專利名稱：A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗及制備方法。
背景技術(shù)：
基于腦膜炎球菌多糖的疫苗已經(jīng)被描述，其引起針對莢膜多糖的免疫應(yīng)答。這些抗體可以對血清型特異性腦膜炎球菌引起補體介導(dǎo)的溶菌作用。腦膜炎球菌多糖疫苗顯示對兒童和成人有效，但對于嬰兒和幼兒其效能有限。對年幼群體，此多糖的后繼給藥產(chǎn)生弱加強應(yīng)答或無加強應(yīng)答。腦膜炎球菌多糖疫苗的保護期不能持續(xù)很長，并且據(jù)估計對成人 和大于4歲的兒童而言為3到5年。對I至4歲的兒童而言保護期少于3年。多糖能與主要組織相容性復(fù)合體分子結(jié)合，而這是抗原呈遞和刺激T-輔助淋巴細胞的前提條件，也即它們是非T。細胞依賴性抗原。多糖能夠不需T-輔助淋巴細胞的輔助而刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。由于對B淋巴細胞的非T-細胞依賴性刺激，這些抗原免疫后缺乏記憶誘導(dǎo)。在成人體內(nèi)，多糖抗原可以產(chǎn)生非常有效的非T-細胞依賴性應(yīng)答，但在嬰兒和幼兒的不成熟免疫系統(tǒng)中這些非T-細胞依賴性應(yīng)答卻很弱。非T-細胞依賴性多糖抗原可以通過將多糖共價連接至蛋白質(zhì)分子(“載體”或“載體蛋白質(zhì)”)上而轉(zhuǎn)變?yōu)門-細胞依賴性抗原。與綴合疫苗的多糖組分結(jié)合的B細胞可以被肽特異的T輔助細胞激活，所述肽為綴合的載體蛋白質(zhì)的一部分。對載體蛋白質(zhì)的T-輔助細胞應(yīng)答可以增加針對多糖的抗體的產(chǎn)生。目前國外已經(jīng)上市的流腦結(jié)合疫苗中，A群流腦莢膜多糖通過連接頭和載體蛋白破傷風(fēng)類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，流腦膜表面蛋白(MOMP)和白喉蛋白CRM197。中國專利CN1889975A描述的以CRM197為載體和A群寡糖結(jié)合的疫苗。該疫苗采用了只具有單一端活性末端的A群寡糖和CRM197進行交流，采用的的連接頭是己二酸的琥珀酰亞胺二酯。多糖結(jié)合產(chǎn)物中多糖和蛋白的比例是非常重要的特征。過高和過低的結(jié)合比例會大大降低疫苗的免疫原性，使其不適用于疫苗使用。而且在多價結(jié)合疫苗共同使用時，載體蛋白的總量也會影響其免疫原性。一般認為必須降低載體蛋白的總體使用量，因此在不降低抗原多糖含量的條件下，必須增加多糖蛋白的比例，而同時還必須保證高結(jié)合比的結(jié)合疫苗具有同等或者更好的免疫原性。現(xiàn)在發(fā)明的A群疫苗有多種，其結(jié)合比例都小于〈O. 6。如現(xiàn)有的巴斯德A群結(jié)合疫苗(DT為載體)的結(jié)合比為O. 2-0. 6之間，羅益和沃森的結(jié)合比為O. 3-0. 7 (TT為載體)之間，諾華的A群結(jié)合疫苗的結(jié)合比為O. 3-0. 7之間(CRM197為載體)。中國專利CN1889975A和Michael Broker等人描述的以CRM197為載體和A群寡糖結(jié)合的疫苗的平均分子量為150K以下。一般認為大分子量的免疫原會產(chǎn)生更強的免疫反應(yīng)。因此有必要開發(fā)出分子量較大的免疫綴合物
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗的制備方法。本發(fā)明第二個目的是提供一種A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗。一種A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗的制備方法，包括如下步驟I)將純化的A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖溶解于水中，加熱至50°C-60°C時，力口入過氧化氫使過氧化氫質(zhì)量濃度為O. 2%-5% ;反應(yīng)O. 5-18小時；使用IOKD超濾膜以生理鹽水進行超濾去除未反應(yīng)小分子雜質(zhì)，并濃縮得到解聚A群流腦多糖溶液，測量其中解聚流腦莢膜多糖分子量和含量；2)向每克解聚A群流腦莢膜多糖中加入O. 1-0. 4g己二酸二酰肼和O. 1-0. 4g的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，在pH為4. 9-5. 5的條件下，反應(yīng)1_4小時， 加入O. 3-0. 6g氰基硼氫化鈉，反應(yīng)40-60小時，使用IOKD超濾膜以純化水進行超濾去除未反應(yīng)小分子雜質(zhì)，獲得衍生的A群流腦莢膜多糖；3)將衍生的A群流腦莢膜多糖和純化的載體蛋白CRM197溶解于2_ (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中，使衍生的A群流腦莢膜多糖中酰肼摩爾濃度為O. 700 - lmmol/L,載體蛋白CRM197濃度為2-4g/L，調(diào)節(jié)pH到5. 8-6. 5，加入1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)并使其濃度為2-2. 5g/L，在室溫下反應(yīng)1. 5-3小時，存放于4°C。上述方法制備的A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗。上述疫苗可以通過硫酸銨沉淀或疏水柱層析等方法進行進一步純化，以去除未參與結(jié)合反應(yīng)的游離流腦莢膜多糖和游離蛋白。上述A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗中可以加入C群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗而構(gòu)成兩價的綴合疫苗。上述的兩價疫苗中還可以加入Y和W-135群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗而構(gòu)成四價的綴合疫苗。上述疫苗還可以包括佐劑。佐劑選自鋁佐劑、弗氏佐劑、單磷酰脂A、CpG、QS-21、霍亂毒素或甲酰甲硫氨酰肽。鋁佐劑為磷酸鋁或氫氧化鋁。上述疫苗還可以包含藥學(xué)可接受的防腐劑。防腐劑選自芐醇、對羥苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨。本發(fā)明的A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗，具有200KD以上的分子量，比現(xiàn)有的A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗分子量更高，也具有更強的免疫原性。本發(fā)明的方法工藝流程簡單，收率高，生產(chǎn)成本低，且多糖蛋白比相對穩(wěn)定(O. 4-1. 2)，并可在這一水平范圍內(nèi)進行相對的人為控制，大大提高了結(jié)合產(chǎn)物的質(zhì)量穩(wěn)定性。


圖1為不同疫苗抗A群多糖抗體的滴度。圖2為A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗示意。
具體實施例方式A群流腦莢膜多糖的衍生化反應(yīng)以及可能產(chǎn)生的產(chǎn)物由下列的反應(yīng)式所表示。通過過氧化氫的水解A群流腦莢膜多糖的平均分子量大小從100K以上下降至IOK到100K之間。通過加入己二酸二酰肼(ADH)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)和氰基硼氫化鈉(NaCNBH3) ADH可以引入到解聚流腦莢膜多糖的磷酸根上，通過加入不同的ADH的量我們可以控制單個解聚流腦莢膜多糖中引入ADH的數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗的制備方法，其特征是包括如下步驟 1)將純化的A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖溶解于水中，加熱至50°C_60°C時，加入過氧化氫使過氧化氫質(zhì)量濃度為0. 2%-5% ;反應(yīng)0. 5-18小時；使用IOKD超濾膜以生理鹽水進行超濾去除未反應(yīng)小分子雜質(zhì)，并濃縮得到解聚A群流腦多糖溶液，測量其中解聚流腦莢膜多糖分子量和含量； 2)向解聚A群流腦莢膜多糖中加入己二酸二酰肼和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，在PH為4. 9-5. 5的條件下，反應(yīng)1-4小時，加入氰基硼氫化鈉，反應(yīng)40-60小時，使用IOKD超濾膜以純化水進行超濾去除未反應(yīng)小分子雜質(zhì)，獲得衍生的A群流腦莢膜多糖； 3)將衍生的A群流腦莢膜多糖和純化的載體蛋白CRM197溶解于2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中，使衍生的A群流腦莢膜多糖中酰肼摩爾濃度為0. 700 - lmmol/L，載體蛋白CRM197濃度為2-4g/L，調(diào)節(jié)pH到5. 8-6. 5，加入1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽并使其濃度為2-2. 5g/L，在室溫下反應(yīng)1. 5-3小時，存放于4°C。
2.用權(quán)利要求1的方法制備的A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖綴合疫苗及制備方法，制備方法包括如下步驟將純化的A群腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖溶解于水中，加熱，加過氧化氫反應(yīng)；超濾去除雜質(zhì)，并濃縮得到解聚A群流腦多糖溶液；加入ADH和EDAC，反應(yīng)，加入氰基硼氫化鈉，反應(yīng)，超濾去除雜質(zhì)，獲得衍生的A群流腦莢膜多糖；將衍生的A群流腦莢膜多糖和載體蛋白CRM197溶解于緩沖液中，調(diào)節(jié)pH，加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽反應(yīng)。本發(fā)明的疫苗，具有200KD以上的分子量，具有更強的免疫原性。本發(fā)明的方法工藝流程簡單，收率高，生產(chǎn)成本低，且多糖蛋白比相對穩(wěn)定，并可人為控制，大大提高了結(jié)合產(chǎn)物的質(zhì)量穩(wěn)定性。
文檔編號A61K39/095GK103007277SQ201210576289
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者朱濤, 宇學(xué)鋒, 毛慧華, 邵忠琦, 劉正 申請人:天津康希諾生物技術(shù)有限公司