專利名稱：一種白血病單鏈抗體庫及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬基因工程，涉及一種全人源白血病單鏈抗體庫和其構建方法，及其在制備白血病抗體藥物中的應用。
背景技術：
自K6hler和Milstein創立淋巴細胞雜交瘤技術至今,單克隆抗體在腫瘤的診斷和治療領域得到了廣泛的應用。第一代應用于人類疾病治療的主要是鼠源性單抗，但是鼠單抗的主要缺點是引起人體免疫反應，人體產生的人抗鼠抗體使其很快清除，不能很好的發揮其生物學功能，因此在臨床應用中受到限制；第二代抗體是在鼠單抗基礎上，通過基因重組形成了嵌合式抗體和人源化抗體，但兩者應用于人體依舊存在免疫原性問題；目前，人們正致力于第三代抗體即全人源性單克隆抗體的研究，主要采用噬菌體展示技術(phagedisplay)結合基因工程技術，由此產生的多株人源性單克隆抗體已經成功地應用于臨床疾病的治療。特別是在腫瘤治療領域，迄今為止，美國FDA已經批準了 12種單克隆抗體藥物上市，成為全球生物制藥領域的熱點。噬菌體展示技術最初由Smith于1985年創建，噬菌體作為一種表達載體將多肽展示于病毒外殼?；驹硎菍⑼庠碊NA插入到絲狀噬菌體的基因組DNA中，使外源DNA編碼的肽段得以表達并伸展到噬菌體表面。通過采用與固定配體相互作用的親和篩選方法，可以富集得到能表達某種特異肽序列的曬菌體。曬菌體(口1^86)和卩遼菌粒(口1^861]11(1)都可作為表達載體來展示抗體或其他蛋白。噬菌粒攜帶表達gin外殼的基因、克隆位點及噬菌體包裝信號，并由輔助噬菌體(如M13K07或VCS-M13)提供完成包裝所需的結構蛋白。含有完整噬菌體基因組的絲狀噬菌體常用來構建肽庫，而噬菌粒能夠展示大量重組蛋白，更易于產生可溶性蛋白，同時自身不易受異源基因影響，因此在噬菌體抗體庫構建中占據主導地位?？贵w片段是首次在曬菌體表面成功展示的蛋白質。1990年，McCafferty等采用PCR方法擴增出完整的抗體可變區基因，將多樣性可變區基因組裝到表達載體內，轉化宿主細胞，并最終表達到噬菌體表面，從而得到多樣性噬菌體抗體集合，即噬菌體抗體庫。噬菌體展示抗體技術可以制備全人源的抗體，是將抗體基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，從而使異源分子展示于噬菌體表面。主要特點是將特定的分子的基因型和表達型同時出現在一個噬菌體顆粒內，通過DNA測序可以獲得特定展示抗體片段的基因序列信息，并可用特定的靶抗原篩選出特異性的噬菌體抗體；在此基礎上，可以通過基因工程的方法，在大腸桿菌表達可以得到大量表達的抗體。噬菌體抗體庫技術模擬了人類B細胞的分化成熟過程，首先通過分子生物學手段將人類抗體的重鏈和輕鏈等功能基因連接起來，插入噬菌體載體上，使其展示在噬菌體表面。目前，最受關注的卩遼菌體展示的抗體分子，主要包括抗體結合片段(fragment antigenbinding, Fab)、單鏈抗體(single-chain variable fragment, scFv)等。相對于完整的抗體分子，Fab和scFv等小分子片段結構簡單(不存在Fe段)，組織穿透率高，并且能夠在原核生物中高效表達。其中scFv是目前報導最多的一種小分子抗體，是由抗體識別抗原的可變區Fv段組成。scFv由重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)通過連接區(linker)連接而成。所加的linker很重要,必須不影響scFv的構象。將scFv基因克隆在絲狀曬菌體載體pill基因先導序列和PlII基因之間，以融合蛋白的形式被導入細菌膜間隙，并組裝成scFv，在加入輔助噬菌體M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表達在噬菌體表面。pCANTAB_5E載體的特點是，在scFv基因后面含有一段編碼Tag尾肽(E-Tag)的序列，在E-Tag后面有一個琥珀(Amber)終止密碼，位于scFv基因與pill基因之間，在抑制性細菌TGl中，這種琥珀密碼子只有20%有效，所以在蛋白翻譯過程中可以被通讀而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此終止子被識別，同時scFv基因在pill基因前終止，形成獨立的抗體蛋白，滯留于細胞膜間隙，并在長時間培養后釋放于培養液中，形成可溶性表達。再用特定的腫瘤相關抗原，通過“吸附-洗脫-擴增”的淘篩過程(panning)，可篩選出特異性單鏈抗體
發明內容
本發明目的是提供一種白血病單鏈抗體庫，即噬菌體單鏈抗體庫，含有全套人類抗體重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL(包括V K和VX)，及中間連接區linker序列為(GGGGS)3，有完整的抗原結合部位，以噬菌粒pCANTAB-5E為載體，庫容達到I. 5X 109。經DNA序列分析后證明其多樣性良好，并且可以通過感染宿主(大腸細菌TGl)進行大量擴增和再生。利用特定的白血病細胞的靶抗原，可以通過噬菌體展示的方法，方便地篩選出白血病特異的單鏈抗體，進而用于白血病的靶向治療。本發明的另一個目的是提供一種白血病單鏈抗體庫的構建方法，通過以下技術方案實現(I)總RNA提取和cDNA的合成取白血病患者的血液，分離淋巴細胞，用裂解液裂解淋巴細胞，提取細胞總RNA，經逆轉錄PCR (RT-PCR)逆轉錄為cDNA。這一步中，我們直接采用人類的淋巴細胞作為抗體基因的來源，可以獲得全人源的單鏈抗體，可以避免其它動物來源抗體作為藥物在人類使用中的免疫原性和過敏反應；同時，因為采用了多種白血病患者的樣本，提高了單鏈抗體庫的多樣性。(2)用PCR方法擴增抗體重鏈和輕鏈可變區基因根據人類抗體基因序列，分別設計PCR擴增抗體重鏈、輕鏈可變區所需的特定引物，共32條，引物序列如SEQ ID NO. 1-32所示；以步驟(I)獲得的cDNA為模板，用PCR方法擴增可變區基因VH和VL (包括V k和V入)。這一步中，我們設計的引物包含了不同免疫球蛋白家族的抗體類型，使之可以克隆人類全套VH和VL基因。(3)單鏈抗體(SCFv)基因片段的組裝和全長擴增設計含有由四個甘氨酸和一個絲氨酸組成的重復3次的連接肽(linker)序列和酶切位點SfiI、NotI的引物,所述連接肽和酶切位點SfiI、NotI的引物序列如SEQ ID NO. 33-64所示，在上述擴增的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區基因的基礎上，再經重疊PCR (SOE-PCR)獲得scFv基因。在這一步中，我們使用的linker序列很重要，其結構不會影響scFv的構象，有利于其活性發揮。(4)重組噬菌粒的構建分別用SfiI、NotI雙酶切scFv基因片段，將其插入噬菌粒載體PCANTAB-5E，構建重組噬菌粒(見圖1)，轉化感受態E. coli TG1，經輔助噬菌體M13K07超感染，獲得單次的噬菌體抗體庫；經重復轉化后，獲得全人源白血病單鏈抗體庫(噬菌體單鏈抗體庫)，庫容達到1.5X109。在這一步中，我們采用了重復轉化的策略，即制備足夠量的重組噬菌粒，經過100多次的轉化E. coli TG，并采用電轉化的方式大大提高轉化的效率，得到較大庫容量的單鏈抗體庫。(5)單鏈抗體庫的多樣性分析隨機挑取多個單克隆菌，測定插入區scFv基因的DNA序列，經ClustaIW序列比對軟件分析其序列的相似性，判斷單鏈抗體庫的多樣性分析；證明其多樣性良好。本發明的再一個目的是提供所述全人源白血病單鏈抗體庫在在制備白血病抗體藥物中的應用，通過以下步驟實現用白血病相關抗原(如⑶33胞外區蛋白⑶33-E⑶)作為靶抗原，用噬菌體展示的方法，篩選上述全人源白血病單鏈抗體庫，經過四輪“吸附-洗脫-擴增”的淘篩過程，篩選出抗白血病的特異性單鏈抗體，制備白血病抗體藥物。經免疫熒光法證明，篩選出來的單鏈抗體可以與CD33陽性的白血病細胞特異結合，并能有效地抑制CD33陽性的白血病細胞的生長，從而可以用于白血病的靶向治療。 總之，本發明構建了一種獨特的全人源白血病單鏈抗體庫，可以用于篩選與白血病細胞特異結合的單鏈抗體，這類特異識別和結合腫瘤細胞的單鏈抗體本身或者經過結構改造后，可作為靶向藥物用于白血病的治療。本發明的特點是(I)本發明提供的全人源白血病單鏈抗體庫，庫容量大，多樣性良好；以噬菌粒PCANTAB-5E為載體，包含全套人類單鏈抗體的組合；單鏈抗體由重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL通過連接肽(GGGGS) 3連接而成，且含有完整的抗原結合部位。(2)本發明提供的構建全人源白血病單鏈抗體庫的技術，從白血病人血液出發，設計32條特異的引物，主要利用RT-PCR、SOE-PCR等分子生物學技術結合噬菌體展示技術，通過重復電轉化，可以獲得全人源單鏈抗體庫；技術可操作性強，庫容量大。(3)本發明的全人源白血病單鏈抗體庫，因為以噬菌粒為載體，通過感染大腸桿菌而擴增并將單鏈抗體展示在噬菌體表面，從而可以用特定的白血病相關抗原作為靶標，可方便地篩選出對白血病特異的全人源單鏈抗體，這些全人源單鏈抗體可作為靶向藥物，用于白血病的治療。


圖I、重組載體pCANTAB-5E的構建圖。圖2、總RNA電泳檢測結果。圖3、PCR擴增重鏈可變區VH基因。圖4、PCR擴增輕鏈可變區VX基因。圖5、PCR擴增輕鏈可變區Vk基因。圖6、PCR 二次擴增輕鏈可變區VH基因。圖7、PCR 二次擴增重鏈可變區V A基因。圖8、PCR 二次擴增輕鏈可變區V K基因。圖9、SOE-PCR 擴增 scFv 基因。圖10、細胞免疫熒光分析結果。
圖11、單鏈抗體對白血病細胞的特異殺傷作用。
具體實施例方式本發明結合以下實施例及附圖作進一步說明。實施例I :白血病人淋巴細胞總RNA的提取和cDNA的合成實驗方法(I)分離白血病人血淋巴細胞取白血病病人志愿者血液，采用TAKARA公司的淋巴細胞分離液，每份按照下列方法分別分離外周血淋巴細胞①取白血病病人外周血f 2ml，加入等體積PBS稀釋；
②取無菌15ml離心管，加入淋巴細胞分離液，使分離液PBS :外周血=1 1 :1，小心將稀釋后的血液加到分離液上面，開始時要盡量貼近液面，慢慢滴加；③置于低速水平離心機，2500rpm,常溫，離心20min，離心過程中升速和降速都要緩慢，以免混層；④輕輕取出，可見管中呈現四層，從上至下分別為血漿層(黃色)，淋巴細胞層(白色)，分離液層(無色)和紅細胞層(紅色)，用一次性吸管輕輕吸取淋巴細胞層，于I. 5ml EP 管，約取 400 U I/ 管；⑤用PBS緩沖液等比例稀釋，2500rpm，常溫離心lOmin，備用。(2) TRIZOL法提取細胞總RNA采用Invotrigen公司的TRIZOL試劑進行如下操作①上述分離得到的人外周血淋巴細胞，經計數后，按每毫升裂解液裂解5X IO6個細胞的量，每I. 5ml的EP管中加Iml TRIZOL溶液，用移液槍將細胞沉淀吹打散，振蕩器稍微震蕩，至混合液基本澄清，室溫靜置5min ；②每管加入200 ill氯仿，用力搖晃試管15 30s，30° C下孵育2 3min ;③用12000Xg，4° C，離心15min，離心后混合物呈三層上層無色的水相，中間層和下層紅色的苯酚-氯仿層；④吸取上層水相(約500-600 U I)轉入新的I. 5ml EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置lOmin，沉淀RNA ；⑤用12000Xg，4。C，離心 IOmin ;⑥棄去上清，用Iml 75%的乙醇(臨用前十分鐘內用DEPC水配制，置冰浴)洗滌RNA沉淀；⑦2-8° C下，不超過7500 Xg的離心力離心5min ;⑧盡量棄去上清，倒置于吸水紙上，自然晾干(但不能完全干燥)，用IOlOiUDEPC水溶解；⑨取2 ill RNA做1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。該步驟后，將用于逆轉錄成cDNA。(3) cDNA鏈的合成①在I. 5ml RNase-free PCR管中加入如下混合液Oiigo dT Primer (50 ,uVI)I \i\
dNTP Mixture (10 mM each) I jil.
Total RNA<5 Mg
RNase free dd.H20 up to10 j..il②將上述RNase-free PCR管于65。C保溫5min后置冰上急冷，簡易離心數秒；③繼續在上述RNase-free PCR管中加入如下混合液
上述反應液10j.il
5 X Reaction Buffer4 )..il
RNase ! nhibitor(40 U/fil)0.5 .Lil PrimeScript Ii RTase (200 U/.lU) I (.il
RNase free ddH204.5 ial
Total20 ,Lil輕柔混勻，簡易離心數秒；④在PCR儀上按以下反應條件逆轉錄42。C 60min70° C 15min4° C holding反應產物置于-20° C保存，-80° C可長期保存。實驗結果以白血病志愿者外周血為材料,分離淋巴細胞后,抽提總RNA，將抽提出的總RNA取2iU，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，染色后在紫外燈下觀察，并拍照，結果見圖2。圖2中，共2個測試樣品，可見三條明顯的條帶，分別為核糖體5S、18S和28S RNAdl明總RNA抽提正常，無降解。逆轉錄合成的cDNA包含了人全部抗體基因，為白血病單鏈抗體基因的克隆準備了起始材料。實施例2 :用PCR方法擴增抗體重鏈和輕鏈可變區基因實驗方法(I)引物設計根據GenBank中人類抗體基因序列，分別設計PCR擴增抗體重鏈、輕鏈可變區所需的引物(見表I)，共32條(序列如SEQ ID NO. 1_32所示)，委托上海生工生物工程有限公司合成。表I.人免疫球蛋白可變區基因PCR擴增引物
權利要求
1.一種白血病單鏈抗體庫，其特征在于該抗體庫含有全套人類抗體重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，及中間連接區linker序列為(GGGGS) 3，有完整的抗原結合部位，以噬菌粒PCANTAB-5E為載體，庫容達到I. 5X 109。
2.根據權利要求I所述的一種白血病單鏈抗體庫的構建方法，其特征在于通過以下步驟實現 (1)總RNA提取和cDNA的合成取白血病患者的血液，分離淋巴細胞，用裂解液裂解淋巴細胞，提取細胞總RNA，經逆轉錄PCR逆轉錄為cDNA ； (2)用PCR方法擴增抗體重鏈和輕鏈可變區基因根據人類抗體基因序列，分別設計PCR擴增抗體重鏈、輕鏈可變區所需的特定引物，共32條，序列如SEQ ID NO. 1-32所示；以步驟(I)獲得的cDNA為模板，用PCR方法擴增可變區基因VH和VL，包括Vk和V λ ； (3)單鏈抗體scFv基因片段的組裝和全長擴增設計含有由四個甘氨酸和一個絲氨酸組成的重復3次的連接肽序列和酶切位點Sfil、NotI的引物，在上述擴增的重鏈VH和輕鏈VL可變區基因的基礎上，再經重疊PCR獲得scFv基因； (4)重組噬菌粒的構建分別用SfiI、NotI雙酶切scFv基因片段，將其插入噬菌粒載體PCANTAB-5E,構建重組噬菌粒，轉化感受態瓦coli TG1，經輔助噬菌體M13K07超感染，獲得單次的噬菌體抗體庫，經重復轉化后，獲得全人源白血病單鏈抗體庫，庫容達到I. 5 X IO9 ; (5)單鏈抗體庫的多樣性分析隨機挑取多個單克隆菌，測定插入區scFv基因的DNA序列，經ClustaIW序列比對軟件分析其序列的相似性，判斷單鏈抗體庫的多樣性分析，證明其多樣性良好。
3.根據權利要求2所述的一種白血病單鏈抗體庫的構建方法，其特征在于步驟(3)所述連接肽序列和酶切位點Sfil、NotI的引物序列如SEQ ID NO. 33-64所示。
4.根據權利要求I所述的一種白血病單鏈抗體庫在制備白血病抗體藥物中的應用，其特征在于通過以下步驟實現用白血病相關抗原作為靶抗原，用噬菌體展示的方法，篩選全人源白血病單鏈抗體庫，經過四輪“吸附-洗脫-擴增”的淘篩過程，篩選出抗白血病的特異性單鏈抗體，制備白血病抗體藥物。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述白血病相關抗原選用CD33胞外區蛋白。
全文摘要
本發明提供一種白血病噬菌體單鏈抗體庫，以噬菌粒pCANTAB-5E為載體，庫容達到1.5×109，經DNA測序證明其多樣性良好。從該全人源白血病單鏈抗體庫中，通過噬菌體展示技術，以特定的白血病相關抗原為靶標，經過多輪淘篩，可以方便地獲得白血病細胞特異的全人源單鏈抗體。本發明提供的抗體庫的庫容量大，多樣性良好；包含全套人類單鏈抗體的組合；單鏈抗體由重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL通過連接肽(GGGGS)3連接而成，且含有完整的抗原結合部位。所述方法可操作性強，庫容量大，可方便地篩選出對白血病特異的全人源單鏈抗體，這些全人源單鏈抗體可制備為靶向藥物，用于白血病的治療。
文檔編號A61P35/02GK102978713SQ201210484448
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月23日 優先權日2012年11月23日
發明者詹金彪, 范娜娜, 張珍珍, 林莉, 湯沁, 代爭 申請人:浙江大學