解聚海參糖胺聚糖在制備防治血栓性疾病藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了解聚海參糖胺聚糖在制備防治血栓性疾病藥物中的應用，所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量為45,500Da至49,000Da。動物試驗證明，重均分子量為45,500Da至49,000Da之間的解聚海參糖胺聚糖，在一定劑量下，皮下注射（3～100mg/kg），具有明顯抗凝活性。實驗結果顯示，解聚海參糖胺聚糖的抗凝活性呈劑量依賴性，與肝素及低分子肝素比較，其隨劑量增加凝血作用遞增緩和。能安全、有效的用于防治血栓性疾病包括用于預防深部靜脈血栓形成、易栓癥或已有靜脈血栓塞癥的妊娠婦女為本品適應癥、也可用于血液透析時預防血凝塊形成等。
【專利說明】解聚海參糖胺聚糖在制備防治血栓性疾病藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種解聚海參糖胺聚糖的醫藥用途，具體涉及重均分子量為45，50003~49，00003的解聚海參糖胺聚糖在制備防治血栓性疾病藥物中的應用，包括了治療深部靜脈血栓形成，以及用于血液透析治療時預防血栓形成和防治手術后的血栓藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程所引起的疾病，臨床上稱為血栓性疾病。血栓性疾病嚴重威脅人類的生命健康，其發病率高居各種疾病之首，且近年來還有漸增之勢，是當代醫學研究的重點和熱點之一。[0003]血栓形成是指在一定條件下，血液有形成分在血管內(多數為小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，相應部位血液供應障礙的病理過程。依血栓組成成分可分為血小板血栓、紅細胞血栓、纖維蛋白血栓、混合血栓等。按血管種類可分為動脈性血栓、靜脈性血栓及毛細血管性血栓。
[0004]血栓栓塞是血栓由形成部位脫落，在隨血流移動的過程中部分或全部堵塞某些血管，引起相應組織和(或)器官缺血、缺氧、壞死(動脈血栓)及淤血、水腫(靜脈血栓)的病理過程。以上兩種病理過程所引起的疾病，在醫學上稱為血栓性疾病。
[0005]防治血栓性疾病的藥物按作用機制分為抗凝血藥物、抗血小板藥物、直接溶栓藥物等，臨床上均能用于預防和治療血栓栓塞形成。其中抗凝藥物是通過影響凝血因子，從而防止血栓形成或復發。抗凝藥物對已經形成的血栓無溶解作用，但可以防止血栓擴展和新血栓形成，有利于促進血栓早期自溶，同時抗凝血藥物對靜脈血栓形成具有明顯預防作用，同時抗凝血藥物還可以用于配合體外循環和血液透析中防治血栓的形成使用，旨在防止手術時的血液凝固。
[0006]血栓性疾病使用的注射藥物主要有肝素及低分子肝素，口服的主要有華法林、雙香豆素、新雙香豆素等，降低血粘度防治血栓性疾病的藥物主要有低分子右旋糖苷。其中華法林能夠抑制某些凝血因子的維生素X依賴性激活，是現處方量最大的抗凝血藥物，臨床研究證實，華法林能夠減少心房纖維性顫動患者64%的中風發生率。不過，盡管高度有效，但華法林也會帶來嚴重甚至致死性的出血風險。此外，因藥動學的個體差異性大且易受到飲食的影響，藥物相互作用又很復雜，故華法林在臨床實踐中難以最優劑量用藥，另外肝素及低分子肝素類藥物類藥物，臨床使用易導致出血，不同體質的人使用監控性強。因此就目前臨床使用的抗凝藥物來說均具有一定的副作用，鑒于人口的老齡化、血栓性疾病發病率的增加，以及現有抗凝藥物在臨床用于栓塞性疾病預防和治療的廣泛性以及其安全隱患的嚴重性。
[0007]從中藥中篩選、分離更具療效性、安全性防治血栓栓塞性疾病，是預防和治療血栓性疾病的一種必然趨勢。
【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種解聚海參糖胺聚糖在制備防治防治血栓性疾病藥物中的應用，以克服現有技術存在的缺陷。
[0009]所述解聚海參糖胺聚糖，是海參體壁中含有的一種酸性粘多糖的解聚產物，是海參所特有的；
[0010]動物試驗證明，重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖，在一定劑量下，皮下注射(3~100mg/kg),具有明顯抗凝活性。
[0011]對解聚海參糖胺聚糖的抗凝活性進一步研究,實驗結果顯示,解聚海參糖胺聚糖的抗凝活性呈劑量依賴性，與肝素及低分子肝素比較，其隨劑量增加凝血作用遞增緩和。
[0012]因此，所述的重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖，可以用于制備防治血栓性疾病藥物，所述血栓性疾病包括:深靜脈血栓、易栓癥或靜脈血栓塞癥、也可用于血液透析時預防血凝塊形成等；
[0013]所述的“重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖中”指的是，可以是重均分 子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖任意一重均分子量，也可以是重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖，為一種多組分混合物；
[0014]優選45，500Da ~46，500Da、46, 550Da ~47，500Da、47, 550Da ~48，500Da、或48，550Da~49，OOODa任意一重均分子量；
[0015]特別優選的，所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量為46，200Da、47.138Da、48.005Da、48.730Da
[0016]要獲得符合分子量要求的解聚海參糖胺聚糖組合物，可以將海參糖胺聚糖進行不同程度的降解來實現；
[0017]本發明還涉及一種藥物組合物，包括所述解聚海參糖胺聚糖和藥學上可接受的載體；
[0018]所述藥物組合物為凍干粉針劑時,所述解聚海參糖胺聚糖的重量含量為1-4%,優選的重量含量為1.2-3% ；
[0019]所述藥學上可接受的載體選自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮和氯化鈉中的一種或幾種，優選甘露醇；
[0020]本發明所述的解聚海參糖胺聚糖，還可以用于血栓性疾病的形成，防治深靜脈血栓形成、易栓癥或已有靜脈血栓塞癥的妊娠婦女為本品適應癥、也可用于血液透析時預防血凝塊形成等疾病；
[0021]以解聚海參糖胺聚糖計,給靜脈注射藥劑量為0.3~10mg/kg患者體重/天,優選
0.5-8mg/kg患者體重/天；具體可根據患者的年齡、病情等由醫師決定；皮下注射給藥劑量為I~20mg/kg患者體重/天；優選0.5~18mg/kg患者體重/天
[0022]給藥形式是皮下注射或靜脈注射，抗凝作用顯著不易引發出血，用于缺血性腦卒中更為有效和安全；
[0023]所述重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖的制備方法，包括如下步驟:
[0024](I)海參糖胺聚糖的提取:[0025]從海參總提取海參糖胺聚糖的步驟包括對海參進行浸泡過夜、淋干水分，絞碎，加水補足重量，兩次酶解、沉淀獲得海參多糖粗品、然后純化、脫色得到海參糖胺聚糖。
[0026]海參糖胺聚糖提取步驟(1)中酶是水解蛋白酶八1(^1^186 601111和復合胰酶；采用乙酸鉀沉淀粗品；對粗品采用截留分子量1萬的超濾膜純化；對粗品進行純化的是纖維素層析柱。
[0027](2)降解提取出的海參糖胺聚糖；
[0028]將海參糖胺聚糖與酸以及雙氧水混合、控溫、水浴、中和、醇沉、靜置、離心得到解聚海參糖胺聚糖的粗品；
[0029]海參糖胺聚糖降解步驟(2)中酸是醋酸溶液中終濃度是3~8%的醋酸；雙氧水的終濃度為4~6% ；中和所用的堿是氫氧化鈉；采用乙醇沉淀；
[0030](3)將步驟(2)的解聚海參糖胺聚糖的粗品，在35~401下干燥至無乙醇，溶于3~6倍解聚海參糖胺聚糖的粗品重量的水中，上吸附柱，然后用0.06~0.10001/1氯化鈉水溶液洗脫2~9個柱體積，收集45，50003~49，0000^分子量段的洗脫液，采用截留分子量500003濾膜(杭州慶升凈化技術有限公司)超濾，-38~-451冷凍干燥，獲得所述的解聚海參糖胺聚糖，分子量為45，50003~49，0000^,多分散度小于2，優選小于1.5，更優選小于1.4，純度可達到98%以上 ；
[0031]所述多分散度的定義如下:是本領域常用的衡量聚合物分子量分布的指數，用于表征聚合物分子量分布的寬度。多分散度在本文或其他文獻中又被稱多分散指數、多分散性或分布寬度指數，是重均分子量(咖)與數均分子量(胞)之比，即咖/胞。這個比值隨分子量分布寬度而變化。在單分散時，/ 111等于1，隨著分子量分布變寬，/ 111值逐漸變大。
[0032]所述重均分子量的定義如下:重均分子量(如丨油丨-狀一以陰10160111&1-
所有合成高分子化合物的分子量以及大多數天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它們是分子量不同的同系物的混合物。聚合物中用不同分子量的分子重量平均的統計平均分子量。
[0033]所述純度為重量純度。
[0034]所述的吸附柱選自凝膠吸附柱，如凝膠吸附柱、86^118(16^-650凝膠吸附柱或所述凝膠吸附柱,可以采用美國⑶公司的葡聚糖凝膠柱。
[0035]所述的海參糖胺聚糖，從海參體壁中提取的，提取海參糖胺聚糖的方法是本領域技術人員所熟悉的，如專利號為21200910305363.5公開的“一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法”中報導的方法，本發明不再贅述；
[0036]本發明采用現代科學技術將傳統中藥優勢進一步發揮，獲得了一種含有重均分子量介于45，50003至49，0000^之間解聚海參糖胺聚糖的制劑。經大量實驗研究表明，所述制劑，能安全、有效的用于防治血栓性疾病包括用于預防深部靜脈血栓形成、易栓癥或已有靜脈血栓塞癥的妊娠婦女為本品適應癥、也可用于血液透析時預防血凝塊形成等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1本發明的解聚海參糖胺聚糖組合物純度圖。[0038]圖2本發明的解聚海參糖胺聚糖組合物的分子量分布圖譜，其中:圖2A是為色譜圖，圖2B是分子量分布，圖2C是分子量累積重量分布曲線。
【具體實施方式】
[0039]實施例1[0040]1.海參糖胺聚糖的提取
[0041]稱取玉足海參藥材2kg，水浸過夜。將海參體壁淋干水分，絞碎，稱重并補水至18Kg，置60°C水浴中，pH調至7.8±0.2，加入投料重量2%的水解蛋白酶Alcalase 60ml(諾維信(沈陽)生物技術有限公司)攪拌，酶解4.5小時，84°C以上滅活6分鐘，降溫至480C ±2°C，加入氫氧化鈉調pH至7.8±0.2，再加投料重量0.2~0.25%的復合胰酶(無錫市雪梅酶制劑科技有限公司，雪梅牌)攪拌酶解4.5小時，煮沸6分鐘，冷卻。4°C離心，收集上清液，加入鹽酸調PH至2.4±0.2，4°C冷藏2.5小時，離心，收集上清液，加入氫氧化鈉調pH至6.8±0.2，加0.8倍(v/v)乙醇，4°C靜置過夜；離心，收集沉淀稱重,加沉淀物重量10倍的(v/w)蒸餾水，加熱至84°C ±2°C，待完全溶解后，加入氫氧化鈉pH調至8.9±0.2，加入氯化鈣至溶液中，氯化鈣最終重量濃度達到2% (w/w)，升溫至92°C保持16分鐘，冷卻至室溫，4°C離心，收集上清液，用飽和碳酸鈉溶液調pH至10.8±0.2，離心，收集上清液，用6mol/LHCl溶液調pH至5.9±0.2，加上清液0.8倍重量的乙醇，4°C冷藏過夜；
[0042]冷藏液離心，收集沉淀稱重，加2倍體積蒸餾水(v/w)加熱使其充分溶解，加乙酸鉀使其最終濃度為2.0mol/L，4°C靜置過夜。離心，收集沉淀稱重，加2倍體積蒸餾水(v/w)，加熱使其充分溶解，加乙酸鉀使其最終濃度為2.0mol/L，4°C靜置過夜。離心，沉淀用冷2mol/L乙酸鉀溶液洗滌三次，然后依次用79%乙醇、94%乙醇、無水乙醇洗滌，待乙醇揮發盡后，79°C干燥，稱重，得糖胺聚糖粗品。
[0043]糖胺聚糖粗品加0.05mol/L、pH6.0的HAc-NaAc緩沖液溶解，獲得糖胺聚糖粗品的重量濃度為2%的溶液上柱，溶液通過纖維素層析柱后，用1.5倍柱體積的0.4mol/LNaCl的HAc-NaAc 緩沖液(pH5.9±0.2)洗滌，再用 lmol/LNaCl 的 HAc-NaAc 緩沖液(pH5.9±0.2)洗脫，根據紫外檢測儀在220nm處數值的變化速度收集洗脫液，置60°C水浴中，用NaOH調pH至10.9±0.2，按體積的3%加入30%雙氧水，保持4.5小時，冷卻至室溫，離心，收集上清液，用HCl溶液調pH至6.9±0.5，加I倍量乙醇，10°C以下靜置8小時以上。10°C以下離心，收集沉淀得粗品。
[0044]粗品用注射用水溶解成5%的溶液(按濕品計)，用截留分子量I萬的超濾膜濃縮至原體積的1/2，補加水至原體積，再超濾至1/2體積，再加水重復二次，收集濃縮液，置于凍干盤中，液位高度0.6-0.9cm，進凍干箱，凍干得到海參糖胺聚糖精品
[0045]2.解聚海參糖胺聚糖的制備
[0046]將上述的海參糖胺聚糖精品，用5%的醋酸溶解，加入重量濃度為30%的雙氧水，使溶液中雙氧水的重量濃度為5.2%，50°C解聚1.5小時；
[0047]將解聚溶液用氫氧化鈉中和至中性，加入解聚溶液4倍體積的乙醇進行醇沉，靜置，離心，收集沉淀，得到解聚海參糖胺聚糖的粗品；
[0048]將粗品干燥,溶于粗品5倍重量的水中，過sephadex-GlOO柱,用0.05mol/l的氯化鈉洗脫5個柱體積，收集45，500Da~46，500Da分子量段的洗脫液，截留分子量5000Da濾膜(杭州慶升凈化技術有限公司)超濾，-38~_45°C冷凍干燥，獲得28g解聚海參糖胺聚糖。
[0049]經示差折光檢測器(RID-10A，島津)分析，純度為100.0%的純品(見圖1)。
[0050]經凝膠柱(TSK gel G4000PWXL)色譜分析，重均分子量46，200Da，多分散度值為1.28 (見圖 2)。
[0051]實施例2
[0052]海參糖胺聚糖的提取同實施例1。
[0053]解聚海參糖胺聚糖的制備方法如下:
[0054]將上述的海參糖胺聚糖精品，用5.1%的醋酸溶解，加入重量濃度為30%的雙氧水，使溶液中雙氧水的重量濃度為5.1%，，60°C解聚I小時；
[0055]將解聚溶液用氫氧化鈉中和至中性，加入解聚溶液4倍體積的乙醇進行醇沉，靜置，離心，收集沉淀，得到解聚海參糖胺聚糖的粗品；
[0056]將粗品干燥,溶于粗品5倍重量的水中，過sephadex-GlOO柱,用0.05mol/l的氯化鈉洗脫5個柱體積，收集46，550Da~47，500Da分子量段的洗脫液，截留分子量5000Da濾膜(杭州慶升凈化技術有限公司)超濾，-40~_45°C冷凍干燥，獲得IOg解聚海參糖胺聚糖。
[0057]經示差折光檢測器(RID-10A，島津)分析，純度為100.0%的純品。
[0058]經凝膠柱(TSK gel G4000PWXL)色譜分析，重均分子量47，138Da，多分散度值為1.24。
[0059]實施例3
[0060]海參糖胺聚糖的提取同實施例1。
[0061]解聚海參糖胺聚糖的制備方法如下:
[0062]將上述的海參糖胺聚糖精品，用4.9%的醋酸溶解，加入重量濃度為30%的雙氧水，使溶液中雙氧水的重量濃度為5.3%，，58°C解聚45分鐘；
[0063]將解聚溶液用氫氧化鈉中和至中性，加入解聚溶液4倍體積的乙醇進行醇沉，靜置，離心，收集沉淀，得到解聚海參糖胺聚糖的粗品；
[0064]將粗品干燥,溶于粗品5倍重量的水中，過sephadex-GlOO柱,用0.05mol/l的氯化鈉洗脫5個柱體積，收集47，550Da~48，500Da分子量段的洗脫液，截留分子量5000Da濾膜(杭州慶升凈化技術有限公司)超濾，-40~_45°C冷凍干燥，獲得12g解聚海參糖胺聚糖。
[0065]經示差折光檢測器(RID-10A，島津)分析，純度為100.0%的純品。
[0066]經凝膠柱(TSK gel G4000PWXL)色譜分析，重均分子量48，005Da，多分散度值為
1.26。
[0067]實施例4
[0068]海參糖胺聚糖的提取同實施例1。
[0069]解聚海參糖胺聚糖的制備方法如下:
[0070]將上述的海參糖 胺聚糖精品，用4.8%的醋酸溶解，加入重量濃度為30%的雙氧水，使溶液中雙氧水的重量濃度為5.5%，，58°C解聚分別為40分鐘和37分鐘；
[0071]將解聚溶液用氫氧化鈉中和至中性，加入解聚溶液4倍體積的乙醇進行醇沉，靜置，離心，收集沉淀，得到解聚海參糖胺聚糖的粗品；
[0072]將粗品干燥，溶于粗品5倍重量的水中，過s印hadex-G100柱，用0.05mol/l的氯化鈉洗脫5個柱體積，收集47，550Da~48，500Da分子量段的洗脫液，截留分子量5000Da濾膜(杭州慶升凈化技術有限公司)超濾，-40~_45°C冷凍干燥，獲得12g解聚海參糖胺聚糖。
[0073]經示差折光檢測器(RID-10A，島津)分析，純度為100.0%的純品。
[0074]經凝膠柱(TSK gel G4000PWXL)色譜分析，解聚時間為40分鐘得到重均分子量48，730Da,多分散度值為1.27。解聚時間為37分鐘得到重均分子量為50，OOODa,多分散度值為1.25。
[0075]實施例5
[0076]注射用含有解聚海參糖胺聚糖的藥物組合物的制備
[0077]將11.0g實施例1的解聚海參糖胺聚糖與22g甘露醇混合，加入注射用水1000ml溶解，經過超濾、灌裝、凍干，得到1000瓶注射用解聚海參糖胺聚糖的凍干粉針劑。
[0078]實施例6 [0079]將5.05g實施例2的解聚海參糖胺聚糖，5.05g實施例3的解聚海參糖胺聚糖與20g甘露醇混合，加入注射用水1000ml溶解，經過超濾、灌裝、凍干，得到1000瓶注射用解聚海參糖胺聚糖的凍干粉針劑。
[0080]實施例7
[0081]解聚海參糖胺聚糖的藥效學實驗
[0082]7.1體外抗凝血實驗
[0083]I試驗目的
[0084]觀察解聚海參糖胺聚糖制劑的體外抗凝血作用
[0085]2試驗材料
[0086]2.1供試樣品:
[0087]名稱:解聚海參糖胺聚糖(48，005Da);縮寫:DHG ;來源:實施例3的產物；配制:精密吸取后以注射用生理鹽水稀釋至所需濃度。
[0088]2.2試驗動物
[0089]品系:兔；來源:上海陳行實驗用兔有限公司；性別:雄性；體重:1960克；動物合格證號:SCXK (滬)2007-0010
[0090]2.3試驗儀器
[0091]血小板聚集凝血因子分析儀(型號LG-PABER北京世帝科學儀器公司)
[0092]3實驗方法
[0093]用血小板聚集凝血因子分析儀測定各濃度樣品的血漿凝結時間。實驗當日，于樣品池中分別加入兔血衆80 μ 1、0.9%氯化鈉溶液10 μ I,預熱180s后,加入I %氯化鈣溶液10 μ 1，立即混勻，避免產生氣泡，用血小板聚集凝血因子分析儀開始計算時間，記錄各樣品池凝結時間，即為空白。
[0094]精密量取對照品溶液，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成不同濃度的溶液，即為不同濃度的樣品溶液(0.8 μ g/ml ~24.0 μ g/ml)。
[0095]用10 μ I不同濃度的樣品溶液代替10 μ 10.9%氯化鈉溶液，分別測定各濃度的樣品溶液的血漿凝結時間。每個濃度平行測定4次，求平均值。
[0096]4實驗結果
[0097]實驗結果顯示樣品濃度在0.8 μ g/ml~24.0 μ g/ml劑量范圍內，隨劑量增加凝血時間延長，凝血時間延長遞增趨勢緩和。因此，解聚海參糖胺聚糖制劑用于抗凝血更具安全性，可控性，試驗結果見表1。
[0098]表1DHG體外抗凝血實驗結果
[0099]
【權利要求】
1.解聚海參糖胺聚糖在制備防治血栓性疾病藥物中的應用，所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量為45，500Da至49，OOODa0
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖是:重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖任意一重均分子量，或者是重均分子量為45，500Da至49，OOODa之間的解聚海參糖胺聚糖的多組分混合物。
3.解聚海參糖胺聚糖在制備防治血栓性疾病藥物中的應用，其特征在于，所述所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量為45，500Da~46，500Da、46，550Da~47，500Da、47, 550Da ~48, 500Da、或 48, 550Da ~49, OOODa0
4.解聚海參糖胺聚糖在制備防治血栓性疾病藥物中的應用，其特征在于，所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量為46，200Da、47.138Da、48.005Da或48.730Da。
5.根據權利要求1~4任一項所述的應用，其特征在于，所述血栓性疾病包括:深靜脈血栓形成、易栓癥或靜脈血栓塞癥，以及用于血液透析時預防血凝塊形成。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，皮下注射(3~100mg/kg)。
7.根據權利要求 1~4任一項所述的應用，其特征在于，所述藥物為一種藥物組合物，包括所述解聚海參糖胺聚糖和藥學上可接受的載體。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述藥物為凍干粉針劑，所述解聚海參糖胺聚糖的重量含量為1-4%。
9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，以解聚海參糖胺聚糖計，給靜脈注射藥劑量為0.3~10mg/kg患者體重/天，皮下注射給藥劑量為I~20mg/kg患者體重/天。
【文檔編號】A61K31/726GK103830264SQ201210487488
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月26日 優先權日:2012年11月26日
【發明者】王志國, 劉全海, 董玉瓊 申請人:上海開潤生物醫藥有限公司, 哈爾濱紅豆杉生物制藥有限公司