本發明涉及生物遺傳領域，尤其是一種編碼CD20特異性嵌合抗原受體的核酸和表達嵌合抗原受體的T細胞，可用于B細胞淋巴瘤、B細胞淋巴細胞白血病的過繼細胞治療(adoptive cell therapy,ACT)領域。

背景技術：

嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor,CAR)是人工合成的T細胞受體，由胞外靶向連接區，以及T細胞的激活信號結構域(鉸鏈區、跨膜區、胞內信號轉導區)組成。胞外靶向連接區由單鏈抗體或配體構成，具有特異性結合靶抗原的功能。鉸鏈區往往采用CD8、CD4或IgG4分子的鉸鏈區。跨膜區由親脂性的氨基酸序列組成，往往采用CD8、CD28的跨膜區段。胞內信號轉導區由CD3ζ鏈或FcεRⅠγ鏈以及共刺激信號分子CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、ICOS、CD244等構成。僅含有CD3ζ鏈或FcεRⅠγ鏈為第一代CAR，包含1個共刺激信號分子為第二代CAR，含有2個及以上共刺激信號分子的CAR為第三代。CAR修飾的T細胞通過胞外靶向連接區識別腫瘤表面抗原，然后通過胞內信號轉導區將識別信號傳遞到細胞內，激活T細胞并發揮殺傷腫瘤細胞作用。

CAR能夠識別細胞表面未經加工處理的蛋白，不受MHC限制；且CAR與配體之間的結合力較正常T細胞受體與肽-MHC間的結合力更大；CAR的識別也不受共刺激分子協同表達的限制。因此，CAR修飾T細胞過繼治療可較好地克服腫瘤細胞的下調MHC分子或者減少共刺激因子表達等免疫逃避機制。

除了B細胞發育的最早期和最晚期，CD20表達在包括晚期前體B細胞到記憶B細胞幾乎所有階段的B細胞表面。并且發現CD20在90％以上B細胞淋巴瘤和1/3急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)中表達。因此，CD20是治療B細胞淋巴瘤和B淋巴細胞白血病的有針對性的腫瘤靶抗原。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是，提供一種CD20特異性嵌合抗原受體及其應用，所述CAR特異性結合到靶抗原上，并發揮針對B細胞淋巴瘤、B細胞淋巴細胞白血病的細胞毒效應。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種CD20特異性嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體由小鼠抗人CD20的單鏈抗體scFv、CD8鉸鏈區和跨膜區、CD28和/或CD137T細胞共刺激信號分子及CD3ζ的胞內信號結構串聯構成；該嵌合抗原受體含有CD20特異性的單鏈抗體，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示，該嵌合抗原受體的氨基末端含有一個信號肽，其氨基酸序列如表中的SEQ ID NO.4所示，該嵌合抗原受體的輕鏈和重鏈之間由氨基酸序列如表中的SEQ ID NO.6所示的連接肽連接而成。

優選，所述嵌合抗原受體以CD8α鉸鏈區和跨膜區以及CD137和CD3ζ的胞內信號結構域串聯而成的結構域為T細胞刺激信號傳導結構，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示。

所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。所述嵌合抗原受體的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

上述的CD20特異性嵌合抗原受體在抗B細胞淋巴瘤、B細胞淋巴細胞白血病藥物中的應用。

本發明的有益效果是：本發明在既往專利《抗CD20嵌合抗體突變體基因及應用》(專利號：ZL 02158550.4)的序列中擴增出抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，并經重疊延伸PCR技術加入linker形成CD20特異性scFv。并將構建的scFv片段克隆到含有信號肽和CD8α-CD137-CD3ζ的慢病毒表達載體中，包裝成攜帶CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ編碼基因的慢病毒載體。利用慢病毒感染T細胞，使T細胞表達該嵌合抗原受體。通過流式細胞術、脫顆粒分析實驗、以及ELISA檢測T細胞分泌的細胞因子，證明該嵌合抗原受體修飾的T細胞對表達CD20的淋巴瘤細胞具有特異殺傷作用。因此本發明所述的嵌合抗原受體CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ可在B細胞淋巴瘤、B細胞淋巴細胞白血病的治療中應用。

附圖說明

圖1是本發明的CD20單抗的輕鏈可變區(V_L)、重鏈可變區(V_H)、以及兩者連接后的單鏈抗體片段的PCR擴增電泳圖(1泳道：2kb核酸分子量標準；2泳道：V_L；3泳道：V_H；4泳道：CD20 scFv)。

圖2是本發明的慢病毒表達載體CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ限制性內切酶酶切片段電泳鑒定圖(1泳道：15kb核酸分子量標記；2泳道：用核酸內切酶XbaⅠ和NotⅠ雙酶切慢病毒表達質粒CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ所得到的編碼CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ的DNA片段(732bp)和載體片段(7985bp)；3泳道：未酶切的CAR載體)。

圖3是本發明的慢病毒表達載體示意圖(其中逆時針序列是正向基因片段，順時針為反向基因片段)。

圖4是流式細胞術檢測本發明構建的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾T細胞中CAR分子的表達圖(A為轉染空載體的T細胞；B轉染CAR的T細胞)。

圖5是流式細胞術檢測B細胞淋巴瘤細胞系Raji和Namalwa細胞中CD20靶抗原分子的表達水平圖(A為CD20靶抗原分子表達水平的流式細胞結果，B為CD20特異熒光強度(SFI)的統計結果)。

圖6是本發明的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾T細胞與CD20陽性的Raji細胞系和CD20弱陽性的Namalwa細胞系按效靶比1:1、1:2、1:4、1:8共培養48小時后殘留的B細胞淋巴瘤細胞圖(CAR-T為CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾T細胞的實驗組；VEC-T為轉染空載體T細胞的對照組)。

圖7是本發明的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾T細胞對Raji和Namalwa細胞系按效靶比1:1殺傷作用4h的脫顆粒檢測圖(CAR-T為CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾T細胞的實驗組；VEC-T為轉染空載體的T細胞的對照組)。

圖8是本發明的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾T細胞與Raji和Namalwa細胞系按效靶比1:1共培養48小時后，T細胞釋放的細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6水平圖(A:FN-γ、B:IL-2、C:TNF-α、D:IL-6；CAR-T為CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾T細胞的實驗組；VEC-T為轉染空載體的T細胞的對照組)。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明：

本發明CD20特異性嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體由小鼠抗人CD20的單鏈抗體(single chain variable fragment,scFv)、CD8鉸鏈區和跨膜區、CD28和/或CD137T細胞共刺激信號分子及CD3ζ的胞內信號結構串聯構成；該嵌合抗原受體含有CD20特異性的單鏈抗體，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示，該嵌合抗原受體的氨基末端含有一個信號肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.4所示，該嵌合抗原受體的輕鏈和重鏈之間由氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.6所示的連接肽連接而成。

優選，所述嵌合抗原受體以CD8α鉸鏈區和跨膜區以及CD137和CD3ζ的胞內信號結構域串聯而成的結構域為T細胞刺激信號傳導結構，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示。

所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。所述嵌合抗原受體的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

上述的CD20特異性嵌合抗原受體在抗B細胞淋巴瘤、B細胞淋巴細胞白血病藥物中的應用。

該嵌合抗原受體中的T細胞的激活信號結構域除了可以是CD8α-CD137-CD3ζ，還可以是CD8α-CD28-CD3ζ和CD8α-CD28-CD137-CD3ζ。

本發明以既往制備的分泌抗CD20單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞系的Fab序列為基礎，設計合成抗CD20-scFv序列。

實施例1：嵌合抗原受體CD20特異性單鏈抗體的構建

(一)PCR擴增CD20單克隆抗體V_L、V_H的基因片段：

P1：5’GCTAGCGACATCGAGCTCACTCAG3’

P2：5’AGAACCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCCCGTTTGATCTCCACCTTGG3’

P3：5’GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGT TCTCAGGTGAAGCTGCAGCAGTC3’

P4：5’CCG GAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTGA3’

配制V_L、V_H PCR反應體系(20μl)如下：2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司):10μl；10μM P1/P2(V_L):1μl；10μM P2/P4(V_H):1μl；Fab plasmid:1μl；ddH₂O:補足至20μl。反應條件：94℃預變性5分鐘；重復如下循環33次：94℃30秒，52℃30秒，72℃1分鐘；最后，72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分離并回收V_L、V_H片段。將回收后的V_L、V_H片段與pMD19-T(simple)載體(Takara公司)通過T4連接酶(Takara公司)進行連接，送檢測序。保留測序正確克隆。連接反應體系及反應條件如下：V_L PCR產物/V_H PCR產物各50ng，pMD19-T(simple)載體1μl，Solution I連接反應液5μl；ddH₂O補足至10μl，16℃連接過夜。連接產物轉化入E.coli DH5α感受態細菌中，37℃過夜培養后，挑取單個菌落，擴大培養后，用質粒提取試劑盒(Takara公司)提取陽性克隆質粒，經酶切和測序檢測，將正確的質粒名稱分別命名為L和H。

(二)構建V_L-linker-V_H方向anti-CD20 scFv片段

配制第二步重疊延伸PCR反應體系(25μl):2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司)；10μM P1引物:1μl；10μM P4引物:1μl；V_L、V_H片段：各200ng；ddH₂O：補足至20μl。反應條件：94℃5分鐘預變性；重復如下循環28次：94℃30秒，58℃1分鐘，72℃1分鐘30秒；然后，72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分離并回收CD20 scFv片段(如圖1)。將回收后的scFv片段與pMD19-T(simple)載體(Takara公司)通過T4連接酶(Takara公司)進行連接，連接反應體系及反應條件如下：CD20 scFv PCR產物50ng，pMD19-T(simple)載體1μl，Solution I連接反應液5μl；ddH₂O補足至10μl，16℃連接過夜。連接產物轉化入E.coli DH5α感受態細菌中，37℃過夜培養后，挑取單個菌落，擴大培養后，用質粒提取試劑盒(Takara公司)提取陽性克隆質粒，經酶切和測序檢測，將正確的質粒名稱命名為CD20 scFv。得到的CD20 scFv的蛋白序列為SEQ ID NO.3，其中V_L和V_H的連接序列為SEQ ID NO.6。

(三)構建CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ目的載體：1.采用Nhe I、EcoR I核酸內切酶酶切前期構建的含有CD8α-CD137-CD3ζ片段的質粒(質粒中包含信號肽序列SEQ ID NO.4，跨膜結構域和T細胞激活結構域SEQ ID NO.5)，獲得CD8α-CD137-CD3ζ片段。2.設計兩端分別帶有NheI、EcoRI酶切位點的引物，擴增CD20 scFv片段。3.將CD20 scFv片段與目的載體進行連接，將構建的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ目的載體用NheI和EcoRI進行酶切鑒定(如圖2酶切結果表明陽性克隆含有目的條帶，且測序鑒定正確)。得到的CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζDNA序列為SEQ ID NO.2，經翻譯后的蛋白序列為SEQ ID NO.1，

實施例2：嵌合抗原受體CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ慢病毒修飾T細胞的制備

(一)采用EndoFree Plasmid Maxi質粒抽提試劑盒(QIAGEN公司)提取CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ轉移質粒和包裝質粒psPAX2、PMD.2G。三種質粒用4：3：1比例用Turbofect轉染試劑(Thermo公司)進行轉染(具體方法見Turbofect轉染試劑說明書)。轉染后24小時、48小時分別收取病毒上清，于4℃，3000rpm，離心10分鐘，經0.45μm濾器過濾后，采用50000g，4℃，3小時超速離心后濃縮10倍，后轉入-80℃保存。

(二)T細胞的制備：取新鮮健康人外周血10ml，采用RosetteSep T cell enrichment Cocktail(Stemcell公司)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)提取T細胞(具體步驟按照RosetteSep T cell enrichment Cocktail說明書)。按細胞：磁珠＝1：1比例加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco公司)，培養24小時即為轉染前的T細胞。

(三)慢病毒感染T細胞及感染后T細胞的培養：從-80℃中取出病毒上清，室溫下融化，按每1×10⁶T細胞加入100μl病毒上清，加入Polybrene至終濃度為8μg/ml。32℃，1800rpm，離心1.5h，轉入5％CO₂，37℃孵箱培養。

(四)流式細胞術檢測CAR修飾T細胞膜表面CAR的表達：使用Alexa Fluor 647標記的山羊抗小鼠IgG(Fab’)₂抗體(Jackson ImmunoResearch公司)染色，冰上孵育30分鐘后，進行流式細胞術分析T細胞表面CAR的表達效率為50-60％(見圖4)。

實施例3：嵌合抗原受體CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ慢病毒修飾T細胞對B細胞淋巴瘤細胞的殺傷作用。

(一)B細胞淋巴瘤細胞系中CD20表達水平：Raji、Namalwa細胞系均購自美國ATCC。分別培養后，各吸取5×10⁵細胞懸液，PBS洗2次后，標記APC抗人CD20單抗(Biolegend公司)，以標記APC-isotype為對照組，冰上孵育30分鐘。運用流式細胞術檢測各種細胞系的CD20表達的水平。Raji和Namalwa細胞系表達CD20的百分率分別為100％和0.21％(圖5A)；特異熒光強度(specific fluorescence intensity,SFI)分別為33.4和0.744(圖5B)。

(二)CAR修飾的T細胞與Raji、Namalwa細胞系共培養后流式細胞術檢測殘留的淋巴瘤細胞：將細胞按1×10⁵細胞/孔接種24孔培養板，分別加入1×10⁵(1:1)、5×10⁴(1:2)、2.5×10⁴(1:4)、1.25×10⁴(1:8)、CAR修飾的T細胞，轉染空載體的T細胞(VEC-T)設為對照組。將共培養后的細胞標記APC抗人CD20單抗(Biolegend公司)，流式細胞術檢測殘留細胞。結果顯示在CAR-T與Raji以效靶比1:1、1:2、1:4和1:8共培養48小時，共培養體系中表型為CD3^-的Raji細胞分別剩余30％、57％、85％和91％，在VEC-T與Raji共培養48小時，存在CD3^-的Raji細胞為86％、95％、102％、99％；而CAR-T與Namalwa以效靶比共培養48小時，共培養體系中表型為CD3^-的Namalwa細胞分別存在101％、127％、121％和118％，在VEC-T與Namalwa共培養48小時，存在CD3^-的Namalwa細胞為136％、141％、123％、111％(見圖6)。

(三)脫顆粒實驗分析CAR修飾的T細胞的激活：

將CAR-T及VEC-T細胞分別與Raji和Namalwa細胞按照效靶比1:1進行共培養，并在共培養體系中加入anti-CD107a抗體和monensin；4h后應用流式細胞儀檢測CD3⁺細胞表面CD107a的表達水平。CAR-T與Raji共培養體系中，CD3⁺細胞激活百分率為14％、VEC-T與Raji共培養體系中，CD3⁺細胞激活百分率為0.4％,，兩者具有顯著性差異(P＝0.007)。CAR-T與Namalwa共培養體系中，CD3⁺細胞激活百分率為3％、VEC-T與Namalwa共培養體系中，CD3⁺細胞激活百分率為3％，兩者沒有差異(見圖7)。

(四)ELISA檢測淋巴瘤細胞系與CAR-T細胞共培養上清中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6的水平：

分別將Raji和Namalwa細胞系按照6.3×10⁵細胞/孔接種24孔板。按每孔6.3×10⁵細胞分別加入CAR-T、VEC-T細胞，補充培養液至1.5mL，在孵箱中共培養12小時后。采用人IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6ELISA檢測試劑盒(R&D公司)，對共培養上清進行檢測(具體步驟見ELISA檢測試劑盒說明書)。表達CD20的Raji在與CAR-T共培養上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6細胞因子水平均較VEC-T組有顯著性升高(P<0.001)，但在不表達CD20的Namalwa細胞的共培養上清中的IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6細胞因子水平沒有顯著性的升高。(圖8)結果表明，嵌合抗原受體CD20 scFv-CD8α-CD137-CD3ζ修飾的T細胞在表達CD20的淋巴瘤細胞系刺激下，能夠分泌Th1類細胞因子。

綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。