上述濃縮后的上清及超聲破碎得到的菌體蛋白進行蛋白定量，定量后的所有樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液，振蕩混勻，沸水浴煮lOmin，冷卻后即可上樣，進行Western blot檢測。3.陽性化合物對重組海分枝桿菌體外有效抑制濃度的測定陽性化合物的配制稱取陽性化合物，用DMSO配制成64m M的儲存液，_20°C保存。使用時，將陽性化合物用DMSO倍比稀釋成32mM、16mM、8mM、4mM、2mM和ImM。將培養至A6tltl約為O. 8的重組海分枝桿菌5000g離心5min收集菌體，換新鮮蘇通培養基稀釋至A_約為O. 1，接種到96孔板中，同時分別加入不同濃度的陽性化合物，使其終濃度分別為O μ M、10 μ M、20 μ Μ、40 μ Μ、80 μ Μ、160 μ Μ,周邊孔加水防止培養基蒸發，96孔板密封培養48h后離心收集上清，吸取20 μ I上清至白色酶標板中，加入35 μ I熒光素酶底物，測定熒光素酶活性。
4.不同濃度陽性化合物對重組海分枝桿菌體外生長影響的測定為驗證不同濃度陽性化合物對重組海分枝桿菌體外生長的影響，將上述已加入化合物作用48h離心后的海分枝各孔中的菌體重懸，取100 μ I測定Α_。5.陽性化合物體內活性的測定5. I巨噬細胞Raw264. 7細胞的培養①細胞復蘇將液氮凍存細胞迅速投入37°C水浴，持續晃動，使其快速融化。800rpm離心3min，棄上清，吸取Iml含10%FBS的DMEM完全培養液重懸細胞，對細胞進行適當稀釋后接種至細胞培養瓶中，放入37°C、5%C02的培養箱中進行培養，次日更換培養液繼續培養。②細胞傳代 當細胞生長至達瓶底面積70°/Γ80%時，傳代培養。傳代時首先棄去原有培養基，加入適量O. 25%胰蛋白酶和O. 02%EDTA(v v=l: I)消化液。37°C消化約3min后棄去消化液，立即加入含10%FBS的DMEM培養液，用吸管反復輕輕吹打瓶皿底壁，使細胞完全脫離底壁且吹打使之分散為單個細胞懸液。再依據實驗需要按適當比例接種細胞懸液于新的培養瓶內，置于37°C、5%C02培養箱中繼續靜置培養，傳至2 3代用于后續實驗。③細胞凍存取對數生長期生長狀態良好的細胞，用胰酶消化后SOOrpm離心3min收集細胞，棄上清，加入含10%DMS0的FBS凍存液輕輕吹打后制成單細胞懸液，逐滴加入凍存管，封口，標記。放入凍存盒，-20°C放置lh，-80°C放置3h-4h后緩慢投入液氮中保存。6.海分枝桿菌感染巨噬細胞①巨噬細胞接種孔板的制備取對數生長期生長狀態良好的細胞，胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM培養液調整細胞濃度為2. OX IO5個/ml，接種于24孔培養板中，每孔1ml。放入37°C、5%C02的培養箱中進行培養使細胞貼壁。②實驗用海分枝桿菌的制備將培養至對數生長期的海分枝桿菌5000rpm離心IOmin收集菌體，PBS洗滌3次后，加入不含血清的DMEM培養液重懸，用瑪瑙研缽適當研磨菌體后使其充分分散為單個菌，用紫外分光光度計測其A_值，轉換公式為A=4. 5 X 10_9X C。③海分枝桿菌感染巨噬細胞按感染復數為50的比例使海分枝桿菌感染巨噬細胞，37°C飽和濕度、5%C02條件下感染3h，將24孔板中的一孔細胞用胰酶消化后，取細胞懸液制成細胞涂片，用預冷的甲醇-醋酸(V:V=3:1)于4°C固定30min，做抗酸染色。顯微鏡下觀察到細胞內有抗酸染色陽性的海分枝桿菌后，吸出原有細胞培養液，用無菌PBS洗滌細胞3次，更換含有200 μ g/ml慶大霉素的新鮮培養液，以除去未被吞噬的海分枝桿菌，無菌PBS洗滌細胞3次，加入Iml含不同藥物濃度的DMEM完全培養基，置37°C、5%C02的培養箱中培養72h后，用胰酶將細胞消化下來，以含O. l%TritonX-100的PBS裂解細胞，用PBS將裂解后的細胞系列稀釋涂布于不含抗性的LB平板上，每組樣品最少4個稀釋度。每個稀釋度涂布3個平板，37°C靜置培養6-8d，待菌落長出后計數CFU。7. ESX-I分泌蛋白檢測
①海分支桿菌的制備將培養至對數生長期的海分枝桿菌3000rpm離心5min，收集菌體，PBS洗滌3次后，加入蘇通(Sauton)培養基重懸，同時給藥MB-BZ50 μ Μ，以加入等體積DMSO的樣品為對照，繼續培養3飛天后收集樣品。②蛋白樣品的制備將在Sauton培養基中培養3 5天的海分支桿菌5000rpm離心IOmin,分別收集菌體和上清液。上清移入干凈的EP管中,Amicon Ultra_4(millipore)濃縮至100 μ I ;菌體細胞中加入適量體積的分支桿菌菌體裂解液后，加入苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF)至終濃度為100 μ g/ml，在冰水浴下超聲破碎菌體，功率20%，超聲5s，間隔8s，作用70次，所得破碎細胞于4°C 15000g離心15min，去除未破碎的菌體及細胞碎片。取上清加入1/4體積的5XSDS-PAGE上樣緩沖液，振蕩混勻，沸水浴煮IOmin后即可用于SDS-PAGE 電泳。 ③ western-blot 檢測SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜lh，PBST洗膜一次后，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉Ih，PBST洗膜一次，用含2%脫脂奶粉的PBST配制一抗、二抗。一抗孵育2h，PBST洗膜三次，每次lOmin，二抗孵育lh，PBST洗膜三次，每次lOmin，ECL顯色，記錄結果。II 結果I.以ESX-I分泌系統為靶點的模型的應用陽性化合物的篩選結果利用以ESX-I分泌系統為靶點建立的篩選模型，得到具有抑制重組海分枝桿菌分泌活性的陽性化合物3，5- 二硝基苯甲酰胺(MB-BZ )。對陽性化合物MB-BZ有效抑制濃度范圍進行了測定。如圖2A所示，在作用濃度為10 μ M時，頂B-BZ (相當于2. I μ g/ml)明顯地抑制胞外熒光素酶的分泌，且呈劑量依賴性。為了排除分泌活性的下降是由于陽性化合物抑制了重組菌的生長的可能性，測定了陽性化合物對重組海分枝桿菌體外生長的影響。當藥物濃度增加了十六倍(160 μ M)時，陽性化合物沒有出現明顯的抑菌活性(圖2Β)，因此，篩得的化合物在體外幾乎沒有抑菌活性。因此，它對重組海分枝桿菌分泌熒光素酶的抑制作用并不是因為菌體的生長受到抑制而造成的。為了進一步排除陽性化合物是熒光素酶抑制劑的可能性，在重組海分枝桿菌的上清中加入陽性化合物，作用一段時間后測定酶活性。如圖2C所示，當濃度增大到160 μ M時，IMB-BZ對熒光素酶抑制作用不明顯。以上實驗表明，篩得的化合物既抑制重組海分枝桿菌的分泌活性，又沒有體外抑菌活性，可以作為較為理想的活性化合物去進行后續的實驗。2.陽性化合物細胞內抗海分枝桿菌活性的測定及其作用機制的研究2. I陽性化合物作用于Raw 264. 7細胞的毒性實驗首先采用CCK-8試劑盒測定了上述化合物的細胞毒性。如圖3所示，當藥物濃度達到160 μ M時，IMB-BZ未見明顯毒性，因此可以用于體內實驗進行下一步驗證。2. 2陽性化合物MB-BZ細胞內抗海分枝桿菌的活性根據上述實驗的結果，利用抑制ESX-I分泌系統活性較好而細胞毒性較低的化合物MB-BZ進行后續研究。首先將海分枝桿菌感染巨噬細胞Raw 264. 7，感染復數為50?？顾崛旧@示巨噬細胞Raw 264. 7可以有效吞噬海分枝桿菌(如圖4A和B)。感染后，加入終濃度為IOyM的MB-BZ藥物，分別在加藥48h、96h后裂解細胞，釋放胞內細菌，適當稀釋后涂布平板，計數CFU。如圖5A、5B所示，在加入藥物48h和96h后，與未加藥組相比，加藥組的CFU均明顯下降，表明MB-BZ可以影響胞內的海分枝桿菌的生存。為了定量評價IMB-BZ細胞內抗海分枝桿菌的活性，將不同濃度的化合物作用于感染了海分枝桿菌的巨噬細胞，72小時后，裂解細胞涂布平板。隨著藥物濃度的增加，細胞內海分枝桿菌的存活率逐漸下降(圖6A、B所示)，IC50約為7. 7 μ M。盡管IMB-BZ在體外并不抑制菌體的生長，而在體內卻表現出明顯的抑菌活性(IC5tl為7.7 μ Μ)。為了進一步了解IMB-BZ的抗菌活性，將感染了海分枝桿菌的巨噬細胞分別用10 μ M藥物處理24h、48h、72h、96h，同時，另外一組細胞分別在24h后更換同濃度的藥物，以防止藥物有效濃度的降低，保證藥物的有效作用時間。每隔24h更換加藥的培養基，感染48h、72h、96h后海分桿菌在細胞內的存活率低于未更換培養基組(圖6C、D)。
上述實驗表明MB-BZ抑制海分枝桿菌的ESX-I分泌系統及其在細胞內的生存，為了進一步驗證此化合物的胞內抗菌活性是與ESX-I分泌系統有關的，研究了 MB-BZ對海分枝桿菌 M 株的 ESX-I 突變株 M3 (Mh3868: : Τη)、M7 (Mh3879: : Τη), M8 (Mh3881: : Tn)(海分枝桿菌 M 株、M3 (Mh3868: :Tn)、Μ7 (Mh3879: :Tn)和 M8(Mh3881: :Tn)由美國(舊金山)力口州大學醫學、微生物學和免疫學系的Eric J. Brown教授惠贈，A mycobacterial virulencegene cluster extending RDl is requiredfor cytolysis, bacterial spreading andESAT-6secretion. MolecularMicrobiology (2004) 53 (6), 1677 - 1693))的細胞內抗菌活性。已知Mh3879是ESX-I分泌系統的蛋白之一，Mh3868、Mh3881均屬于extended RDl區(延長的RDl區)，被證明對于海分枝桿菌發揮毒力起著重要作用。感染巨噬細胞后，加入10 μ M化合物作用72小時后，計數CFU (圖6F)，三株突變菌株在細胞內與野生株相比都有明顯的生長缺陷，即胞內存活率均低于野生株的40% (圖6Ε)，加入10 μ M的活性化合物后，藥物對于野生株在體內的生長有明顯的抵制作用，而對于突變株而言，無論加藥還是不加藥，海分枝桿菌在細胞內的生長都沒有明顯的改變。這些實驗結果表明，MB-BZ在體內的抑制作用很可能是通過抑制ESX-I分泌系統來實現的。2. 3陽性化合物MB-BZ對CFP-10分泌的影響將培養至對數生長期的海分枝桿菌接入Sauton培養基中，同時給藥MB-BZ50 μ Μ，以加入等體積DMSO的樣品為對照，繼續培養3飛天后收集樣品，進行western-blot分析。結果如圖7所示，當菌體蛋白中Hsp65表達水平相當的情況下，等體積的上清蛋白樣品中約12kD位置處可看到明顯條帶，且加藥組中蛋白水平明顯低于DMSO組，表明陽性化合物MB-BZ可抑制ESX-I分泌系統的底物CFP-IO的分泌。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。參考文獻Stanley SA, Raghavan S，Hwang ffff, Cox JS. Acute infection andmacrophagesubversion by Mycobacterium tuberculosis require a specializedsecretion system. Proc Natl Acad Sci USA 2003，100:13001-13006· Guinn KMj HickeyMJ，Mathur SK，Zakel KLj Grotzke JEj Lewinsohn DM, et al. Individual RDl-region genesare required for export of ESAT-6/CFP-IOand forvirulence of Mycobacteriumtuberculosis. Mol Microbiol 2004，51:359-370. Brodin P，Majlessi L，MarsollierL，de Jonge MI，Bottai D，Demangel C，et al. Dissection of ESAT_6system IofMycobacterium tuberculosis and impact onimmunogenicity and virulence. InfectImmun 2006，74:88-98.
Pym AS, Brodin P, Brosch Rj Huerre M，Cole ST. Loss of RDlcontributed totheattenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCGandMycobacterium microti. Mol Microbiol 2002，46:709-717.Champion PA, Stanley SA，Champion MMj Brown EJj Cox JS. C-terminalsignalsequence promotes virulence factor secretion in Mycobacteriumtuberculosis. Science2006，313:1632-1636.Gao LY, Guo S，McLaughlin B，Morisaki H，Engel JNj Brown EJ. Amycobacterialvirulence gene cluster extending RDI is required forcytolysis,bacterial spreading andESAT-6secretion. Mol Microbiol2004，53:1677-1693.
權利要求
1.3，5- 二硝基苯甲酰胺在制備抗結核藥物中的應用。
2.一種抗結核藥物，其有效成分為3，5- 二硝基苯甲酰胺。
3.根據權利要求2所述的抗結核藥物，任選含有藥用賦形劑。
4.根據權利要求2或3所述的抗結核藥物，其為液體劑型、注射劑型、片劑、丸劑、顆粒劑或膠囊劑。
全文摘要
本發明涉及3,5-二硝基苯甲酰胺在制備抗結核藥物中的應用。本發明選擇結核分枝桿菌生長非必需但與其致病性密切相關的ESX-1分泌系統為藥物靶點，構建抗結核病藥物高通量篩選模型，利用該模型首次篩選出既能降低結核分枝桿菌的致病性又不抑制其體外生長，即不易誘發耐藥的新型抗結核活性化合物--3,5-二硝基苯甲酰胺，為進一步研究該化合物在抗結核藥物的臨床應用奠定了基礎。
文檔編號A61P31/06GK102871992SQ20121035927
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月24日 優先權日2011年9月30日
發明者岑山, 賈平平, 張義, 李曉宇, 周金明, 殷霄 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所