專利名稱：一種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體及其制備方法。
背景技術：
通過表達生物活性物質、抑制導致基因紊亂或不可控細胞增值的功能異常基因等策略來進行基因治療是預防和治療遺傳缺陷性疾病、感染、腫瘤和心血管等諸多重大疾病的有力方法。目前，缺乏安全而有效的基因載體是限制基因治療在臨床上的廣泛應用的主要瓶頸。盡管病毒載體，比如腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒，具有高轉染效率，其潛在的免疫原性和生產控制、成本等問題阻礙了其應用。與病毒載體相比，非病毒載體具有許多優點，例如低免疫原性和毒性、易于合成并批量生產、成本低、穩定性好、易于通過結構調整傳遞分子大小不同的一系列核酸類藥物等。因此，開發有效的非病毒載體是近年來化學、材料、藥學、生物學、醫學和納米科學等學科交叉研究的前沿領域之一。
通過使用一系列陽離子磷脂和聚合物可以實現核酸藥物的凝聚和傳遞，其中包括Lipofectamine 2000、類磷脂化合物、聚こ烯亞胺(PEI)、聚(L-賴氨酸)(PLL)、聚ニ甲基ニ烯丙基胺鹽酸鹽(PDADMAC)、聚[2- (ニ甲基胺基)-こ基丙烯酸甲酷](PDMAEMA)、陽離子型聚丙烯酰胺(CPAM)、聚精氨酸，以及天然的殼聚糖(Chitosan)及其衍生物等。此外,近年來新合成的用于基因轉染的可降解聚陽離子電解質有聚磷酸酯為主鏈的陽離子聚電解質、聚(4-羥基-L-脯氨酸酷)、聚(L-絲氨酸酷)型陽離子聚合物、聚[a-(4-氨基丁基)-L-こ醇酸]、聚(β -胺基酷)型陽離子聚電解質、環糊精主鏈型陽離子聚電解質、聚(L-天冬酰胺)型陽離子聚電解質、以及陽離子聚磷腈等。這些載體系統的最終轉染效率取決于其分子結構。另外，可以將核酸類藥物包裹或吸附于微膠囊(Microcapsule)、迷你細胞(MinicelI)、脂質體(Liposome)、脂質納米粒、聚合物納米粒、無機納米粒、有機/無機雜化納米粒及DNA/RNA組裝體等微納結構中，實現其細胞內化、轉運及靶部位轉染。盡管最近十年來開發了包括上述陽離子型材料和聚合物納米粒在內的許多非病毒型載體系統，這些工作只取得了有限的成功，僅有個別系統目前進入臨床研究。陽離子型聚合物載體，由于其與核酸類藥物主要通過靜電作用絡合，最終絡合物易于受到血液和細胞外液大量存在的多聚陰離子的影響而解絡合，從而無法到達靶部位實現理想的轉染。另外，對于低分子量核酸類藥物匕如反義核苷酸、siRNA和miciORNA)，其本身的剛性結構和較低的電荷密度往往導致不完全的凝聚。盡管通過使用高電荷密度和高分子的載體可以部分解決這些問題，但又會導致細胞毒性、組織損傷和血栓形成明顯加劇。另ー方面,對于反義核苷酸、siRNA和microRNA等核苷酸，其良好的水溶性和低表面電荷限制了有效包裹，因此聚合物或其他有機納米對該類核酸類藥物的負載效率較低。因此，探尋安全、高效、低成本且易于批量生產的非病毒納米載體依然是ー項極具挑戰性的工作
發明內容
本發明的目的是提供一種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體及其制備方法。為了達到上述目的，本發明采取以下措施本發明所述的能高效負載核酸類藥物的復合納米載體由可降解有機材料和不同分子量多聚胺組成，其中 不同分子量多聚胺與可降解有機材料的質量比為O. 005 100-3 7 ;該復合納米載體為球形，粒徑為80-950 nm，核酸類藥物均勻分布于其中。上述可降解有機材料選自聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-こ交酯(PLGA)、聚ε -己內酯(PCL)、聚原酸酷、縮醛化α-環糊精、縮醛化環糊精、縮醛化Y-環糊精、縮醛化α-環糊精聚合物或縮醛化β_環糊精聚合物；其中聚合物類可降解有機材料的分子量為1-100kDa ο上述不同分子量多聚胺選自低分子量多聚胺或聚こ烯亞胺；其中聚こ烯亞胺的分子量為 O. 6-50 kDa O上述低分子量多聚胺選自亞精胺(Spermidine)、精胺(Spermine)或腐胺(Putrescineノ。上述能高效負載核酸類藥物的復合納米載體的制備方法如下首先將核酸類藥物溶于水中得到內水相，將可降解有機材料與不同分子量多聚胺溶解在有機溶劑中得到有機相，將聚こ烯醇(PVA)的水溶液作為外水相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲作用下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到本發明所述的能高效負載核酸類藥物的復合納米載體。在上述制備方法中，所述有機溶劑選自ニ氯甲烷、氯仿或こ酸こ酷。在上述制備方法中，所述核酸類藥物在內水相中的濃度為O. 00001-1000 nmol/μ I。在上述制備方法中，所述可降解有機材料在有機相中的濃度為O. 5 -5000 mg/ml。在上述制備方法中，所述內水相和有機相的體積比為O. 005 1-0. 5 :1。在上述制備方法中，所述有機相和外水相的體積比為O. 005 1-0. 5:1。在上述制備方法中，所述聚こ烯醇在外水相中的質量百分濃度為O. 001-10%;其中聚こ烯醇的分子量為1-100 kDa，摩爾水解度為60-90%。本發明的優點是(I)本發明所使用的縮醛化環糊精材料合成簡單、易于放大、且成本較低；其他可降解有機材料和不同分子量多聚胺均有市售產品，其價格相對低廉，故易于實現相應復合納米載體的產業化。(2)本發明所選用的可降解有機材料和低分子量多聚胺或低分子量聚こ烯亞胺均有較好的體內外相容性；而使用高分子量聚こ烯亞胺時，用量很低，因此保證了最終復合納米載體的體內相容性。(3)本發明所采用的雙乳液法簡單易行，且使用的低沸點溶劑易于去除，保證了最終復合納米載體應用的可行性和安全性。(4)本發明所制備的復合納米載體微粒的大小可以通過制備エ藝參數來調控。(5)本發明所采用的復合納米載體制備方法可以實現核酸類藥物的高效包裏。
(6)本發明所制備的復合納米載體中核酸類藥物均勻分布，易于在細胞內或其他靶部位釋放。(7)本發明所制備的復合納米載體對部分核酸類藥物的轉染效率大于目前廣泛使用的分子量為25 kDa的枝化PEI和Lipofectamine2000，且細胞毒性低于后兩者。


圖I是由分子量為25 kDa的枝化PEI和PLGA制備的包裹pDNA (編碼β -半乳糖苷酶)的復合納米載體的掃描電鏡圖片。圖2是由分子量為I. 8 kDa的枝化PEI和PLGA制備的包裹Bcl_2反義寡聚核苷酸的復合納米載體的掃描電鏡圖片。圖3是由分子量為1.8 kDa的枝化PEI和縮醛化α-環糊精制備的包裹TNF-a -siRNA的復合納米載體的掃描電鏡圖片。
具體實施例方式本發明以可降解有機材料為主要載體材料來設計能高效負載核酸類藥物的復合納米載體，通過其中引入不同分子量多聚胺一方面提高復合納米載體對反義核苷酸、siRNA和microRNA等的負載或包裹效率，促進內涵體/溶酶體逃逸；另一方面又不會增加載體系統的細胞毒性或組織損傷作用。不同于以往研究中使用的常規雙乳液法，其中不同分子量多聚胺與核酸類藥物形成的絡合物水溶液作為內水相，本發明設計的方法為將核酸類藥物作為內水相，而將不同分子量多聚胺溶于有機相中。以此改良方法制備的復合納米載體的優點如下1)可以更加有效地提高核酸類藥物的負載效率；2)核酸類藥物與不同分子量多聚胺締合形成的納米復合物能更為均勻的分布于復合納米載體中，有利于核酸類藥物的完全釋放和可控釋放；3)與純粹可降解納米粒相比，復合納米載體系統的轉染效率得到大幅度提高；4)使用少量不同分子量多聚胺即可達到理想的藥物負載，且最終轉染效率較高；5)使用少量不同分子量多聚胺能保證最終復合納米載體的安全性。更具體地說，本發明采取的措施如下首先將核酸類藥物溶于10-500 μ 水中得到內水相，其中核酸類藥物在內水相中的濃度為O. 00001-1000 nmol/μ I ;將可降解有機材料與不同分子量多聚胺溶解于O. 02-100 ml有機溶劑中得到有機相，其中可降解有機材料在有機相中的濃度為O. 5-5000 mg/ml,不同分子量多聚胺與可降解有機材料的質量比為
O.005 100-3 7 ;然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲作用下乳化于O. 1-150 ml聚こ烯醇的質量百分濃度為O. 001-10%的聚こ烯醇水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶齊U，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到本發明所述能高效負載核酸類藥物的復合納米載體。該復合納米載體為球形，平均數均粒徑為80-950 nm (圖1_3)。下面結合非限定性的實施例對本發明做詳細說明。實施例I首先將I nmol編碼β -半乳糖苷酶的pDNA溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg聚乳酸(PLA，分子量15 kDa)和O. 5 mg分子量800 Da的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于10 ml質量百分濃度為O. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶剤，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載PDNA的復合納米載體，其中PDNA的負載效率為92%。實施例2首先將O. 5 nmol Bcl_2反義寡核苷酸溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg聚丙交酷-こ交酯(PLGA，乳酸/こ醇酸摩爾比50 50,分子量20 kDa)和2. 5 mg分子量I. 8 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于20 ml質量百分濃度為1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡核苷酸的復合納米載體，其中寡核苷酸的負載效率為95%。實施例3首先將I nmol Bcl_2反義寡核苷酸溶于150 μ 水中得到內水相；50 mg聚丙交酷-こ交酷(PLGA，乳酸/こ醇酸摩爾比75 :25，分子量25 kDa)和5 mg分子量10 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml氯仿中得到有機相；然后在探頭超聲下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲作用下乳化于50 ml質量百分濃度為O. 8%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度80%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡核苷酸的復合納米載體，其中寡核苷酸的負載效率為94%。實施例4首先將O. 2 nmol腫瘤壞死因子(TNF) siRNA溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg聚ε -己內酯(PCL，分子量16 kDa)和2. 5 mg分子量25 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于Imlこ酸こ酯中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于15 ml質量百分濃度為2%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載TNF-siRNA的復合納米載體，其中siRNA的負載效率為93%。實施例5首先將I nmol腫瘤壞死因子(TNF)siRNA溶于200 μ 水中得到內水相；50 mg聚原酸酯(分子量32 kDa)和I. 25 mg分子量I. 2 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于100 ml質量百分濃度為1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載TNF-siRNA的復合納米載體，其中siRNA的負載效率為95%。實施例6首先將I nmol腫瘤壞死因子(TNF)siRNA溶于200 μ 水中得到內水相；50 mg聚原酸酯(分子量32 kDa)和I. 25 mg分子量I. 8 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于15 ml質量百分濃度為1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載TNF-siRNA的復合納米載體，其中siRNA的負載效率為95%。實施例7首先將5 nmol化學趨化因子受體2 (CCR-2) siRNA溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg縮醒化α -環糊精和2. 5 mg分子量I. 2 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于30 ml質量百分濃度為1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載CCR-2-siRNA的復合納 米載體，其中siRNA的負載效率為93%。體外細胞轉染表明最終復合納米系統的轉染效率為枝化聚こ烯亞胺(分子量25 kDa)的I. 3倍，為Lipofectamine 2000的I. 5倍；細胞毒性研究表明復合納米系統的半抑制濃度(IC50)分別為枝化聚こ烯亞胺(分子量25 kDa)和Lipofectamine 2000 的 100 倍和 10 倍。實施例8首先將I nmol化學趨化因子受體2 (CCR-2) siRNA溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg縮醒化β -環糊精和5 mg分子量10 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于25 ml質量百分濃度為I. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶剤，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載CCR-2-siRNA的復合納米載體，其中siRNA的負載效率為98%。體外細胞轉染表明最終復合納米系統的轉染效率為枝化聚こ烯亞胺(分子量25 kDa)的I. 8倍，為Lipofectamine 2000的I. 4倍；細胞毒性研究表明復合納米系統的半抑制濃度(IC50)分別為枝化聚こ烯亞胺(分子量25 kDa)和Lipofectamine 2000 的 100 倍和 10 倍。實施例9首先將I nmol化學趨化因子受體2 (CCR_2)siRNA溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化Y-環糊精和2. 5 mg精胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于25 ml質量百分濃度為I. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載CCR-2-siRNA的復合納米載體，其中siRNA的負載效率為80%。實施例10首先將10 nmol Bcl-2反義寡聚核苷酸溶于200 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化α-環糊精聚合物(分子量為8 kDa)和2. 5 mg亞精胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于30 ml質量百分濃度為2%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡聚核苷酸的復合納米載體，其中反義寡聚核苷酸的負載效率為82%。實施例11首先將2 nmol Bcl_2反義寡聚核苷酸溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化β-環糊精聚合物(分子量為15 kDa)和10 mg腐胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于25 ml質量百分濃度為I. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡聚核苷酸的復合納米載體，其中反義寡聚核苷酸的負載效率為86%。
實施例12首先將O. 5 nmol Bcl-2反義寡聚核苷酸溶于50 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化Y -環糊精聚合物(分子量為9 kDa)和2. 5 mg分子量為I. 8 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于O. 5 ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于15 ml質量百分濃度為O. 5%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡聚核苷酸的復合納米載體，其中反義寡聚核苷酸的負載效率為95%。實施例13首先將I nmol Bcl_2反義寡聚核苷酸溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化α -環糊精和2. 5 mg分子量為I. 2 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于20 ml質量百分濃度為1%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡聚核苷酸的復合納米載體，其中反義寡聚核苷酸的負載效率為98%。體外細胞轉染表明最終復合納米系統的轉染效率為枝化聚こ烯亞胺(分子量25 kDa)的I. 5倍，為Lipofectamine的2倍。實施例14首先將O. 5 nmol抑制化學趨化因子受體2 (CCR-2)的microRNA溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化α -環糊精和10 mg分子量為800 Da的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于20 ml質量百分濃度為I. 2%的聚こ烯醇(分子量8. 8kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶剤，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載microRNA的復合納米載體，其負載效率為97%。實施例15首先將0. 5 nmol抑制腫瘤壞死因子(TNF- α )的shRNA溶于100 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化β -環糊精和I mg分子量為I. 8 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于25 ml質量百分濃度為O. 8%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載shRNA的復合納米載體，其負載效率為91%。實施例16首先將O. 01 nmol抑制腫瘤壞死因子(TNF- α )的shRNA溶于20 μ 水中得到內水相；100 mg縮醛化α -環糊精和2. 5 mg分子量為I. 8 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于O. Iml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于I ml質量百分濃度為O. I %的聚こ烯醇(分子量50 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機 相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載shRNA的復合納米載體，其負載效率為96%。實施例17首先將500 nmol腫瘤壞死因子(TNF_a ) siRNA溶于30 μ 水中得到內水相；50mg聚ε -己內酯(PCL,分子量16 kDa)和14 mg分子量25 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于5 mlこ酸こ酯中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于25 ml質量百分濃度為O. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載TNF-siRNA的復合納米載體，其中siRNA的負載效率為89%。實施例18首先將4000 nmol化學趨化因子受體2 (CCR-2) siRNA溶于50 μ 水中得到內水相；50 mg聚乳酸(分子量為50 kDa)和2. 5 mg分子量30 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于10ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于50 ml質量百分濃度為1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶剤，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載CCR-2-siRNA的復合納米載體，其中siRNA的負載效率為90%。實施例19首先將8000 nmol Bcl-2反義寡聚核苷酸溶于450 μ 水中得到內水相；50 mg聚原酸酯(分子量為25 kDa)和16 mg亞精胺溶解于50 ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于120ml質量百分濃度為2%的聚こ烯醇(分子量60 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡聚核苷酸的復合納米載體，其中反義寡聚核苷酸的負載效率為87%。實施例20
首先將4500 nmol Bcl-2反義寡聚核苷酸溶于300 μ 水中得到內水相；50 mg縮醛化α-環糊精和2. 5 mg分子量為45 kDa的枝化聚こ烯亞胺溶解于50 ml ニ氯甲烷中得到有機相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲下乳化于150 ml質量百分濃度為7%的聚こ烯醇(分子量80 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水復乳；所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到負載Bcl-2反義寡聚核苷酸的復合納米載體，其中反義寡聚核苷酸的負載效率為94%。本發明所述的核酸類藥物是對許多重大疾病發揮治療作用的一大類活性物質。在上述實施例中，所采用的核酸類藥物為編碼β -半乳糖苷酶的pDNA、Bcl-2反義寡聚核苷酸、腫瘤壞死因子(TNF) siRNA、化學趨化因子受體2 (CCR-2) siRNA、抑制化學趨化因子受體2 (CCR-2)的microRNA或抑制腫瘤壞死因子(TNF-α )的shRNA。但是這些核酸類藥物并不限制本發明的保護范圍，本領域普通技術人員可根據所需治療疾病的不同，選擇合適的核酸類藥物。例如，所需治療的疾病是腫瘤，則所述的核酸類藥物是對于治療腫瘤有用的 藥物；而如所需治療的疾病為心血管病，則所述的核酸類藥物是對于心血管疾病治療有用的藥物。
權利要求
1.一種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體，其特征在于所述復合納米載體由可降解有機材料和不同分子量多聚胺組成，其中不同分子量多聚胺與可降解有機材料的質量比為O. 005 :100-3 7 ;所述復合納米載體為球形，粒徑為80-950 nm，核酸類藥物均勻分布于其中。
2.根據權利要求I所述的ー種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體，其特征在于所述可降解有機材料選自聚乳酸、聚丙交酯-こ交酷、聚ε -己內酷、聚原酸酷、縮醛化α-環糊精、縮醛化環糊精、縮醛化Y-環糊精、縮醛化α-環糊精聚合物或縮醛化 環糊精聚合物；其中聚合物類可降解有機材料的分子量為I -100 kDa。
3.根據權利要求I所述的ー種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體，其特征在于所述不同分子量多聚胺選自低分子量多聚胺或聚こ烯亞胺；其中聚こ烯亞胺的分子量為O. 6-50 kDa ο
4.根據權利要求3所述的ー種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體，其特征在于所述低分子量多聚胺選自亞精胺、精胺或腐胺。
5.—種權利要求I所述的能高效負載核酸類藥物的復合納米載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟首先將核酸類藥物溶于水中得到內水相，將可降解有機材料與不同分子量多聚胺溶解在有機溶劑中得到有機相，將聚こ烯醇的水溶液作為外水相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲作用下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶剤，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即得能高效負載核酸類藥物的復合納米載體。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述有機溶劑選自ニ氯甲烷、氯仿或こ酸こ酷。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述核酸類藥物在內水相中的濃度為 O. 00001 -1000 nmol/μ I。
8.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述可降解有機材料在有機相中的濃度為 O. 5 -5000 mg/ml ο
9.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述內水相和有機相的體積比為O. 005 1-0. 5:1。
10.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在干所述有機相和外水相的體積比為O.005 1-0. 5:1。
11.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述聚こ烯醇在外水相中的質量百分濃度為O. 001-10%，其中聚こ烯醇的分子量為I -100 kDa，摩爾水解度為60-90%。
全文摘要
本發明涉及一種能高效負載核酸類藥物的復合納米載體及其制備方法。該復合納米載體由可降解有機材料和不同分子量多聚胺組成，其中不同分子量多聚胺與可降解有機材料的質量比為0.005100-37；所述復合納米載體為球形，粒徑為80-950 nm，核酸類藥物均勻分布于其中。制備方法為，首先將核酸類藥物溶于水中得到內水相，將可降解有機材料與不同分子量多聚胺溶解在有機溶劑中得到有機相，將聚乙烯醇的水溶液作為外水相；然后在探頭超聲作用下將內水相乳化于有機相中形成油包水初乳，該初乳在探頭超聲作用下乳化于外水相中得到水包油包水復乳，所得復乳在室溫下磁力攪拌以揮發去除有機相的有機溶劑，待納米微粒固化后，離心分離，用雙蒸水洗滌，即可得到能高效負載核酸類藥物的復合納米載體。
文檔編號A61K47/34GK102861341SQ20121037657
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者張建祥, 李曉輝, 竇寅, 李淑慧 申請人:張建祥