專利名稱：一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
竹子的醫(yī)療作用早已為我國人們所認(rèn)識(shí)，據(jù)《本草綱目》記，苦竹、甘竹、淡竹及竹浙、竹筍等均有不同的藥用價(jià)值。竹子中的藥用成分主要是黃酮類成分，竹葉黃酮具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化、清除羥自由基和調(diào)節(jié)血脂功能及抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖共《尽⒈Ｗo(hù)心血管疾病及保肝等生理活性，是一種十分理想的天然生物黃酮新資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在充分利用我國竹葉資源，提供一種具有降血糖活性的高黃酮含量的竹葉提取物制備方法，并應(yīng)用于食品與保健品中，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，具有工藝簡單、操作方便、產(chǎn)品竹葉黃酮含量高、設(shè)備投資少、無環(huán)境污染的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種具有降血糖活性高含量竹葉黃酮提取物的制備方法，所述方法按如下步驟進(jìn)行(I)將新鮮竹葉清洗、烘干后粉碎并過20目篩，獲得竹葉粉末，將竹葉粉末與水以質(zhì)量比I Ho混合后，在室溫下攪拌浸泡廣3h，然后升溫至8(T10(TC下加熱回流浸提O. 5 3h，冷卻至3(T50°C后 過濾，獲得濾液，即竹葉水提物；(2)在步驟(I)獲得的竹葉水提物中攪拌加入絮凝劑，在室溫下靜置疒6h，然后離心(優(yōu)選在每分鐘10000轉(zhuǎn)的條件下，于20°C離心10分鐘)，棄去沉淀，獲得上清液a ;所述絮凝劑為海藻酸鈉、殼聚糖或羧甲基纖維素；(3)將步驟(2)獲得的上清液a減壓濃縮后加入乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為7(Γ90%，靜置Γ12小時(shí)后，離心，獲得上清液b，將上清液b減壓濃縮至濃縮物無乙醇味，獲得浸膏；通常工藝上常選用95%的乙醇在醇沉，濃縮物中無乙醇味通常指乙醇體積濃度低于5%。(4)將步驟(3)獲得的浸膏加水配成混合液，再將混合液用萃取劑在5(T80°C條件下攪拌30 90分鐘進(jìn)行萃取，萃取完全后冷卻至3(T4(TC，靜置分層，獲得上層萃取液和下層萃余液，將上層萃取液減壓濃縮(優(yōu)選于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在真空度為O. 09Mpa，5(T6(TC條件下減壓濃縮)，除去溶劑和水，即得竹葉黃酮粗提液；所述萃取劑由有機(jī)溶劑A和有機(jī)溶劑B以體積比為1000:1飛混合組成，有機(jī)溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比5^9:1的混合溶液；有機(jī)溶劑B為乙酸；(5)將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液進(jìn)行柱層析，以聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)為吸附劑，以體積濃度709Γ80%的乙醇水溶液為洗脫劑，收集含目標(biāo)組分的洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水(優(yōu)選在真空度為O. 09Mpa，5(T6(TC條件下減壓濃縮)，獲得竹葉黃酮提取物，再以2BV體積濃度95%的乙醇水溶液洗脫層析柱來再生聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。進(jìn)一步，步驟(2)所述絮凝劑以質(zhì)量濃度O. f 5%絮凝劑水溶液的形式加入。進(jìn)一步，步驟(2)所述絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為廣5:1000。進(jìn)一步，步驟(2)所述絮凝劑以質(zhì)量濃度1%絮凝劑水溶液的形式加入，絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為2:1000。進(jìn)一步，將步驟(2)獲得的上清液a體積減壓濃縮至步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的l/2(Tl/30倍，加入體積濃度95%乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為70 90%(優(yōu)選80%)。進(jìn)一步，所述混合溶液是將步驟(3)獲得的浸膏加水配成步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的1/1(Γ /8倍。進(jìn)一步，步驟(4)中所述萃取劑由有機(jī)溶劑A和有機(jī)溶劑B以體積比為1000:2混合組成，有機(jī)溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比8:1的混合液；有機(jī)溶劑B為乙酸。進(jìn)一步，步驟(4)中所述萃取劑的體積用量與混合液的體積比為2 5:1。進(jìn)一步，步驟(5)中所述柱層析按如下步驟進(jìn)行將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液以O(shè). 01 O. 05BV/min (優(yōu)選O. 02BV/min)速度加入裝有聚乙烯聚吡咯烷酮的層析柱，先用2飛BV的蒸餾水洗脫至流出液無色，再以3 5 BV體積濃度70% 80% (優(yōu)選75%)的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水，獲得竹葉黃酮提取物。進(jìn)一步，所述步 驟(5)中聚乙烯聚吡咯烷酮用量為竹葉粉末質(zhì)量的1/2。本發(fā)明所述竹葉粉末按如下方法獲得以I 2年生剛竹屬淡竹的干青葉為原料，要求在秋冬季(11月 翌年2月)采收，采收后及時(shí)脫水干燥至水分含量在12%以下，破碎打包后在通風(fēng)干燥的環(huán)境中儲(chǔ)存。允許在干青葉中混有少量的桿籜。 本發(fā)明獲得的竹葉黃酮可直接用于食品或保健品中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(I)本發(fā)明的竹葉黃酮提物制備方法中使用的萃取劑為食品添加劑，安全性能好；聚乙烯聚吡咯烷酮是啤酒澄清劑，用于食品成分分離純化安全性好。(2)本發(fā)明方法獲得的竹葉黃酮含量81-86 %，回收率為28. 3-33% ；(3)本發(fā)明方法具有工藝簡單、操作方便、黃酮含量高、設(shè)備投資少、產(chǎn)品可用于普通食品中等優(yōu)勢。


圖1實(shí)施例2制備的竹葉水提物液相色譜圖；圖2實(shí)施例2制備的竹葉高黃酮含量提取物液相色譜圖，圖中峰1-峰9為黃酮類成分。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此所述竹葉粉末的制備方法為以I 2年生剛竹屬淡竹的干青葉為原料，要求在秋冬季(11月 翌年2月)采收，及時(shí)脫水干燥至水分含量在10%以下，破碎至20目打包后在干燥的環(huán)境中儲(chǔ)存。竹葉水提物與竹葉黃酮提取物液相色譜條件液相條件(Eclipse XDB-C18色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m);流動(dòng)相混合溶劑A(乙腈)和溶劑 B (O. 2% 乙酸水，v/v)梯度洗脫條件10% A (34 min)，10-15% A (34-82 min)，15-10% A (85-90 min)。流速1. OmL · mirT1 ;檢測波長 330nm ;柱溫 30°C ;進(jìn)樣量 20 μ L)。實(shí)施例1稱取IOOg粉碎至20目的竹葉粉末于圓底燒瓶中，加入IOOOg 7jC，室溫(25°C)攪拌浸泡3小時(shí)，然后在100°C下加熱回流浸提3小時(shí)，將反應(yīng)液冷卻至30°C，過濾，取濾液即得竹葉水提物，約985 mL ;在竹葉水提物中加入ImL質(zhì)量濃度O. 2%海藻酸鈉水溶液，室溫下攪拌6小時(shí)，然后在20°C下，以每分鐘10000轉(zhuǎn)高速離心10分鐘除沉淀，獲得上清液；取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 09MPa, 60°C )中減壓濃縮至35 mL,加入體積濃度95%乙醇水溶液IOOmL使乙醇體積終濃度為70%，靜置6小時(shí)后，取上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 09MPa, 60°C )上濃縮至約35mL，獲得浸膏，此時(shí)浸膏中乙醇?xì)埩袅考s為3. 2% (體積濃度)；將浸膏加入蒸餾水配成IOOmL混合液，加入三口圓底瓶中，同時(shí)在圓底瓶中加入300mL乙酸乙酯和ImL乙酸制成混合液，將混合液在50°C下攪拌萃取90分鐘進(jìn)行萃取，然后將混合液冷卻至30°C，置于分液漏斗中，靜置30分鐘進(jìn)行分層，獲得上層萃取液和下層萃余液；上層萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 09MPa，60°C)上濃縮至40mL左右，得到竹葉黃酮粗提液。將竹葉黃酮粗提液按O. 01 4BV/min流速加入裝有60ml聚乙烯聚卩比咯燒酮(pvpp)色譜柱(2.4CmX60Cm)上進(jìn)行吸附，上樣完后，用2BV蒸餾水進(jìn)行洗脫，除去糖份和蛋白類成分，再用4BV體積濃度80%乙醇水溶液洗脫黃酮類成分，收集這部分洗脫液，將洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 09MPa，55°C)上減壓濃縮至含水量小于5%，得到竹葉黃酮提取物4. 9g。紫外分管光度法測得黃酮含量81. 5%，黃酮提取率29. 8%。實(shí)施例2稱取Ikg粉碎至20目的竹葉粉末于圓底燒瓶中，加入7kg水，室溫(25°C)攪拌浸泡2小時(shí)，然后在100°C下加熱回流浸提3小時(shí)，將反應(yīng)液冷卻至40°C，過濾，取濾液即得竹葉水提物6. 95L ;在所述竹葉水提物中加入30ml質(zhì)量濃度5%殼聚糖水溶液，室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后在20°C下，以每分鐘10000轉(zhuǎn)高速離心10分鐘除沉淀，獲得上清液；取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 08MPa，60°C)中減壓濃縮至305 mL，加入體積濃度95%乙醇水溶液1084 mL使乙醇體積終濃度約為80 %，靜置6小時(shí)后，取上清液，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 08 MPa,60°C)中減壓濃縮至300 mL，獲得浸膏，此時(shí)浸膏中乙醇體積含量約為4. 1% ;將浸膏加入蒸餾水配成650ml左右混合液，移入三口圓底瓶中，同時(shí)在圓底瓶中加入1.5 L乙酸乙酯，
O.18L異丙醇和2mL乙酸制成混合液，將混合液在70°C下攪拌萃取60分鐘后冷卻至40°C，置于分液漏斗中，靜置30分鐘進(jìn)行分層，獲得上層萃取液和下層萃余液；上層萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 09MPa，55°C)上減壓濃縮至350ml，得竹葉黃酮粗提液。將竹葉黃酮粗提液按O. 02BV/min流速加入含有550ml聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)色譜柱U.ScmXSOcm)上進(jìn)行吸附，上樣完后，用3.6BV蒸餾水進(jìn)行洗脫，除去糖份和蛋白類成分，再用4. 5BV的75%乙醇洗脫黃酮類成分，回收這部分溶液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(O. 09MPa, 55°C )上減壓濃縮至含水量小于5%，得到竹葉黃酮提取物53 g。紫外分管光度法測得黃酮含量82. 5%，黃酮提取率31. 1%。
實(shí)施例3竹葉黃酮提取物對α -葡萄糖苷酶的抑制活性米用傳統(tǒng)的“Tremblay，，法(Chapdelaine P, Tremblay RR, Dube JY. P-Nitrophenol-alpha-D-glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activityin human semen. Clin Chem. 1978, 24(2): 208-211·),利用 α-葡萄糖苷酶催化水解對硝基苯基-a -D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，通過測定釋放出來的對硝基苯酚的量確定a -葡萄糖苷酶活性。以一定時(shí)間內(nèi)反應(yīng)體系中對硝基苯酚的含量變化來計(jì)算提取物的酶抑制活性。結(jié)果如下表I所示竹葉黃酮提取物在體外對a-葡萄糖苷酶具有一定抑制活性。表I竹葉黃酮提取物對a -葡萄糖苷酶的抑制活性
權(quán)利要求
1.一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于所述方法按如下步驟進(jìn)行 (1)將新鮮竹葉清洗、烘干后粉碎并過20目篩，獲得竹葉粉末，將竹葉粉末與水以質(zhì)量比1:7 10混合后，在室溫下攪拌浸泡廣3小時(shí)，然后升溫至8(T10(TC下加熱回流浸提O. 5 3h，冷卻至3(T50°C后過濾，獲得濾液，即竹葉水提物； (2)在步驟(I)獲得的竹葉水提物中攪拌加入絮凝劑，在室溫下靜置2 6小時(shí)，然后離心，棄去沉淀，獲得上清液a ;所述絮凝劑為海藻酸鈉、殼聚糖或羧甲基纖維素； (3)將步驟(2)獲得的上清液a減壓濃縮后加入乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為7(Γ90%，靜置Γ12小時(shí)后，取上清液b減壓濃縮至濃縮物無乙醇味，獲得浸膏； (4)將步驟(3)獲得的浸膏加水配成混合液，再將混合液用萃取劑在5(T80°C條件下攪拌30 90分鐘進(jìn)行萃取，萃取完全后冷卻至30 40°C，靜置分層，獲得上層萃取液和下層萃余液，將上層萃取液減壓濃縮至混合液體積的O. 3^0. 5倍，即得竹葉黃酮粗提液；所述萃取劑由有機(jī)溶劑A和有機(jī)溶劑B以體積比為1000:1飛混合組成，有機(jī)溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比5 9:1的混合溶液；有機(jī)溶劑B為乙酸； (5)將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液進(jìn)行柱層析，以體積濃度709Γ80%的乙醇水溶液為洗脫劑，收集含目標(biāo)組分的洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水，獲得竹葉黃酮提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述絮凝劑以質(zhì)量濃度O. Γ5%絮凝劑水溶液的形式加入。
3.如權(quán)利要求2所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為f5:1000。
4.如權(quán)利要求2所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述絮凝劑以質(zhì)量濃度1%絮凝劑水溶液的形式加入，絮凝劑水溶液與竹葉水提物體積比為 2:1000。
5.如權(quán)利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于將步驟(2)獲得的上清液a體積減壓濃縮至步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的l/2(Tl/30倍，力口入體積濃度95%乙醇水溶液使乙醇體積終濃度為7(Γ90%。
6.如權(quán)利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述混合液是將步驟(3)獲得的浸膏加水配成步驟(I)獲得的竹葉水提物體積的1/10 1/8 倍。
7.如權(quán)利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述萃取劑由有機(jī)溶劑A和有機(jī)溶劑B以體積比為1000:2混合組成，有機(jī)溶劑A為乙酸乙酯或乙酸乙酯與異丙醇以體積比8:1的混合液；有機(jī)溶劑B為乙酸。
8.如權(quán)利要求7所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述萃取劑的體積用量與混合液的體積比為2 5:1。
9.如權(quán)利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟(5)中所述柱層析按如下步驟進(jìn)行將步驟(4)獲得竹葉黃酮粗提液以O(shè).0Γ O. 05BV/min速度加入裝有聚乙烯聚吡咯烷酮的層析柱，先用2 5BV的蒸餾水洗脫至流出液無色，再以3飛BV體積濃度70°/Γ80%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮除去水，獲得竹葉黃酮提取物。
10.如權(quán)利要求1所述的具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中聚乙烯聚吡咯烷酮用量為竹葉粉末質(zhì)量的1/2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有降血糖活性竹葉黃酮提取物的制備方法，所述方法是將新鮮竹葉預(yù)處理，用水提取獲得竹葉水提物，再將竹葉水提物經(jīng)過絮凝劑沉淀、濃縮、萃取、層析步驟進(jìn)行分離純化，最終獲得高含量的竹葉黃酮提取物；藥理實(shí)驗(yàn)表明該竹葉黃酮提取物有一定的降血糖功效，效果與拜糖平相當(dāng)。本發(fā)明的竹葉黃酮提物制備方法中使用的萃取劑為食品添加劑，安全性能好；聚乙烯聚吡咯烷酮是啤酒澄清劑，用于食品成分分離純化安全性好；本發(fā)明方法獲得的竹葉黃酮含量81-86 %，回收率為28.3-33%；本發(fā)明方法具有工藝簡單、操作方便、黃酮含量高、設(shè)備投資少、產(chǎn)品可用于普通食品中等優(yōu)勢。
文檔編號(hào)A61P3/10GK103054038SQ20121059489
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者郭輝, 錢俊青, 高帥 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)