專利名稱：一種腫瘤靶向診斷用小肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽，具體而言涉及一種結(jié)合FAP的多肽。
背景技術(shù)：
目前，惡性腫瘤已經(jīng)逐漸取代心腦血管疾病，成為人類的頭號(hào)殺手。最近統(tǒng)計(jì)資料表明，我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)癌癥患者約2000萬(wàn)人，近150萬(wàn)人死于癌癥。癌癥的死亡人數(shù)占 總死亡數(shù)的1/5。腫瘤的早期診斷與治療是提高其治愈率及改善病人生存質(zhì)量的關(guān)鍵。腫瘤的基本特征是細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞自身基因結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)的改變導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展已被大家廣泛接受是。然而隨著研究的深入，傳統(tǒng)觀念正被改變，腫瘤的發(fā)生發(fā)展并非由上皮或間質(zhì)單方面決定，而是由兩者相互作用所構(gòu)成的腫瘤-宿主界面微環(huán)境的平衡狀態(tài)所決定[Tlsty TD, Coussens LM. Tumor stroma and regulation ofcancer development. Annu Rev Pathol 2006; I (I) :119-50]。腫瘤微環(huán)境調(diào)控著腫瘤的多種生物學(xué)行為，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Tumor-associated fibroblasts)是上述微生態(tài)環(huán)境中最主要的宿主細(xì)胞之一，它通過(guò)直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸、可溶性因子的分泌和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的修飾而對(duì)該體系的平衡起著重要的調(diào)控作用。腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞占腫瘤組織的50% 90%，主要分布于腫瘤基質(zhì)內(nèi)、靠近腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞并包繞著癌巢[Loeffler M, Kriiger JA, NiethammerAG，Reisfeld RA. . R. Targeting tumor-associated fibroblasts improves cancerchemotherapy by increasing intratumoral drug uptake J. Clin.1nvest, 2006(7),116 1955-1962]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞且基因組非常穩(wěn)定，與正常組織成纖維細(xì)胞差異顯著，并且在各種腫瘤中的差異較小，因而有可能成為腫瘤早期診斷和抗腫瘤治療的新的切入點(diǎn)。成纖維細(xì)胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein, FAP)是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的核心標(biāo)志物，屬II型膜結(jié)合糖蛋白屬于絲氨酸蛋白水解酶家族，在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中高度保守。且FAP僅選擇性表達(dá)于胚胎，間葉組織、上皮組織來(lái)源的腫瘤中與腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。FAP是腫瘤基質(zhì)成纖維活化細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的標(biāo)志分子，是腫瘤靶向診斷的理想靶點(diǎn)，針對(duì)FAP設(shè)計(jì)的小肽分子探針能夠避開腫瘤細(xì)胞本身的異質(zhì)性，從而提高腫瘤診斷靈敏度和特異性，有可能成為腫瘤靶向診斷有前途的通用型探針，為腫瘤的分子成像提供新的思路。本發(fā)明擬以FAP為靶點(diǎn)，采用噬菌體肽庫(kù)技術(shù)篩選FAP高親和力配體小肽，為腫瘤靶向診斷提供一種新的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為提高腫瘤診斷靈敏度和特異性問(wèn)題，本發(fā)明提供一種多肽，所述多肽能夠特異性結(jié)合FAP，所述多肽其氨基酸序列為SCDSWHYWC。本發(fā)明通過(guò)篩選卩遼菌體展示環(huán)七肽庫(kù)(Ph. D. _C7CTMPhage display peptidelibrary)，篩選得到對(duì)FAP具有高特異性和高親和力的多肽Ml，具體篩選方法如下以FAP包被免疫試管并封閉，TBST洗滌后加入噬菌體肽庫(kù)，振蕩孵育一定時(shí)間后，TBST洗滌去除非特異結(jié)合的噬菌體，加噬菌體洗脫液振蕩洗脫特異結(jié)合的噬菌體，加中和液，取部分洗脫產(chǎn)物計(jì)數(shù)噬菌體的滴度，其余洗脫產(chǎn)物感染大腸桿菌ER2738擴(kuò)增并純化噬菌體，得到次級(jí)庫(kù)。逐步降低FAP包被濃度，再進(jìn)行兩輪篩選。從第三輪計(jì)數(shù)平板上隨機(jī)挑到若干個(gè)菌落，培養(yǎng)、純化得到噬菌體后，通過(guò)噬菌體ELISA測(cè)定各株噬菌體對(duì)FAP的結(jié)合。通過(guò)噬菌體ELISA方法，篩選得到25株對(duì)FAP結(jié)合的噬菌體。對(duì)所述25株噬菌體測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果得到有7株多肽序列，將所述多肽序列分別為命名P1-P7。呈現(xiàn)頻率最高的三種多肽共有SCD(XX)H(XX)WC序列；其中多肽序列Pl的出現(xiàn)頻率為4/25，其氨基酸序列為S⑶SWHYWC，所表達(dá)的多肽命名為Ml。將多肽Ml合成并用熒光標(biāo)記，檢測(cè)熒光標(biāo)記的多肽Ml與FAP的結(jié)合，結(jié)果顯示所得熒光標(biāo)記的多肽Ml能夠與FAP特異性結(jié)合。所述Ml的合成可以為生物方法的 表達(dá)，也可以是化學(xué)方法的合成，所述化學(xué)方法優(yōu)選固相合成方法；所述突光標(biāo)記優(yōu)選FITC(fluorescein isothiocyanate)標(biāo)記。本發(fā)明多肽Ml能特異性結(jié)合FAP，將有望用于解決具有廣譜適用性的腫瘤靶向分子成像技術(shù)難題，為腫瘤的早期診斷提供重要手段；該多肽Ml還可用于腫瘤靶向治療藥物的制備。本發(fā)明所用的緩沖液、培養(yǎng)基等說(shuō)明如下PBS :磷酸緩鹽沖溶液(Na2HPO41OmmoI/L，KH2P042mmol/L，NaCl 137mmol/L, KCl2. 7mmol/L, pH7. 4, Solarbio, China)；PBST (PBS,0. 05 % Tween 20(sigma), I % BSA(ablum bovine fraction V,WAK0)；TBS Tris 緩沖鹽溶液(50mmol/L, pH 7. 5, sigma)；TBST 50mmol/L TBS+0. 05% Tween 20 (sigma)；甘氨酸-HCl0. 2mol/L Glycine-HCl (pH 2. 2, solarbio, China)；PEG/NaCl 溶液含 20% (ff/V)聚乙二醇-8000，2. 5mol/LNaCl, sigma ；封閉緩沖液PBS+5mg/mLBSA (WAKO)LB液體培養(yǎng)基10g/L細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨(Oxford)，5g/L細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(Oxford),5g/L NaCl(sigma)；頂層瓊脂糖培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基+7g/L瓊脂糖(sigma)；LB/IPTG/Xgal 瓊脂平板(0. 05g/L isopropyl- β -D-thiogalactoside (IPTG),0. 04g/L 5-Bromo-4-chloro-3-1ndolyl- β -D-galactoside (Xgal), 15g/L 瓊脂粉(agar),si gma)


圖1特異性噬菌體富集第一輪至第三輪噬菌體回收率；圖2ELISA測(cè)定Pl與FAP的結(jié)合；圖3標(biāo)記FITC的Ml與FAP結(jié)合活性測(cè)定。
具體實(shí)施例方式通過(guò)參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明(包括以下實(shí)施例)中涉及的噬菌體滴度測(cè)定均采用下述方法(參見Ph. D. TMPhage Display Library 操作手冊(cè))接種E. coli ER 2738單菌落于5-10ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm搖床孵育至對(duì)數(shù)中期(0D600 : O. 5);微波爐加熱融化頂層瓊脂糖培養(yǎng)基，分成3mL/份分裝到滅菌試管中，每個(gè)噬菌體稀釋度用一管，保存于45°C備用；37°C預(yù)溫LB/IPTG/Xgal瓊脂平板，每個(gè)噬菌體稀釋梯度取一個(gè)平板備用；用LB培養(yǎng)液對(duì)噬菌體進(jìn)行10倍比系列稀釋(建議稀釋范圍擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)物上清=IO8-1O11 ;未擴(kuò)增的淘選洗脫物=IO1-1O4);每個(gè)稀釋度換一新鮮吸頭，建議使用帶濾芯吸頭以避免交叉污染；當(dāng)大腸桿菌菌液達(dá)對(duì)數(shù)中期時(shí)，將菌液分成200 μ L等份于微量離心管中，每個(gè)噬菌體稀釋度用一管；每管大腸桿菌菌液中分別加入10 μ L不同稀釋倍數(shù)的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育l-5min ;將噬菌體感染的大腸桿菌菌液加入45°C預(yù)溫的頂層瓊脂糖培養(yǎng)基管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal瓊脂平板上。適當(dāng)傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開；待平板冷卻5min后，倒置于37°C孵箱，培養(yǎng)過(guò)夜；檢查平板，計(jì)數(shù)有 102個(gè)噬菌斑的平板上的斑數(shù)，然后，用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 μ L噬菌體的空斑形成單位(pifu)滴度。實(shí)施例FAP特異性多肽的篩選和鑒定1.材料卩遼菌體環(huán)七妝庫(kù)(Ph.D.-C7C Phage display peptide library):購(gòu)自 NEB 公司，2X IO13p fu/mL，多樣性2. 7X109，于M13噬菌體cpIII蛋白的Kpn-1, Eag-1位點(diǎn)之間插入外源序列，隨機(jī)七肽兩端的半胱氨酸形成二硫鍵，使呈現(xiàn)的隨機(jī)七肽形成相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；HRP標(biāo)記鼠抗M13噬菌體抗體=Abcam公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記鼠抗FITC抗體美國(guó)Fitzgerald公司產(chǎn)品；FAP sigma公司產(chǎn)品；其余試劑庫(kù)市購(gòu)。2.方法和結(jié)果受體菌E. coli ER2738的復(fù)蘇及培養(yǎng)，以無(wú)菌技術(shù)從E. coli ER2738的甘油凍存物中挑取一接菌環(huán)，涂布于LB-Tet平板上，37C顛倒培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單一菌落，置于3ml含有l(wèi)ug/ml Tet的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使0D600值達(dá)O. 6左右。LB-Tet平板及細(xì)菌擴(kuò)增液置于4°C保存，備用。FAP特異性噬菌體的富集以10 μ g/mL濃度的FAP包被免疫試管并于4°C封閉過(guò)夜，TBST洗滌6次后加入噬菌體肽庫(kù)，37°C振蕩孵育lh，TBST洗滌10次去除未結(jié)合的嗤菌體，加O. 2mol/L Glycine-HCl (pH 2.2) ImL振蕩IOmin洗脫特異結(jié)合的曬菌體，力口150yLlmol/L Tris-HCl (pH 9.1)中和，取10 μ L洗脫產(chǎn)物計(jì)數(shù)噬菌體的滴度，其余洗脫產(chǎn)物感染大腸桿菌ER2738擴(kuò)增并純化噬菌體，得到次級(jí)庫(kù)，對(duì)次級(jí)庫(kù)滴度進(jìn)行測(cè)定后進(jìn)入下一輪篩選程序。按上述步驟再進(jìn)行兩輪篩選，其中第二輪FAP包被濃度為5 μ g/mL，第三輪FAP包被濃度為2 μ g/mL。篩選結(jié)果如圖1所示，隨著篩選輪數(shù)的增加，F(xiàn)AP包被濃度逐漸降低，噬菌體滴度逐漸增加。FAP特異性噬菌體的鑒定隨機(jī)挑取第三輪篩選后滴度測(cè)定平板上的分離良好的單菌落100個(gè)，經(jīng)過(guò)分別培養(yǎng)純化后，用噬菌體ELISA檢測(cè)各株噬菌體對(duì)FAP的結(jié)合活性。具體步驟如下為分別以I μ g/mL濃度FAP、BSA和IgGlFc包被酶標(biāo)板并于4°C封閉過(guò)夜，TBST洗滌6次后加入純化后的噬菌體100 μ L，37°C振蕩孵育lh，TBST洗滌10次去除未結(jié)合的噬菌體，加入HRP標(biāo)記的鼠抗M13單克隆抗體100μ L，37°C振蕩孵育lh，TBST洗滌10次，加TMB底物室溫避光反應(yīng)5 lOmin，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，以P/N彡2.1為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果顯示，有25株噬菌體表現(xiàn)出對(duì)FAP的結(jié)合。提取這25株噬菌體ssDNA，送Invitrogen公司測(cè)序，得到7株不同序列，分別為命名P1-P7。呈現(xiàn)頻率最高的三種多肽共有序列結(jié)構(gòu)SCD(xx)H(xx)WC ;其中Pl的出現(xiàn)頻率為4/25，其序列為SCDSWHYWC。序列Pl的結(jié)合活性測(cè)定分別以I μ g/mL濃度FAP、BSA和IgGlFc包被酶標(biāo)板并于4°C封閉過(guò)夜，TBST洗滌6次，加入展示有Pl序列的噬菌體100 μ L(以相同滴度的無(wú)關(guān)噬菌體為對(duì)照)，TBST洗滌10次去除未結(jié)合的噬菌體，加入HRP標(biāo)記的鼠抗M13單克隆抗體100 μ L，37°C振蕩孵育lh，TBST洗滌10次；加OPD底物室溫避光反應(yīng)5 lOmin，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，于490nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。結(jié)果如圖2所示，展示有Pl序列的噬菌體表現(xiàn)出對(duì)FAP的特異性結(jié)合。 FITC標(biāo)記的Ml結(jié)合活性測(cè)定熒光標(biāo)記多肽FITC-Ahx-S⑶SWHYWC (Ahx為正己氨酸)由北京中科亞光生物技術(shù)公司合成。以滅菌蒸餾水將多肽粉末(MlFITC)溶解至終濃度為25 μ mol/L分裝后存避光存放于_20°C。分別以I μ g/mL濃度FAP、BSA包被酶標(biāo)板，并于4°C封閉過(guò)夜，TBST洗滌6次，加入終濃度為25umol/L的M1FITC，37°C孵育lh，用TBST洗滌5次，HRP標(biāo)記的鼠抗FITC抗體，370C孵育lh，用TBST洗滌5次，加OPD底物室溫避光反應(yīng)5 10min，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，于490nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。結(jié)果如圖3所示，標(biāo)記了FITC的多肽Ml能特異性結(jié)合FAP。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SCDSWHYWC。
2.編碼權(quán)利要求1所述多肽的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1中所述多肽在制備腫瘤分子成像試劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1中所述多肽在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。
5.一種檢測(cè)FAP的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針包含權(quán)利要求1所述的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光探針，其特征在于，所述的熒光探針還包括熒光基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光基團(tuán)，其特征在于，所述的熒光基團(tuán)為FITC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤靶向診斷用小肽，所述小肽是通過(guò)對(duì)噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)進(jìn)行多輪篩選得到，其序列為SCDSWHYWC。本發(fā)明將該小肽用FITC標(biāo)記，并檢測(cè)標(biāo)記后的小肽與FAP結(jié)合的活性，結(jié)果顯示本發(fā)明的小肽能特異性結(jié)合FAP。本發(fā)明小肽可以用于制備針對(duì)腫瘤基質(zhì)的廣譜探針，可以滿足腫瘤分子成像和腫瘤靶向治療等方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K49/14GK103012561SQ20121057267
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者劉敏, 王雙坤 申請(qǐng)人:劉敏, 王雙坤