專利名稱：一種鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬于獸用生物制品培育技術領域，具體涉及一種鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗的制備方法。
背景技術：
鴨疫里默氏桿菌病俗稱鴨傳染性漿膜炎，鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer,RA)感染病是鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種高致病性、接觸傳染性疾病，是嚴重危害2 7周齡雛鴨和幼齡鴨的一種細菌性傳染病。本病以10 35日齡的雛鴨發病較多，發病率最高可達90%以上，死亡率為5% 75%，是影響鴨養殖業的重大傳染病之一。該病廣泛存在于世界各地的養鴨場，鴨場一旦發生該病則很難徹底清除感染。目前該病的控制主要依靠抗生素治療，但隨著該菌對多種抗生素耐藥性的不斷增加和食品安全的需要，研制疫苗以提前預防該病的需要越來越迫切。鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，目前世界范圍內已確定的有21種，各血清型之間的交叉保護作用差，這就要求使用疫苗的抗原血清型必須與生產中的流行菌株的血清型一致。我公司對全國各地分離到數百株RA分離株的血清型進行了深入研究，研究結果表明流行菌株的優勢血清型是血清2和10型。為此，我們對血清2和10型RA的滅活疫苗進行了研究。另外，疫苗中的免疫佐劑對疫苗的質量和效果起著重要的作用，免疫佐劑與抗原同時應用，可增強機體針對抗原的免疫應答能力，或者改變免疫反應的類型。目前疫苗中應用的免疫佐劑多為白油佐劑、氫氧化鋁佐劑、類脂佐劑和蜂膠佐劑等。白油佐劑免疫原性好，但是毒副作用大；氫氧化鋁膠佐劑免疫原性好，副作用小，但不能誘導細胞免疫；類脂佐劑和蜂膠佐劑免疫原性好，可誘導體液免疫和細胞免疫，免疫持續時間長，但原材料價格昂貴。單一應用以上任何一種免疫佐劑，均存在不同的缺陷，不同程度的制約了其推廣應用
發明內容

本發明的目的就是針對現有技術的不足，而提出了一種鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗的制備方法，該方法較好的解決了鴨疫里默氏桿菌疫苗的制備問題，使得鴨疫里默氏桿菌疫苗的生產方法更加簡單，產品質量更加穩定，并且制備了新型的復合免疫佐劑，輔以優質抗原，增強了產品的免疫效果。本發明的技術方案是通過如下步驟來實現的
(I)制備種子液將沃華研發中心保種的鴨疫里默氏桿菌2型GD-2株和沃華研發中心保種的鴨疫里默氏桿菌10型GN19株分別接種于改良酵母瓊脂血平板進行培養，在37°C下培養24小時，挑取單菌落于改良酵母瓊脂血平板純化一代，選5 10個典型菌落接種于改良酵母液體培養基，在37°C下振蕩培養24小時，得到種子液，用顯微鏡進行純粹檢驗，將檢驗合格的作為種子，放入冰箱于2 8°C下保存備用。
(2)制備制苗用菌液在改良酵母液體培養基中接入步驟(I)得到的種子液，接入量為液體培養基量的2% 5%，37°C下培養8 12小時，對菌液進行檢驗提純，選取活菌數不低于2X 101(lCFU/ml的菌液；(3)滅活將步驟(2)得到的制苗菌液中加入菌液量O.3%的甲醛溶液，在37°C下滅活 24 48小時，然后進行活菌檢驗，至活菌生長；(4)制備復合佐劑取占最終疫苗質量15%的氫氧化鋁膠，用生理鹽水溶解，將楊樹皮類脂和免疫增強劑按比例加入，其中楊樹皮類脂佐劑加入量為最終疫苗質量的4-6%，免疫增強劑用量為最終疫苗質量的1_3%，用均質機混合均勻，即得免疫復合佐劑。
(5)制備疫苗在步驟(3)得到的制苗的滅活菌液與免疫復合佐劑混合，以 3000rpm轉速攪拌30分鐘，運行完畢，疫苗降溫至室溫，分裝，得到疫苗成品。
其中以上本發明中所述的改良酵母液體培養基組成成分為牛肉膏、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母浸粉、氯化鈉，其中制作方無法為各成分按重量百分比牛肉膏蛋白胨水解乳蛋白酵母浸粉氯化鈉為3 5% 3 5% : 3 5% : 2 3% 2. 3 3. 5%，用蒸餾水溶解，并定容，PH值調整為7. 2，在116°C下滅菌30分鐘制成。
其中上述步驟(5)中滅活菌液與免疫復合佐劑的混合比例，根據每次培養的細菌中抗原的含量而定，使最終疫苗中抗原含量2型抗原為35億/ml, 10型抗原為50億/ml, 鋁膠15%，類脂5%，免疫增強劑2%。
本發明所述技術方案的有益效果為本發明所述疫苗的疫苗株是經過深入研究、 嚴格篩選出來的，能有效預防鴨疫里默氏桿菌病。而且本發明所述疫苗用新型的復合免疫佐劑輔以優質抗原，單次免疫對鴨疫里默氏桿菌病預防效率高，效果明顯，從而減少了反復使用次數，降低了使用成本低。另外本發明的疫苗制備工藝方法設計科學、系統，設備簡單， 易于操作，得到的產品效果穩定，具有較好的社會效益和經濟效益。
具體實施方式
為了使本發明的技術方案更加清楚明白，下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例一、菌株選擇對已有的RAl和RA2型菌株進行免疫原性檢測，成功篩選出了沃華研發中心保種的鴨疫里默氏桿菌2型GD-2株和沃華研發中心保種的鴨疫里默氏桿菌10型GN19株作為制苗菌株的備用株。
二、制備方法1、改良酵母培養基制備將牛肉膏5g、蛋白胨5g、水解乳蛋白5g、酵母浸粉2. 5g、氯化鈉3g混合均勻，用加入蒸餾水補足至1000ml，充分混合，調節pH值為7. 2，在116°C下滅菌30分鐘，備用。
2、制備種子液取出鴨疫里默氏桿菌2型和10型各I瓶，分別劃線接種于改良酵母瓊脂血平板進行培養，在37°C下培養24小時，挑取單菌落于改良酵母瓊脂血平板純化一代，選5 10個典型菌落接種于改良酵母液體培養基，在37°C下振蕩培養24小時，得到種子液，用顯微鏡進行純粹檢驗，將檢驗合格的作為種子，放入冰箱于2 8°C下保存備用。3、在改良酵母液體培養基中接入步驟(I)得到的種子液，接入量為液體培養基量的2% 5%，37°C下培養8 12小時，菌液培養完成后，取樣用相同的培養基進行純粹檢驗。按《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)附錄15進行，應純粹。同時作活菌計數，按附錄17進行，各菌活菌數應不低于2 X 1010CFU/mlo4、滅活將步驟(2)得到的制苗菌液中加入菌液量O. 3%的甲醛溶液，在37°C下滅活24 48小時，然后用特 的改良酵母固體及液體培養基、馬丁肉湯、馬丁斜面、血斜面、沙氏培養基斜面進行活菌檢驗，并對液體培養物移植一代,應無菌生長。5、制備復合佐劑取占最終疫苗質量15%的氫氧化鋁膠，用生理鹽水溶解，將楊樹皮類脂和免疫增強劑按比例加入，其中楊樹皮類脂佐劑加入量為最終疫苗質量的5%，免疫增強劑用量為最終疫苗質量的2%，用均質機混合均勻，即得免疫復合佐劑。6、制備疫苗在步驟(3)得到的制苗的滅活菌液與免疫復合佐劑混合，混合比例按照使最終疫苗中抗原含量2型抗原為35億/ml，10型抗原為50億/ml，鋁膠15%，類脂5%，免疫增強劑2%而換算加入，以3000rpm轉速攪拌30分鐘，運行完畢，疫苗降溫至室溫，分裝，得到疫苗成品。三、疫苗檢驗
依照國家獸藥標準對制備的鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗進行檢驗，檢驗結果如下1、安全檢驗
選取7日齡櫻桃谷肉鴨10只，每只皮下注射疫苗lml，連續觀察14日，均應無異常反應。檢驗結果觀察14日后櫻桃谷肉鴨均未出現異常反應。2、效力檢驗
選用櫻桃谷肉鴨為試驗動物，10只/組，每只皮下注射疫苗O. 3ml。I個月后連同條件相同的對照櫻桃谷肉鴨10只，各肌肉攻毒RA2和RAlO型，觀察14日，對照鴨應全部發病，免疫雞至少保護8只以上為合格。檢驗結果對照組全發病，免疫組全健活。
權利要求
1.一種鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于其制備方法及步驟如下 (1)制備種子液將沃華研發中心保種的鴨疫里默氏桿菌2型GD-2株和沃華研發中心保種的鴨疫里默氏桿菌10型GN19株分別接種于改良酵母瓊脂血平板進行培養，在37°C下培養24小時，挑取單菌落于改良酵母瓊脂血平板純化一代，選5 10個典型菌落接種于改良酵母液體培養基，在37°C下振蕩培養24小時，得到種子液，用顯微鏡進行純粹檢驗，將檢驗合格的作為種子，放入冰箱于2 8°C下保存備用； (2)制備制苗用菌液在改良酵母液體培養基中接入步驟(I)得到的保存不超過7天的種子液，接入量為液體培養基量的2% 5%，37°C下培養8 12小時，對菌液進行檢驗提純，選取活菌數不低于2X 101(lCFU/ml的菌液； (3)滅活將步驟(2)得到的制苗菌液中加入菌液量O.3%的甲醛溶液，在37°C下滅活24 48小時，然后進行活菌檢驗，至無活菌生長； (4)制備復合佐劑取占最終疫苗質量15%的氫氧化鋁膠，用生理鹽水溶解，將楊樹皮類脂和免疫增強劑按比例加入，其中楊樹皮類脂佐劑加入量為最終疫苗質量的4-6%，免疫增強劑用量為最終疫苗質量的1_3%，用均質機混合均勻，即得免疫復合佐劑； (5)制備疫苗將步驟(3)得到的制苗的滅活菌液與免疫復合佐劑混合，以3000rpm轉速攪拌30分鐘，運行完畢，疫苗降溫至室溫，分裝，得到疫苗成品。
2.根據權利要求1所述的一種鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的改良酵母液體培養基組成成分為牛肉膏、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母浸粉、氯化鈉，其中制作方無法為各成分按重量百分比牛肉膏蛋白胨水解乳蛋白酵母浸粉氯化鈉為3 5% 3 5% 3 5% : 2 3% 2. 3 3. 5%，用蒸餾水溶解，并定容，pH值調整為7. 2，在116°C下滅菌30分鐘制成。
3.根據權利要求1所述的一種鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟(5)中滅活菌液與免疫復合佐劑的混合比例，根據每次培養的細菌中抗原的含量而定，使最終疫苗中抗原含量2型抗原為35億/ml，10型抗原為50億/ml，鋁膠15%，類脂5%，免疫增強劑2%。
全文摘要
本發明涉及一種鴨疫里默氏桿菌二價復合佐劑滅活疫苗的制備方法，該方法對鴨疫里默氏桿菌的菌株進行了嚴格篩選，通過對制備制苗用菌液、滅火過程的嚴格控制，制備新型的復合佐劑與制苗的滅活菌液合理混配、乳化制得疫苗。用該方法制備的疫苗，單次免疫對鴨疫里默氏桿菌病預防效率高，效果明顯，從而減少了反復使用次數，降低了使用成本低。另外該工藝方法設計科學、系統，設備簡單，易于操作，得到的產品效果穩定，具有較好的社會效益和經濟效益。
文檔編號A61K39/39GK102988967SQ20121054200
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者郎景民, 程小果, 蔡培軍 申請人:山東濱州沃華生物工程有限公司