專利名稱：一種海南大風子抗腫瘤有效組分提取物及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及海南大風子抗腫瘤有效組分提取物、含有它的藥物組合物及其制法和用途。
背景技術：
腫瘤是當今世界上危害人類健康的最嚴重疾病之一，世界各國的專家學者都在積極研究尋找治療腫瘤的方法和藥物，尤其對中藥中抗腫瘤物質的研究十分活躍，有關這方面的動物實驗及初步臨床觀察表明中藥中多種物質對動物移植腫瘤有較強的抑制作用，能增強機體的免疫功能，減輕放療、化療的毒性反應。
大風子科植物全世界約有86屬850種，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，極少數延至溫帶地區，在我國分布有6族12屬45種6變種。大風子科植物的生物活性主要有抗癌和抗病毒活性，水提物和醇提物也表現出較好的降血糖、降血脂及中和神經毒的作用(柴興云，陸亞男，任宏燕，等.中國中藥雜志,2006,31 (4) :269.)。大風子在我國主要分布于海南及廣西部分地區，具有祛風濕、攻毒殺蟲之功效，臨床多用于麻風、疹癬、楊梅瘡等癥。
印度學者Sharma DK等較早地從印度大風子Hydnocarpus wightiana中分離得到 3 個黃酮木脂素類成分hydnowightin, hydnocarpin 和 neohydnocarpin。(Sharma DK, Ranganathan KR, Parthasarathy MR, et al. Plant Med, 1979，37 (I) : 79)這三種黃酮木脂素均有降低血清甘油三酸酯的作用，Hydnocarpin具有明顯的抗炎作用。此外，這三種化合物均有抗鼠類L-1210淋巴白血病，KB鼻咽腫瘤，結腸腺癌，HeLa-S3，和骨肉瘤的作用。三種均不能抑制肺癌細胞。Hydnocarpin可以抑制神經膠質瘤細胞。Hydnocarpin和 neohydnocarpin可以抑制Tmolt3白血病。
中國專利申請CN03138732. 2《一種治療癌癥的藥物》，CN200810146656. 9《一種治療癌癥的藥物》，CN200910143487. 8《治療子宮頸癌的中藥制劑》，CN200910134392. X《治療腫瘤中藥方》涉及了大風子聯合其他中藥的共同抗腫瘤作用，但均將大風子作為傳統中藥方劑中的某一味藥，未涉及大風子自身抗腫瘤活性部位。發明內容
本發明的目的之一是，提供一種海南大風子抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法。
本發明的目的之二是，提供所述有效組分提取物在制備抗腫瘤及其相關藥物中的應用。
本發明的技術方案如下
一種海南大風子抗腫瘤有效組分提取物，它是由海南大風子果實粉碎后除油，用 70%-95%的乙醇加熱回流提取，提取液蒸餾回收乙醇，然后加水分散，用乙酸乙酯萃取，萃取物過硅膠柱，依次以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶劑洗脫，在二氯甲烷-甲醇比例 20 I部分的洗脫液經蒸去溶劑得海南大風子抗腫瘤有效組分提取物。該部位具有明顯的抑制人神經膠質瘤細胞U251的作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。
一種制備上述海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的方法，它包括如下步驟
步驟1.將海南大風子果實粉碎后除油；
步驟2.將步驟I所得的大風子藥材以70%_95%的乙醇加熱回流提取，冷卻，過濾，濃縮提取液得浸膏；
步驟3.將步驟2的浸膏加水分散，以乙酸乙酯萃取，萃取液蒸餾回收溶劑后，得乙酸乙酯萃取物；
步驟4.將步驟3的乙酸乙酯萃取物過硅膠柱，以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶劑洗脫。在二氯甲烷-甲醇比例為20 I部分的洗脫液經蒸去溶劑得海南大風子抗腫瘤有效組分提取物。
上述的制備海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的方法，步驟I所述的除油可以是果肉壓榨除油或果肉用石油醚提取除油。
上述的制備海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的方法，所述的果肉用石油醚提取除油是將步驟2所得浸膏加水分散后用石油醚萃取。
本發明進一步提供了海南大風子抗腫瘤有效部位在制備抗腫瘤藥物中的應用。以抑制人神經膠質瘤細胞U251的增值能力作為活性指標進行抗腫瘤活性實驗。實驗結果表明，在體外細胞毒試驗中，可以明顯抑制U251的增值，具有細胞毒作用，可用于制備抗腫瘤治療藥物。
有益效果
(I)本發明的優點和效果在于采用溶劑提取、萃取，硅膠柱等常規方法，從海南大風子中提取得到了具有抗腫瘤作用的有效組分。該有效組分經實驗證明具有體外抑制人神經膠質瘤細胞U251生長的活性。
(2)本發明以海南大風子作為抗腫瘤藥物，具體到其抗腫瘤的活性部位，為更好研究其抗腫瘤機制奠定思路，為中藥現代化起了推動作用。
具體實施方式
以下所列實施例有助于本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1.海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的制備
將海南大風子果實5kg脫殼，果肉以壓榨機去油，果殼粉碎后與去油后藥渣合并。 用95%乙醇回流提取2小時，乙醇量為大風子質量的3倍，過濾后的殘渣重復提取I次，過濾，合并兩次乙醇提取液30L，回收乙醇至近無醇味，繼續濃縮至600ml，加水分散，加等體積的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液2400ml，回收乙酸乙酯，約得乙酸乙酯提取物約100g。取20g乙酸乙酯提取物，過硅膠柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(100 1， 50 1,20 I)作為洗脫劑進行洗脫。各洗脫液減壓濃縮后至60°C真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例為20 I的洗脫部分為大風子抗腫瘤有效組分提取物。
實施例2.海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的制備
將海南大風子果實5kg粉碎，以石油醚(60_90°C)冷浸2小時，石油醚用量為大風子質量的2倍。取下層藥渣，再次以石油醚冷浸2小時。下層藥渣用80%乙醇回流提取3小時，乙醇量為大風子質量的3倍，過濾后的殘渣重復提取I次，過濾，合并兩次乙醇提取液， 回收乙醇至近無醇味,繼續濃縮至600ml，加水分散，加等體積的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液2400ml，回收乙酸乙酯，約得乙酸乙酯提取物約100g。取20g乙酸乙酯提取物，過硅膠柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(100 1,50 1,20 I)作為洗脫劑進行洗脫。各洗脫液減壓濃縮后至60°C真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例為20 1 的洗脫部分為大風子抗腫瘤有效組分提取物。
海南大風子抗腫瘤有效部位提取物經過液相制備色譜進一步分離純化及NMR碳譜氫譜分析，初步判定主要含有大風子素及其他未知物。
實施例3.海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的制備
將海南大風子果實5kg粉碎，用95%乙醇回流提取2小時，乙醇量為大風子質量的 3倍，過濾后的殘渣重復提取I次，過濾，合并兩次乙醇提取液，回收乙醇至近無醇味，繼續濃縮至600ml，加水分散，加等體積的石油醚萃取3次。水層加等體積的乙酸乙酯萃取6次， 合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，約得乙酸乙酯提取物約100g。取20g乙酸乙酯提取物，過硅膠柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(100 1,50 1,20 I)作為洗脫劑進行洗脫。各洗脫液減壓濃縮后至60°C真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例為20 I 的洗脫部分為大風子抗腫瘤有效組分提取物。
實施例4.海南大風子抗腫瘤有效部位提取物的制備
將海南大風子果實IOOg粉碎，以石油醚冷浸2小時，石油醚量為大風子量的2倍。 取下層藥渣，再次以石油醚冷浸2小時。下層藥渣用95%乙醇回流提取2小時，乙醇量為大風子質量的3倍，過濾后的殘渣重復提取I次，過濾，合并兩次乙醇提取液，回收乙醇至近無醇味，繼續濃縮至50ml，加水分散，加等體積的石油醚萃取2次。加等體積的乙酸乙酯萃取4 次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，約得乙酸乙酯提取物約10g。取2g乙酸乙酯提取物，過硅膠柱，依次以二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(100 1,50 1,20 I)作為洗脫劑進行洗脫。各洗脫液減壓濃縮后至60°C真空干燥箱中烘干，得二氯甲烷-甲醇比例為20 I 的洗脫部分為大風子抗腫瘤有效組分提取物。
海南大風子抗腫瘤有效組分提取物經過液相制備色譜進一步分離純化及NMR碳譜氫譜分析，初步判定主要含有大風子素及其他未知物。
實施例5.抗腫瘤活性實驗
以實施例1得到的海南大風子抗腫瘤有效組分提取物為受試藥物。
體外培養人神經膠質瘤細胞U251，取指數生長期的細胞，用胰酶消化后，1500r/ min離心5min，將細胞重懸于培養基中，細胞濃度調至2*104個/ml，接種于96孔細胞培養板中，每孔100μ 1，仿制細胞培養箱(37°C，5%C02)中培養24小時。之后加入受試藥物 20 μ 1，陰性對照組加入終濃度為0. 5%DMS0,各組均設3個復孔。分別在加藥24小時，48 小時，72小時時，每孔加入5mg/mlMTT試劑20 μ 1，繼續置于37°C培養4小時。每孔加入 DMSO100 μ I，振蕩混勻，測定各孔在波長570nm處的吸光度值。計算細胞增殖抑制率抑制率(％) = (1-實驗組吸光度/對照組吸光度)*100%。
表I海南大風子提取物抗腫瘤活性實驗(U251)
權利要求
1.一種海南大風子抗腫瘤有效組分提取物，其特征是它是由海南大風子果實粉碎后除油，用70%-95%的乙醇加熱回流提取，提取液蒸餾回收乙醇，然后加水分散，用乙酸乙酯萃取，萃取物過硅膠柱，依次以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶劑洗脫，在二氯甲烷-甲醇比例20 I部分的洗脫液經蒸去溶劑得海南大風子抗腫瘤有效組分提取物。
2.一種制備權利要求1所述海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的方法，其特征是它包括如下步驟步驟1.將海南大風子果實粉碎后除油；步驟2.將步驟I所得的大風子藥材以70%-95%的乙醇加熱回流提取，冷卻，過濾，濃縮提取液得浸膏；步驟3.將步驟2的浸膏加水分散，以乙酸乙酯萃取，萃取液蒸餾回收溶劑后，得乙酸乙酯萃取物；步驟4.將步驟3的乙酸乙酯萃取物過硅膠柱，以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合溶劑洗脫，在二氯甲烷-甲醇比例為20 I部分的洗脫液經蒸去溶劑得海南大風子抗腫瘤有效組分提取物。
3.根據權利要求2所述的制備海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的方法，其特征是步驟I所述的除油是果肉壓榨除油或果肉用石油醚提取除油。
4.根據權利要求3所述的制備海南大風子抗腫瘤有效組分提取物的方法，其特征是所述的果肉用石油醚提取除油是將步驟2所得浸膏加水分散后用石油醚萃取。
5.權利要求1所述的海南大風子抗腫瘤有效組分提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的海南大風子抗腫瘤有效組分提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是所述的抗腫瘤藥物是抗人神經膠質瘤細胞U251藥物。
全文摘要
一種海南大風子抗腫瘤有效組分提取物，它是由海南大風子果實粉碎后用70%-95%的乙醇加熱提取，提取液蒸餾回收乙醇，然后加水分散，乙酸乙酯萃取，萃取物過硅膠柱分離，以不同比例的二氯甲烷和甲醇洗脫。在二氯甲烷-甲醇20∶1部位得海南大風子抗腫瘤有效組分提取物。該提取物具有明顯的抑制人神經膠質瘤細胞U251的作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。本發明公開了其制法。
文檔編號A61K131/00GK103027931SQ20121049892
公開日2013年4月10日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者余江南, 馮穎淑, 徐希明, 童姍姍, 劉宏飛, 楊艷 申請人:江蘇大學