一種殼聚糖-抗生素共價復合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種殼聚糖-抗生素共價復合物及其制備方法和應用，所述制備方法包括（1）取殼聚糖和抗生素，以摩爾比例為1:0.1～1:10混合，溶于水中，加入NaCNBH3，避光攪拌，0℃～90℃反應0.5～72小時；（2）將所得混合溶液透析1～5天；（3）將所得透析液干燥，即得。制備所述殼聚糖-抗生素共價復合物的原料易得，合成方法簡便；該共價復合物對已經形成的細菌生物膜具有較強的破壞作用，殺菌范圍廣，有效成分明確，對生物膜的形成具有良好的抑制作用。
【專利說明】一種殼聚糖-抗生素共價復合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥制劑【技術領域】，具體涉及一種殼聚糖-抗生素共價復合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]生物膜(biofilms，BF)是微生物細胞(如細菌、真菌、原蟲)及其產生的細胞外大分子多聚物所形成的一種特殊群落，是高度組織化的多細胞結構。細菌生物膜是細菌在生長過程中為適應生存環境而吸附于生命或非生命物體表面形成的一種生長方式，由細菌和自身分泌的胞外基質組成。研究人員將這些能形成這類生物膜的細菌稱為生物膜細菌(BF細菌)。BF在自然界、某些工業環境(如輸水系統、食品加工、航運等領域)、人和動物體內中都可見到細菌生物膜的影響。此外，BF與多種人體相關性感染性疾病的關系也非常密切。當細菌以BF形式存在時耐藥性明顯增強(10~1000倍)，對抗生素變得不敏感，誘導耐藥性產生；還可以抵抗宿主的防御體系，在發病前生長于牙齒、牙齦、皮膚、肺、尿道及其他器官的表面達數月甚至數年，造成頑固性感染，給臨床治療帶來嚴重影響。據估計，65%的人類感染與生物膜有關。BF的耐藥機制不同于浮游菌，有效濃度的抗菌藥物能迅速殺死浮游生長的細菌和BF表面的細菌，但對BF深處的細菌卻難以有效殺滅。由于傳統的抗生素如鏈霉素、慶大霉素、青霉素對細菌BF引起的感染療效欠佳，因此，臨床上急需尋找能夠殺滅BF深處細菌的藥物。
[0003]殼聚糖(chitosan)是由自然界廣泛存在的幾丁質經過脫乙酰作用得到的復合物，在醫藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫學工程中廣泛應用。鏈霉素(streptomycin)是繼青霉素后第二個生產并用于臨床的一種氨基葡萄糖型抗生素，鏈霉素在臨床上的應用非常廣泛。

【發明內容】

[0004]因此，本發明所要解決的技術問題是針對臨床上缺乏能夠有效殺滅生物膜深處細菌的藥物，傳統抗生素對細菌生物膜引起的感染療效欠佳，并且不能阻止細菌生物膜形成的問題，提供了一種殼聚糖-抗生素共價復合物及其制備方法和應用。
[0005]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一為:一種殼聚糖-抗生素共價復合物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0006](1I)制備殼聚糖和抗生素水溶液，將殼聚糖和抗生素按照摩爾比例為1:0.1~1:10混合，加入NaCNBH3，避光攪拌，0°C~90°C反應0.5~72小時；
[0007](2)將步驟(1)所得的水溶液移入截留分子量為1000~14000的透析袋中，透析1~5天，得到透析液；
[0008](3)將步驟(2)所得的透析液干燥，即得。
[0009]其中步驟(1)所述殼聚糖為本領域常規殼聚糖。所述殼聚糖(chitosan)是由自然界廣泛存在的幾丁質(chitin)經過脫乙酰作用得到的，化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。其中所述抗生素為本領域常規的抗生素。所述抗生素較佳地為氨基糖苷類抗生素。所述氨基糖苷抗生素是由氨基糖與氨基環醇通過氧橋連接而成的糖苷類抗生素。所述抗生素較佳地為鏈霉素，卡那霉素或慶大霉素。本發明所述抗生素優選地為鏈霉素。
[0010]其中步驟(1)所述殼聚糖和抗生素水溶液混合形成混合液，所述殼聚糖和抗生素的摩爾比較佳地為1:0.1~1:10，更佳地為1:0.5~1:6，最佳地為1:0.5。所述反應的時間較佳地為0.5~72小時，更佳地為10~48小時，最佳地為24小時。所述反應的溫度較佳地為0°C~90°C，更佳地為15°C~30°C，最佳地為20°C。
[0011 ] 其中步驟(1)所述NaCNBH3的添加量較佳地為所述抗生素含量的30%~50%，添加量最佳地為30%，所述百分比為質量百分比。
[0012]其中步驟(2)所述的透析為本領域常規透析方法。所述透析是一種穿過膜的選擇性擴散過程，可用于分離分子量大小不同的溶質，低于膜所截留閾值分子量的物質可擴散穿過膜，高于膜截留閾值分子量的物質則被保留在半透膜的另一側。其中所述透析袋為本領域常規透析袋。所述透析袋的截留分子量較佳地為1000~14000，更佳地為3000~5000，截留分子量最佳地為3500。其中所述透析的時間較佳地為2~5天，更佳地為2~3天，透析時間最佳地為2天。
[0013]其中步驟(3)所述的干燥為本領域常規干燥方式。所述干燥較佳地為真空冷凍干燥、真空干燥、噴霧干燥、烘干或紅外干燥，最佳地為真空冷凍干燥。所述真空冷凍干燥的參數較佳地為:溫度_35°C~_45°C，真空度20~30Pa，時間36~48小時。
[0014]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二為:如上所述的制備方法制備所得的殼聚糖-抗生素共價復合物。
[0015]所述殼聚糖-抗生·素共價復合物中殼聚糖和抗生素的摩爾比較佳地為1:0.1~1:10，更佳地為1:0.5~1:6，最佳地為1:0.5。
[0016]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之三為:如上所述的殼聚糖-抗生素共價復合物在制備抗感染藥物中的用途。
[0017]本發明所述用途較佳地是指將殼聚糖-抗生素共價復合物作為活性成分，與藥學上可接受的輔料制成各種劑型的抗感染藥物。其中所述藥學上可接受的輔料是本領域常規使用的輔料。所述藥物輔料是指生產藥品和調配處方時所用的賦形劑與附加劑。
[0018]其中所述抗感染藥物更佳地為抗細菌感染類藥物。所述細菌為本領域常規致病菌。所述細菌較佳地為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。其中革蘭氏陽性菌較佳地為單增李斯特菌，其中革蘭氏陰性菌較佳地為金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌。
[0019]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0020]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0021]本發明的積極進步效果在于:制備本發明所述殼聚糖-抗生素共價復合物的原料易得，合成方法簡便易行；經微生物試驗證明，該殼聚糖-抗生素共價復合物對已經形成的細菌生物膜具有較強的破壞作用，殺菌范圍廣，有效成分明確；該復合物對生物膜的形成具有良好的抑制作用。同時，所述殼聚糖-抗生素共價復合物能夠有效降低細菌以生物膜形式存在時產生的耐藥性，提高細菌對傳統抗生素的敏感性，降低傳統抗生素的使用量。【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為殼聚糖-鏈霉素共價復合物分子量測定圖譜。
[0023]圖2為殼聚糖-鏈霉素共價復合物紅外圖譜。
[0024]圖3為殼聚糖-鏈霉素共價復合物的核磁共振C譜。
[0025]圖4為殼聚糖-鏈霉素共價復合物的核磁共振H譜。
[0026]圖5為殼聚糖-鏈霉素共價復合物對細菌生物膜的破壞作用效果圖；注:對照為不加任何藥的空白對照，L為鏈霉素，CS為殼聚糖，L+CS為鏈霉素與殼聚糖的混合物。A代表單增李斯特細菌；B代表金黃色葡萄球菌；C代表銅綠桿菌。 [0027]圖6為殼聚糖-鏈霉素共價復合物對生物膜內細菌的抑制作用效果圖；注:對照為不加任何藥的空白對照，L為鏈霉素，CS為殼聚糖，L+CS為鏈霉素與殼聚糖的混合物，A代表單增李斯特細菌；B代表金黃色葡萄球菌；C代表銅綠桿菌。
[0028]圖7為殼聚糖-鏈霉素共價復合物對生物膜內細菌的抑制作用效果圖；注:對照為不加任何藥的空白對照，L為鏈霉素，CS為殼聚糖，L+CS為鏈霉素與殼聚糖的混合物。A代表單增李斯特細菌；B代表金黃色葡萄球菌；C代表銅綠桿菌。
[0029]圖8為殼聚糖-鏈霉素共價復合物在生物膜形成過程中的抑菌效果圖；注:對照為不加任何藥的空白對照，L為鏈霉素，CS為殼聚糖，L+CS為鏈霉素與殼聚糖的混合物。A代表單增李斯特細菌；B代表金黃色葡萄球菌；C代表銅綠桿菌。
[0030]圖9為殼聚糖-鏈霉素共價復合物在生物膜形成過程中的抑菌效果圖；注:對照為不加任何藥的空白對照，L為鏈霉素，CS為殼聚糖，L+CS為鏈霉素與殼聚糖的混合物。A代表單增李斯特細菌；B代表金黃色葡萄球菌；C代表銅綠桿菌。
【具體實施方式】
[0031]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。本發明所用試劑和原料均市售可得。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0032]實施例1
[0033]取殼聚糖50mg,鏈霉素45.3mg分別溶于20ml去離子水中，并加入0.372g氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)，置于黑暗處15°C條件下300rpm，攪拌10h，將溶液加入攔截分子量為3000的透析袋，在去離子水中透析2天，真空度20pa，_35°C冷凍干燥48小時，即得摩爾比1:0.1的殼聚糖-鏈霉素復合物85.8mg。經HPLC凝膠分析系統(Waters公司生產)測定，(測試溫度25°C，流動相:3mmol乙酸鈉，流動相流速0.5ml/min.標準品采用葡聚糖)，殼聚糖-鏈霉素共價復合物的相對分子量為7026Da，鑒定結果如圖1所示。
[0034]實施例2
[0035]取殼聚糖lOOmg，鏈霉素452.5mg分別溶于30ml去離子水中，并加入0.744gNaCNBH3置于黑暗處20°C，300rpm,攪拌24h，將溶液加入攔截分子量為3500的透析袋，在去離子水中透析2天，真空度30Pa，-45°C冷凍干燥48小時，即得摩爾比1:0.5的殼聚糖-鏈霉素共價復合物497.3mg。所得殼聚糖-抗生素共價復合物紅外光譜采用Bruker公司生產的紅外儀檢測，采用溴化鉀壓片法。(董炎明；王勉；吳玉松；阮永紅.纖維素科學技術6，9(2)，42-55(2001))。所得殼聚糖_鏈霉素共價復合物紅外鑒定圖譜如圖2所示，其中2880~2900CHT1出現的吸收峰為鏈霉素上殘余的醛基，1650cm-1是N_H，1360"l250cm_1是C-N, 1153"l031cm_1 為 C-0。
[0036]實施例3
[0037]取殼聚糖150mg，鏈霉素2.714g分別溶于40ml去離子水中，并加入1.16gNaCNBH3,置于黑暗處25°C，300rpm,攪拌36h，將溶液加入攔截分子量為4000的透析袋，在去離子水中透析3天。在真空度20Pa，-45 V冷凍干燥48小時，即得摩爾比1:2的殼聚糖-鏈霉素共價復合物2.55g。將所得殼聚糖-抗生素共價復合物溶于氘代水，采用Bruker公司生產的核磁共振儀檢測。所得殼聚糖-鏈霉素共價復合物的核磁共振C譜如圖3所示，其中IOppm是甲基上的碳原子,30ppm是亞甲基，6(Tl00ppm之間是糖環，160ppm是鏈霉素上殘余的醛基。
[0038]實施例4
[0039]取殼聚糖50mg，鏈霉素1.81g分別溶于20ml去離子水中，并加入0.372g NaCNBH3,置于黑暗處30°C條件下300rpm，攪拌48h，將溶液加入攔截分子量為4500的透析袋，在去離子水中透析4天，真空度30Pa，_45°C冷凍干燥48小時，即得摩爾比1:4的殼聚糖-鏈霉素共價復合物1.66g。將所得殼聚糖-抗生素共價復合物溶于氘代水，采用Bruker公司生產的核磁共振儀檢測。所述殼聚糖-鏈霉素共價復合物的核磁共振H譜如圖4所示，其中
1.0ppm是甲基,2.0ppm是殼聚糖上未去乙酰化的羰基,3.(T4.0ppm是糖環,4.5^5.0ppm是水,5.0^5.5ppm是鏈霉素上的頭碳上的氫。
[0040]實施例5
[0041]取殼聚糖50mg，鏈霉素2.72g分別溶于20ml去離子水中，并加入0.372g NaCNBH3,置于黑暗處25°C，300rpm，攪拌48h`，將溶液加入攔截分子量為5000的透析袋，在去離子水中透析5天，真空度30Pa，-40°C冷凍干燥36小時，即得摩爾比1:6的殼聚糖-鏈霉素共價復合物2.51g。
[0042]實施例6
[0043]取殼聚糖150mg，鏈霉素13.75g分別溶于20ml去離子水中，并加入6.785gNaCNBH3，置于黑暗處0°C，300rpm，攪拌72h，將溶液加入攔截分子量為14000的透析袋，在去離子水中透析5天，烘干36小時，即得摩爾比1:10的殼聚糖-鏈霉素共價復合物12.28g。
[0044]實施例1
[0045]取殼聚糖50mg，卡那霉素58.3mg分別溶于20ml去離子水中，并加入17.49mg氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)，置于黑暗處90°C條件下300rpm，攪拌72h，將溶液加入攔截分子量為14000的透析袋，在去離子水中透析I天，紅外干燥48小時，即得摩爾比1:0.1的殼聚糖-卡那霉素復合物85.8mg0
[0046]實施例8
[0047]取殼聚糖50mg，鏈霉素2.72g分別溶于20ml去離子水中，并加入0.816g NaCNBH3,置于黑暗處25°C，300rpm，攪拌48h，將溶液加入攔截分子量為5000的透析袋，在去離子水中透析5天，噴霧干燥，即得摩爾比1:6的殼聚糖-鏈霉素共價復合物2.51g。
[0048]實施例9
[0049]取殼聚糖150mg，鏈霉素2.714g分別溶于40ml去離子水中，并加入0.81gNaCNBH3，置于黑暗處60°C，300rpm，攪拌0.5h，將溶液加入攔截分子量為1000的透析袋，在去離子水中透析I天。所得透析液在真空度20Pa，干燥48小時，即得摩爾比1:2的殼聚糖-鏈霉素共價復合物2.55g。
[0050]效果實施例1殼聚糖-鏈霉素共價復合物對細菌生物膜的破壞作用
[0051]微生物:單增李斯特菌CMCC 54004、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、銅綠假單胞菌ATCC9027。
[0052]藥物:實施例1-9制備所得殼聚糖-鏈霉素共價復合物，藥物對照殼聚糖(青島云宙生物科技有限公司)、鏈霉素(阿拉丁)。
[0053]試驗方法:在96孔培養板各孔中加0.1ml含5X IO8~IO9的細菌，放入37°C培養箱中培養24小時，讓細菌帖壁形成生物膜。吸去培養液，用PBS (0.lmol/L)洗滌三次，每孔加90iU LB培養基和IOiU藥物。藥物為殼聚糖-鏈霉素共價復合物(其中殼聚糖和鏈霉素的摩爾比分別為1:0.1,1:0.5，1:2，1:4，1:6，1:10)，殼聚糖(CS)，鏈霉素(L)，以及殼聚糖和鏈霉素的混合物(CS+L)(其中殼聚糖和鏈霉素質量比為1:1)，所述藥物濃度均為
0.25mg/ml。每組平行6孔。置于37°C培養箱中培養24h。吸去藥物，用PBS(0.lmol/L)小心洗滌三次，每孔加0.1ml 99%甲醇溶液固定細菌15分鐘。吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml
0.1%結晶紫染液，室溫中放置20分鐘。輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37°C烘干。測定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脫色，充分振蕩后在595nm處測定光吸收度。試驗重復三次。
[0054]三次重復試驗結果表明，殼聚糖-鏈霉素共價復合物對上述三種細菌形成的生物膜具有顯著的抑制、破壞作用，并且在24h內都具有顯著的效果，其結果如圖5 (A、B、C)所示。
[0055]效果實施例2殼聚糖-鏈霉素共價復合物對生物膜深處細菌的抑制作用
[0056]菌株:同效果實施例1。
[0057]藥物:同效果實施例1。
[0058]試驗方法:在96孔培養板各孔中加0.1ml含5X IO8~IO9的細菌，放入37°C培養箱中培養24小時，讓細菌帖壁形成生物膜。吸去培養液，用PBS(0.lmol/L)小心洗滌三次，每孔加90 u I培養基和10 u I不同的藥物(同效果實施例1 )，每組平行6孔。置于37°C培養箱中培養24h。吸去藥物，用PBS (0.lmol/L)小心洗滌三次，每孔加90 u I培養基和IOu IMTT溶液(5mg/ml用PBS配制，0.22 u m過濾)，繼續孵育3h，終止培養，3500rmp離心5min，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加100 ill DMS0，振蕩lOmin，使結晶物充分融解。490nm波長下，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。試驗重復三次。
[0059]三次重復試驗結果表明，在24h內，殼聚糖-鏈霉素共價復合物對生物膜深處的上述三種細菌具有顯著的抑制、殺死作用，其結果如圖6 (A、B、C)所示。
[0060]效果實施例3殼聚糖-鏈霉素共價復合物對生物膜深處細菌的抑制作用
[0061]菌株:同效果實施例1。
[0062]藥物:同效果實施例1。
[0063]在96孔培養板各孔中加0.1ml含5X IO8~IO9的細菌，放入37°C培養箱中培養24小時，讓細菌帖壁形成生物膜。吸去培養液，用PBS小心洗滌三次，每孔加90 u I培養基和IOiIl藥物(同效果實施例1)，每組平行6孔。置于37°C培養箱中培養24h。吸去藥物，用PBS小心洗滌三次，加入0.1ml0.2%Triton X-100裂解Ih后，稀釋點板、計數。
[0064]試驗結果表明，不同摩爾比例的殼聚糖-鏈霉素共價復合物在24h內對生物膜深處的上述三種細菌具有顯著的抑菌、殺菌效果，其結果如圖7 (A、B、C )所示。
[0065]效果實施例4殼聚糖-鏈霉素共價復合物在生物膜形成過程中的殺菌作用
[0066]菌株:同效果實施例1。
[0067]藥物:同效果實施例1。
[0068]試驗方法:在96孔培養板各孔中加90 ill含5X IO8~IO9的細菌的溶液，同時加AlOul不同的藥物(同效果實施例1)，每組平行6孔，放入37°C培養箱中培養24小時。吸去藥物，用PBS (0.lmol/L)小心洗滌三次，每孔加90 u I培養基和10 u I MTT溶液(濃度為5mg/ml,用PBS配制,0.22 u m過濾),繼續孵育3h,終止培養,3500rmp離心5min,小心吸棄孔內培養上清液，每孔加100 ill DMS0，振蕩lOmin，使結晶物充分融解。490nm波長下，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。試驗重復三次。
[0069]試驗結果表明，殼聚糖-鏈霉素共價復合物在所述三種細菌生物膜形成過程的24h內，具有顯著的抑菌和殺菌作用，其結果如圖8 (A、B、C)所示。其中殼聚糖和鏈霉素摩爾比為1: 0.5的殼聚糖-鏈霉素共價復合物殺菌效果較好，鏈霉素的使用量較低。
[0070]效果實施例5殼聚糖-鏈霉素共價復合物在生物膜形成過程中的殺菌作用
[0071]菌株:同效果實施例1。
·[0072]藥物:同效果實施例1。
[0073]試驗方法:在96孔培養板各孔中加90 ill含5X IO8~IO9的細菌，同時加入10 ill不同的藥物(同效果實施例1)，每組平行6孔，放入37°C培養箱中培養24小時。吸去96孔板內液體，用PBS (0.lmol/L)小心洗滌三次，加入0.1ml 0.2%Triton X-100裂解Ih后，稀釋點板、計數。
[0074]試驗結果表明，殼聚糖-鏈霉素共價復合物在上述三種細菌生物膜形成過程的24h內，具有顯著的抑菌和殺菌作用，其結果如圖9 (A、B、C)所示。其中殼聚糖和鏈霉素摩爾比為1: 0.5的殼聚糖-鏈霉素共價復合物殺菌效果好，鏈霉素的使用量較低。
[0075]應理解，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種殼聚糖-抗生素共價復合物的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟: (1)制備殼聚糖和抗生素水溶液，將殼聚糖和抗生素按照摩爾比例為1:0.1~1:10混合，加入NaCNBH3，避光攪拌，(TC~90°C反應0.5~72小時； (2)將步驟(1)所得的水溶液移入截留分子量為1000~14000的透析袋中，透析I~5天，得到透析液； (3)將步驟(2)所得的透析液干燥，即得。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述抗生素為慶大霉素、鏈霉素或卡那霉素。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述抗生素為鏈霉素。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述殼聚糖和抗生素的摩爾比例為1:0.5~1:6。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述NaCNBH3的添加量是所述抗生素含量的30%~50%,所述百分比為質量百分比。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述反應的溫度為15°C~30°C，所述反應的時間為10~48小時。
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述透析袋截留分子量為3000~5000，所述透析的時間為2~5天。`
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述干燥的方式為真空冷凍干燥、真空干燥、噴霧干燥、烘干或紅外干燥。
9.一種如權利要求1~8任一項所述的制備方法制備所得的殼聚糖-抗生素共價復合物。
10.如權利要求9所述的殼聚糖-抗生素共價復合物在制備抗感染藥物中的用途。
【文檔編號】A61P31/04GK103784968SQ201210433695
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月2日 優先權日:2012年11月2日
【發明者】段金友, 張阿敏, 崔國庭, 母海缽, 張武霞, 張琳, 牛紅, 王清潔, 董冬旗 申請人:西北農林科技大學