蜜蜂粉霜組合物、提取方法及其用途
【專利摘要】本發明涉及經純化的蜜蜂粉霜的組合物，制備所述經純化的蜜蜂粉霜的組合物的方法和蜜蜂粉霜在減輕或者治療炎癥中的用途。
【專利說明】蜜蜂粉霜組合物、提取方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及從蠟粉霜提取和純化的用于治療炎癥的天然產品的領域。
【背景技術】
[0002]炎癥影響很多個體，并且是各種不同疾病的基本癥狀。一般而言，炎癥是動物用來響應有害刺激的一種身體防御性反應，以保護受傷部位并有助于愈合過程。如所知道的那樣，病原體、刺激物或者受損細胞能夠觸發炎性反應，從而引起急性和慢性形式的炎癥。急性炎癥一般被定義為身體對有害刺激的初始反應，其涉及血漿和白細胞向受傷部位移動的增加。慢性炎癥一般被定義為身體對受損組織的延遲反應，這導致在較長時間內血流的增加和組織的腫脹。
[0003]盡管炎癥對愈合有幫助，但是炎癥過程中涉及的生物化學事件級聯會導致各種不同癥狀，包括變應性反應、動脈硬化癥和類風濕性關節炎。例如，暴露于變應原會引發炎癥，其中敏化免疫系統會響應于外來物體而引發抗體生成。在這種情況下，炎性介質例如組氨酸被釋放，導致發癢、腫脹和粘液生成。在其他實例中，動脈壁中的慢性炎癥會導致動脈硬化癥，從而導致斑塊形成和動脈狹窄。類風濕性關節炎涉及攻擊個體的滑膜關節的炎性反應，從導致疼痛和畸形。
[0004]已經有五種變應性反應得到鑒定。這些變應性反應包括:變態反應(直接的，I型)、細胞毒性和抗體依賴性的(II型)、免疫復合物介導性的(III型)、遲發型超敏反應的細胞介導的免疫記憶反應并且與抗體無關的(IV型)和自身免疫性疾病和受體介導的(V型)。直接的或I型變應性反應很大程度上歸因于IgE抗體，不過IgG抗體能夠參與并調節變應性反應。變態反應通常是由于免疫細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞亞群在抗原與細胞表面上的IgE抗體受體反應時受到激活而造成的，化學介質通過作用于臨近的免疫細胞、上皮細胞、內皮細胞和平滑肌細胞而引發變應性反應，并且更長時間地促進其他炎性和免疫細胞(嗜中性粒細胞、嗜 酸性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞)流入到組織中。炎性細胞的流入使患者復發并且有時推遲或者延長變應性或者超敏感性反應。也能夠在立即型和遲發型變應性反應與遲法型慢性損傷之間形成差別。可以根據發生的部位限定I型變應性反應。哮喘反應發生在肺部，鼻炎發生在鼻部，結膜炎、虹膜炎和葡萄膜炎發生在眼部，風疹(蕁麻疹)、特應性皮炎和濕疹發生在外皮膚真皮中，血管神經性水腫發生在真皮皮下組織、粘膜及粘膜下層組織。在循環和胃腸道系統中的全身變應性反應經常會危及生命。過敏性休克，一種最嚴重的變應反應形式，是一種醫療緊急情況。它往往是嚴重的，并且有時在以前致敏反應之后暴露于特異性抗原(例如胡蜂毒液或者青霉素)時可以引起易感個體的致命的全身性反應。過敏性休克的特點是呼吸道癥狀、昏厥、瘙癢、風疹、咽喉或其他粘膜的腫脹以及血壓的突然下降。過敏性休克的癥狀包括頭暈、意識喪失、呼吸困難、舌頭腫脹、皮膚發藍、支氣管痙攣、低血壓和死亡。
[0005]哮喘可以臨床定義為間歇性的、可逆性的氣道阻塞癥狀，本身表現為一些臨床實體:變應性哮喘、支氣管哮喘、運動誘發哮喘、化學品誘發哮喘和哮喘持續狀態。哮喘可分為兩種類型。外源性哮喘通常由外部試劑，例如變應原(如塵螨、花粉、蜇傷、藥物或食品)所引發，并且通常在生命早期得到診斷。內源性哮喘，一般在生命后期患上，可以被充血和炎性組織、感染、內源性兒茶酚胺(如腎上腺素)、藥物(如阿司匹林)、緊張或勞累所引發。炎癥反應也可以由很多刺激所引發，所述刺激包括熱和化學燒傷、暴露于毒素、由于暴露于環境(例如凍傷)而受損的組織、感染(包括細菌、病毒、寄生蟲)、物理傷害、免疫反應(包括變應性反應和自身免疫性癥狀)、暴露于輻射以及碎片或灰塵等異物的存在。
[0006]炎癥的癥狀包括患發部位發紅、腫脹和/或關節疼痛、關節僵硬，甚至在某些情況下關節功能喪失。發燒、發冷和疲勞也可能是個體中炎性反應的副作用。除了這些副作用之外，很多疾病可能由如下原因引起:慢性炎癥(包括哮喘)、枯草熱、肌腱炎、滑囊炎、關節炎、糖尿病、心臟病、動脈粥樣硬化、特應性皮炎(濕疹)、接觸性皮炎、牛皮癬、過敏性腸綜合征、克羅恩病、結腸炎、回腸炎、胃炎、憩室炎、潰瘍性結腸炎、肝炎、腎炎、狼瘡性紅斑、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病甚至是癌癥。
[0007]治療炎癥通常涉及使用藥物如非留體類和留體類抗炎藥，非留體類抗炎藥(NSAID)可以包括非處方藥如阿斯匹林、布洛芬或萘普生。非留體抗炎藥通常通過阻斷負責前列腺素生成的環氧合酶，一組促進炎癥的脂質化合物，來發揮作用。其他藥品包括甲氨蝶呤、柳氮磺胺批唳、抗腫瘤壞死因子藥物、環磷酰胺(cyclophosphamide)和霉酹酸酯。
[0008]留體類藥物治療往往涉及使用皮質類留醇，皮質類留醇作用于免疫系統以阻斷引發變應性和炎性反應的物質的生成。像非留體抗炎藥那樣，皮質類留醇抑制前列腺素的生成，從而降低了個體中的正常炎癥反應。
[0009]免疫選擇性抗炎衍生物(imSAlD)是另一個類抗炎化合物。一般來說，imSAlD是改變免疫細胞(白細胞)響應炎癥反應所造成的激活的一類肽。
[0010]天然方法也可用于治療炎癥。諸如柳樹皮、繡線菊、姜、人參和甘草等草藥已被證明顯示出抗炎性能。除了維生 素Bi2、C和E以及礦物銅和鋅之外，ω-3脂肪酸也被證明誘導抗炎反應。
[0011]諸如益生菌(probiotics，被定義為生活在哺乳動物的腸道中的健康微生物)、益生元(prebiotics,刺激健康細菌生長的非易消化食物組分)等營養藥物食品也顯示出抗炎性能。牛初乳(Symbiotics，其組合益生菌與益生元)可用于治療、減輕和減少與炎癥有關的癥狀。
[0012]上述治療方法的缺點是與直接使用有關的不利影響和/或聯合風險。無論是胃腸道的還是腎臟的影響(其能夠導致高血壓)，它們都是使用非留體抗炎藥的最常見的副作用。心血管疾病的風險可能并潛在地對懷孕期間的胎兒造成不良影響。由于前列腺素保護胃部并有助于血液凝固，因此非留體抗炎藥可能導致胃潰瘍并促進出血。
[0013]皮質類甾醇妨礙白細胞的功能，而白細胞保持免疫系統的正常運作。隨著時間的推移，皮質類留醇的使用可以影響負責皮質類留醇的自然生成的腎上腺的功能。它們還可以增加高血壓和骨骼疾病例如骨質疏松癥的風險。除了睡覺問題和消化不良之外，胃部不適和嘔吐也是常見的。個體對感染的抵抗力降低是一種風險，并且長期使用可導致器官衰竭。
[0014]益生元、益生菌或它們的組合(牛初乳)在被加入到食物產品中時存在改變它們的治療效果的風險。不同的制備方法可能賦予不同的健康效果。因此，它們的質量難以保證。它們也可能會由于微生物的活性而導致胃腸氣脹(gas)和/或腹脹(bloating)。
[0015]雖然維生素和礦物質的使用通常被視為是安全的，但是過量使用可導致不良副作用。維生素C當超過推薦量時可導致惡心和腹瀉，而維生素E可導致虛弱和疲勞。在某些個體中，維生素Bi2可能會引起腹瀉和失眠。
[0016]抗炎化合物的另一種天然來源是各種蜂產品。更具體地說，一些蜂制品，在作為營養藥物食品使用或者局部施用時，已知提供抗炎反應。這樣的蜂產品包括蜂蠟、蜂膠(propotis)、蜂王衆、蜂蜜、蜂糧和蜂花粉。
[0017]借助背景且已知的是，蜂蠟是蜜蜂用來構建蜂窩的化合物，并且由游離脂肪酸(12%至14%)、游離的伯脂肪醇(1%)、線性蠟單酯和羥基單酯(35%至45%)、復合蠟酯(15%至27%)以及主鏈長度為C27-C33的奇數直鏈烴(12%至16%)組成。摻入花粉和蜂膠使得蜂蠟具有獨特的黃色。蜂膠是由蜜蜂從植物來源收集的樹脂狀混合物，并且被用作修補蜂窩的密封劑。蜂王漿是蜜蜂分泌物，用來飼喂注定要成為蜂王的幼蟲，它作為食物來源，被用來引發蜂王形態的發育。蜂蜜是一種蜜蜂的食物來源，使用來自花朵的花蜜制成。蜂糧是使用蜂蜜和花蜜壓成顆粒的花粉，用來作為存儲花粉的一種方法。蜂花粉是蜜蜂的主要能量來源。
[0018]上述蜂產品被理解為具有各種各樣的保健益處，并普遍將它們加入到食物產品和營養藥物食品中，并且需求大。例如，各種蜂產品已被用作免費藥物(complimentarymedicine)以治療各種疾病。除了治療炎癥之外，據稱蜂產品還已被用來對感冒和流感病毒提供防護，以提高精力和性欲，減少壓力和抑郁、調節激素、抑制不健康的食欲、減輕體重、重建骨骼和組織、治療陽痿和胃潰瘍、以及作為膳食補充劑以對抗癌癥、高膽固醇和心臟疾病。
[0019]具體來說，蜂花粉作為一般的預防用藥，被認為提供保護以防止感冒和流感病毒、增加精力、性欲、耐力和心境、降低壓力和抑郁、調節激素、抑制癮頭和不健康的食欲、減輕體重、重建骨骼、組織和肌肉、治療貧血、哮喘、變應性疾病、陽痿、出血性胃潰瘍、高空病，并且作為膳食補充劑已經用于癌癥、高膽固醇疾病、心臟疾病[1，2]以及前列腺治療[3]。德國聯邦衛生局(German Federal Board of Health)已經認識到蜂花粉作為藥物[2]。蜂膠，由于其抗微生物和免疫調節性能，被天然保健醫生用來緩解炎癥、病毒性疾病、潰瘍、皮膚病、治療普通感冒、創傷和燒傷、喉嚨痛和牙菌斑[1，3]。蜂王漿被提出具有治療骨骼脆弱、內分泌系統紊亂、關節炎、哮喘、陽痿和不育、帕金森氏病、生長遲緩、細菌性感染和其他疾病的益處[I]。用于健康目的使用蜂王漿沒有被廣泛報道[3]。即使是蜂蜜，一種常見的食物來源，是天然的精力增進劑、免疫系統的構建者和許多常見疾病，如割傷和燒傷、舒緩喉嚨痛等的助劑。它是一種潤膚劑并含有抗微生物性能[I]。
[0020]蜂花粉是花朵的花粉、蜜蜂消化液和花蜜的混合物，是蛋白質、碳水化合物、維生素和礦物質的豐富來源。它含有各種次生植物產品，如類黃酮、類胡蘿卜素和萜烯[4]。關于其在變態反應中的用途，蜂花粉誘發患花粉變態反應患者的口腔脫敏[5]，并且幾次最近的動物研究表明，蜂花粉抑制變應性反應。具體而言，蜂花粉的苯酹提取物(phenoticextract)抑制了足水腫、IgE(免疫球蛋白E)和IgGl (免疫球蛋白Gl)卵清蛋白特異性生成、白細胞向肺部的轉移(支氣管肺泡灌洗(BAL))、卵清蛋白致敏小鼠的肺部中的嗜酸性粒細胞過氧化物酶(eosinophil peroxidise, EP0)活性。每天口服蜂花粉的小鼠顯著降低了 IgE特異性抗原誘發皮膚肥大細胞活化，并且體外降低見于肥大細胞降解(degranuatlofl),而且在抑制IgE與受體(FcERI)的結合之后腫瘤壞死因子生產可以讀取Fe ε RI[6]。
[0021]從蜂臘(Apis mellifera)中純化的高級脂族伯醇具有細胞保護作用，并在動物和人類中表現出適度的抗潰瘍效果[7]。三十烷醇是該混合物的最豐富組分，稱為D-002，在二十八烷醇和二十六烷醇之后，而二十四烷醇、三十二烷醇和十四烷醇以較低的濃度存在[8]。與蜂蠟和變態反應有關的期刊引文顯示傾向于引起變態反應，而不是阻止它們[9，10]，蜂膠也有類似的發現報道[11，12]。
[0022]還已知的是，一些蜂產品如蜂花粉等在某些個體中誘發變應性反應，特別是那些患有豚草變態反應的人。蜂產品的純化往往涉及很多提取步驟，以獲得經分離的產物。這些步驟可能涉及多種有機溶劑、皂化和研磨，長時間的懸浮液形成，從其他植物性化合物的復合混合物中分離出蜂產品以及與諸多添加劑混合以增加生物活性(bioactivity)。
[0023]除了上文所述之外，現有專利的綜述證實“蜂產品”的使用已經受到與使用這些產品所廣生的各種健康益處有關的廣泛研究。
[0024]例如，涉及蜂產品的以前工作包括Gamble等的美國專利7，141，611，其從蜂蠟和蜂花粉提取脂肪醇以在醫藥、食品和膳食補充劑中用作抗炎劑；授予Dato的美國專利6，482，442公開了一種含有蜂蜜、橄欖油以及蜂蠟、蜂膠、蜂王漿、蜂蜜和花粉的組合物，以治療包括炎癥在內的各種疾病；授予Ho等的美國專利7，351，739、授予De Gregorio的美國專利 6，342，255、授予 Sembrano 的 2010/0034905，授予 Mohammadi 等的 8，649，178 以及授予McClung的6，579，543公開了使用花粉和/或蜂花粉來治療炎癥；授予Corvi Mora等的美國專利7，763，282、授予Glavas的2010/0074964公開了使用蜂膠治療炎癥；授予Miyata等的美國專利201010048128公開了使用蜂王漿治療炎癥；以及美國專利2，494，907提到蜂臘粉霜(beeswax bloom)含有用以防止美國幼蟲腐臭病蔓延的殺菌應用磺胺類藥物的能力。
[0025]雖然在用以治療炎癥以及其他紊亂和病癥的天然產品中具有越來越高的商業價值，但是現有產品仍然存在問題和困難，這限制了它們的整體作用和安全性。
[0026]本發明的一個目的是避免或減輕上述缺點中的一些或所有缺點。

【發明內容】

[0027]本發明提供了天然的抗炎組合物，所述組合物包含蠟粉霜的提取物。
[0028]在另一個方面，本發明提供了一種用于預防或治療需要治療的動物中的炎癥疾病的方法，所述方法包括向所述動物施用治療有效量的包含蠟粉霜的提取物的組合物。
[0029]本發明還提供了包含蠟粉霜的提取物的食物、飲料、營養藥物食品、藥學制劑、化妝品、生物藥物、膳食補充劑、保健產品、調味品和調味料。
[0030]本發明還提供了包含蠟粉霜的提取物的局部制劑。
[0031]根據本發明，提供了一種從蜂蠟提取蜜蜂粉霜的方法，所述包括以下步驟:溶解蜜蜂粉霜于水性溶劑中以制得蜜蜂粉霜溶液。
[0032]在另一個方面，本發明提供了治療有效量的蜜蜂粉霜提取物在治療炎癥中的用途，其中，所述用途可包括局部施用。[0033]在結合附圖和實施例閱讀本發明的優選實施方式的說明之后，本領域的技術人員將更加清楚本發明的這些和其它目的和優點。本領域的技術人員將認識到，本發明的其他實施方式是可能的，并且本發明的細節在許多方面可以進行修改，所有這些都不脫離本發明的概念。因此，下面的附圖、說明和實施例應被認為是說明性的而不是限制性的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]現在將僅通過舉例方式參考附圖來描述本發明的實施方式，其中:
[0035]圖1是來自體外研究的結果的圖，其顯示蜜蜂粉霜對致敏大鼠腸的卵清蛋白誘導的收縮反應的影響；
[0036]圖2來自體外研究的結果的圖，其顯示在針對單獨抗原的反應進行歸一化時，蜜蜂粉霜對致敏大鼠腸的卵清蛋白誘導的收縮反應的影響；
[0037]圖3是來自體外研究的結果的圖，其顯示蜜蜂粉霜以致敏大鼠腸的蜜蜂粉霜收縮反應與卵清蛋白誘導的收縮反應的比率表示的影響；以及
[0038]圖4是來自體外研究的結果的圖，其顯示蜜蜂粉霜以致敏大鼠腸中采用抗原的蜜蜂粉霜收縮反應與采用碳酰膽堿的收縮反應的比率表示的影響。
【具體實施方式】
[0039]下文提供了本發明的一個或多個實施方式的詳細描述以及展示本發明的原理的附圖。因此，所述詳細描述通過舉例方式而不是通過限制方式闡述了本發明。所述描述將無疑使本領域的技術人員能夠制造和使用本發明，并且描述了本發明的若干個實施方式、調整、變型、替代形式和用途，包括目前本發明人認為實施本發明的最佳方式。應當清楚理解的是，可以對所描述的本發明進行常規的改變和調整，并且這樣的改變和調整直接落在本發明的精神和范圍內。`
[0040]換句話說，結合所述實施方式描述本發明，但本發明并不限定于任何的實施方式。本發明的范圍僅由權利要求限制，并且本發明包括許多替代方式、修改方式和等同方式。許多具體的細節在下面的描述中給出，以提供對本發明的徹底理解。提供這些細節僅出于示例目的，本發明可以根據權利要求實施而沒有一些或者所有這些具體細節。為了清楚的目的，沒有詳細描述在與本發明相關的【技術領域】中已知的技術資料，使得本發明沒有受到不必要的蒙蔽。
[0041]在本公開內容和權利要求(如果有的話)中，術語“包含”和它的衍生詞(包括“含”和“含有”)包括所述的整體或元素中的每一個，但不排除包括一個或多個另外的整體
或元素。
[0042]如本文所用的，與測量量有關的術語“約”是指在該測量量中的正常變化，如進行所述測量并給予了與測量目的相稱的關注水平的本領域的技術人員所預期的那樣。
[0043]如本文所用的，單數形式“一種”、“ 一個”和“所述”包括復數個對象，除非上下文另有明確指出。例如，參考“取代基”，其包括一個單一的取代基，以及兩個或更多個取代基，
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[0044]如本文所用的，術語“例如”、“如”、“諸如”或者“包括”的意思是指引入進一步闡
明更一般的主題的示例。除非另有說明，否則這些示例僅作為一種用于理解在本公開內容中的應用的輔助手段來提供，并且不意味著以任何方式加以限制。
[0045]如本文所用的，術語“動物”是指動物界的任何成員，優選包括人類。
[0046]如本文所用的，術語“食物”或“食物產品”或“食物材料”是指用于動物用途包括人類用途的任何安全的、可攝取的產品，并且“功能性食品”、膳食補充劑、營養藥物食品和“特制食物(designer food) ”。
[0047]如本文所用的，術語“天然保健產品”是指維生素和礦物質、草藥、順勢療法藥物和益生菌。
[0048]如本文所用的，“功能性食品”是指這樣的一種產品，其在外觀上類似于作為普通膳食的一部分而消費的傳統食物，但它除了純粹的營養優勢之外，還展示了生理學上的益處。
[0049]如本文所用的，“營養藥物食品”是指一種非藥物產品的形式，其以一般與食物無關的但是具有生理學益處或者提供防病保護或有助于疾病或者病癥的治療的丸劑、粉劑、飲劑以及其他藥學形式制備。
[0050]如本文所用的，“生物藥物”是指從天然植物及其衍生物中提取的保健化合物或組合物。
[0051]在世界任何地方，營養藥物食品、功能性食品、天然保健產品、生物藥物和特制食品可以添加有或者包含提供醫療或保健益處(包括疾病的預防和治療)的組分。
[0052]如本文所用的，“局部”是指受試對象(例如患者)的任何局部表面，如皮膚(包括頭皮下)、鼻、竇、陰道、陰莖、尿道或肛門的表面。
[0053]如本文所用的， “治療”是指出于抵抗炎性疾病、紊亂或癥狀目的的對病人的處理和護理。該術語擬包括減輕、改善或緩解癥狀和并發癥和/或治愈或消除疾病、紊亂或病癥。
[0054]術語“治療有效量”或“有效量”是指達到所需的治療或美容效果所需的組合物的量。
[0055]如本文所用的，術語“粉霜(bloom) ” (也稱為“反霜(fat bloom) ”)是指在脂質基蠟組合物的表面上(“表面反霜”)或者在類似于在脂質基組合物內的松散填裝粉末的β (貝塔)相晶體的同質中(“內部反霜”)形成的膜。反霜的原理通常被理解為蠟從亞穩相向熱動力學上更加穩定的相的轉變。由于反霜是一個熱力學驅動的過程，因此它最終將出現在不處于其熱動力學最有利的狀態(例如處在β初始(β’)相(beta prime phase)的蠟組合物)的脂質基蠟組合物中。雖然β’相不是熱力學上最有利的狀態，但是蠟燭的組合物可以設計成蠟從β’相向β相的轉變為年級而不是月級或者日級。還可以通過在高溫(高溫可以為脂質蠟組合物提供必要的能量以發生相轉變)儲存蠟燭來加劇反霜。表面上的脂肪晶體隨時間在尺寸上增大而首先形成暗淡的外觀，在表面上有白色或者淺灰色的沉積物(相對于曾經是光澤表面的情況)。在白色沉積物變得可見之前，產品一般變得暗淡和模糊，失去了高光澤表面。盡管整個產品的質地在反霜的早期階段之前沒有顯著變化，但是暗淡的外觀和白色沉積物使得其對于消費者來說看起來老而陳舊。隨著生長，反霜也顯現出本身，這看起來像花椰菜，形成在蠟燭的表面或者內部(一般在其燃燒之后)，然后使金屬熔池能夠再固化。
[0056]對于蜂蠟，當蠟的一些低熔融組分轉移至蠟燭的表面時，粉霜升至蠟燭的表面[13]。但是，它是一種一般未見報道的蜂蠟產品。在數據庫MEDLINE (OVID)，PubMed，Web ofScience和Biological Sciences中采用關鍵詞“蜂蠟”和“粉霜”檢索時，并沒有找到與粉霜的應用和組成有關的任何文獻。組成粉霜的任何低熔融組分均未得到鑒定。蜂蠟提取粉霜還未受到針對其他蜂產品所進行的觀測的科學研究。
[0057]粉霜也在由植物產生的角質層蠟上形成，并且被認為對昆蟲寄生蟲提供防護，因為其減少了粘附表面并且提供更少的粘附性表面[15，16]。除了所述物理功能之外，蜂蠟粉霜的其他作用或效果未得而知，不過對蜂巢上的粉霜似乎對蜜蜂沒有影響[171，抗捕食者作用尚未討論。
[0058]如上所述，蜜蜂粉霜是隨時間在蜂蠟上形成的粉狀涂層，其被理解為蜂蠟的轉移至蜂蠟的表面的低熔點組分。特別是，它是在老化蜂蠟蠟燭上經常見到。
[0059]根據本發明，描述了提取蜜蜂粉霜的方法、蜜蜂粉霜組合物和蜜蜂粉霜的用途。特別是，蜜蜂粉霜被證明具有抗炎性能，如采用腸組織來研究蜜蜂粉霜對變應性反應的影響所進行的體外研究所證明的。
_0] 提取和純化方法
[0061]根據本發明，提供了一種從蜂蠟提取蜜蜂粉霜的方法，所述包括以下步驟:在水性溶劑溶解蜜蜂粉霜以形成蜜蜂粉霜溶液。在另一個實施方式中，步驟a包括從蜂蠟的外表面刮下蜜蜂粉霜粉末，將刮下的蜜蜂粉霜粉末懸浮于水性溶劑中并從水性溶劑中除去顆粒物質。
[0062]水性溶劑是指用作溶解劑的物質或者能夠溶解另一種物質的物質。最常見的溶劑是水。溶解不溶于(或者幾乎不溶于)水的物質的其他普通溶劑有丙酮、醇、甲酸、乙酸、甲酰胺、BTX、二硫化碳、二甲基亞砜、四氯化碳、氯仿、醚、四氫呋喃、糠醛和己烷。它們可被分類為極性的和非極性的。極性溶 劑像水具有電荷分布不均勻的分子，每個分子留有比其他末端更活躍的末端。一般極性溶劑具有O-H鍵，其中水(HOH)、(CH3OH)和乙酸(CH3COOH)就是例子。丙醇、丁醇、甲酸、甲酰胺是極性溶劑。含有C-O實鍵而沒有O-H鍵的偶極性溶劑有丙酮[(CH3)2C=Oh乙酸乙酯(CH3CooCH2CH3)、甲基乙基酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜。非極性溶劑，如四氯化碳(CCl4)、苯(C6H6)和乙醚(CH3CH2OCH2CH3)具有電荷均勻分布的分子，并且與水不混溶。己烷、四氫呋喃和二氯甲烷是非極性溶劑。極性溶劑是親水性的而非極性溶劑是親脂性的。極性反應物會溶解在極性溶劑中。非極性溶劑溶解非極性化合物最好。油和水不混合，而是分成兩層。極性有三種量度，即，“偶極矩”、“介電常數”和“水混溶性”。雖然低的偶極矩和小的介電常數表明是非極性溶劑，但是極性和非極性溶劑之間并沒有明確的邊界。極性反映了存在于同一分子中的極性(OH)組分和非極性烴組分之間的平衡。如果烴特性相對增加，那么極性降低。在工作基礎上，可與水混溶的溶劑是極性的。
[0063]優選的是，所述水性溶劑包括一種或多種親水性組分。或者，水性溶劑選自包括丙酮、醇、甲酸、乙酸、甲酰胺、BTX、二硫化碳、二甲基亞砜、四氯化碳、氯仿、醚、四氫呋喃、糠醛和己烷的組。更優選的是，所述溶劑是水性醇，但是可以使用其他醇，包括但不限于，甲醇和丙醇。最優選的是，所述溶劑是水性乙醇。
[0064]在一個更優選的形式中，所述提取方法包括:
[0065]a)從蠟材料中移出粉霜以形成“粗制粉霜”;[0066]b)干燥所述粗制粉霜以形成“干粉霜”;
[0067]c)將所述干粉霜溶解在含水溶劑中，如上所述。
[0068]在一個優選的實施方式中，所述蠟材料來自蜂蠟。在更優選的實施方式中，所述蜂蠟或蠟材料是一種或者多種蜂蠟蠟燭或塊。干燥可以通過蒸發、加熱或其他任何傳統的干燥步驟進行。在一個最優選的實施方式中，干粉霜于步驟c)中溶解在醇和水(最優選為乙醇和水)的親水性混合物中。
[0069]在另一個實施方式中，蜜蜂粉霜溶液中的蜜蜂粉霜的濃度為1.0mg/mL以上。
[0070] 從粉霜中提取的組合物
[0071]在某些優選的實施方式中，從蠟粉霜中提取和純化的本發明的組合物包含一種或多種蛋白質、脂肪酸和肽。
[0072]更優選的是,所述組合物包含約20重量％至30重量％的作為ω脂肪酸最優選作為ωη-9脂肪酸的總脂肪酸。ωη-9脂肪酸(普遍被稱為ω-9脂肪酸)是在η_9位置(即，從脂肪酸的末端起第9個鍵)共同具有最終的碳-碳雙鍵的不飽和脂肪酸家族。在一個最優選的形式中，所述組合物包含20重量％至30重量％的油酸。
[0073]蛋白質是由一種或者多種通常折疊成球狀或纖維狀形式以利于生物學功能的多肽組成的生化化合物。多肽是通過相鄰氨基酸殘基的羰基和氨基之間的肽鍵鍵合在一起的氨基酸的單條線性聚合物鏈。
[0074]食物中的蛋白質濃度的經典測定法是凱氏定氮法和杜馬斯法，并且在本【技術領域】中是眾所周知的。這些測試確定樣品中的總氮。只要氮量乘以一個因數(其取決于樣品中所預期的蛋白質種類)，就可以確定總蛋白。此值被稱為“粗蛋白”含量。
[0075]令人驚奇地發現的是，采用本發明的方法從蠟粉霜提取和純化的組合物比殘留蜂蠟具有顯著校多的粗蛋白，并比蜂蠟具有濃度顯著較高的長鏈脂肪酸。甚至更優選的是，從蠟粉霜提取和純化的組合物比蜂蠟具有顯著較多的ωη-9脂肪酸、比蜂蠟顯著較多的C16:O (棕櫚酸)、比蜂蠟顯著較多的C18:3η3(α-亞麻酸)、比蜂蠟顯著較多的C24:0 ( 二十四烷酸)。盡管不打算受任何與本發明的組合物的抗炎性能有關的作用理論所約束，但是推測所述成分以比蜂蠟提取物高的水平聯合提供了優越的抗炎作用。
[0076]在一個優選的形式中，所述組合物是包含比率為約1.4至1.6:1的CI6:0和C18:1η9的蜜蜂粉霜提取物。在一個優選的形式中，所述組合物是包含比率為約5至7:1的C18:1η9與C18:3n3的蜜蜂粉霜提取物。在一個優選的形式中，所述組合物是包含比率約為約
2.2至2.9:1的C16:l和總粗蛋白。
[0077]在一個最優選的實施方式中，提取組合物包含表1中整個中間列所列舉的組分。
[0078]組合物的用途
[0079]可以設想的是，本發明的組合物可以有益地以局部制劑施用于動物以治療或改善炎性病癥。對于外部應用，所述組合物可以被制成乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑、噴霧劑、洗劑、皮膚滋補劑、香波或摩絲。皮膚噴霧劑一般由霧化共聚物，如聚乙烯吡咯烷酮和乙酸乙烯酯等組成，也可以用作定型洗劑。皮膚凝膠制劑在組成上類似于噴霧劑，但是呈凝膠和無醇形式，可以涂布皮膚。皮膚摩絲是在壓力下從霧化罐釋放的泡沫。皮膚護理組合物可被配制成疏水性或親水性的乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑、潤膚劑、噴霧劑、洗劑、皮膚滋補劑、香波或摩絲，這些制劑可以適當地含有本領域已知適于用在皮膚護理組合物類型的額外(可選)組分，并且這樣的進一步的成分可以包括礦脂、蠟、羊毛脂、硅酮、脂質體、植物油、礦物油、增塑劑、香料、防腐劑、滲透促進劑、PH調節劑或其他適用于局部皮膚組合物的組分。這樣的組分可以潤濕皮膚、穩定活性化合物、增加藥物與皮膚的接觸和局部濃度、控制藥物緩釋、和/或幫助減少皮膚破損、防止皮膚萎縮、纖維化和感染，并促進皮膚傷口的愈合，如果需要的話。[0080]本發明進一步提供了一種治療或改善非粘膜局部組織的適應癥的方法，所述方法包括:周期性地向受到所述疾病或病癥影響的組織施加包含治療有效量的蠟粉霜提取物的適當組合物的組合物。
[0081]本發明還包括將所述組合物施加在膜、貼劑或粘性固體制劑上面或者里面。本發明還提供洗劑、凝膠劑、乳膏劑、軟膏劑及或栓劑，其包含:有效量的草本生物活性劑的適當組合物，所述生物活性劑包含如本文所述的活性劑，可選的是，其中所述組合物進一步在粘膜表面上形成粘膜粘附性涂層。
[0082]本發明的組合物可以配制成局部或粘膜治療中所采用的許多組合物中任意組合物。例如，所述組合物可以配制成浴液(bath)或浸液、溶液、洗劑、凝膠劑、乳膏劑、軟膏劑、栓劑、適于釋放所述組合物的敷料、滴注溶液或泡沫等。在某些實施方式中，所述組合物以儲庫或粘性貼劑或者膜(如US2007/149902中所述)施加。
[0083]在某些實施方式中，所述組合物被配制成洗劑、凝膠劑、乳膏劑、軟膏或栓劑。
[0084]其他劑型
[0085]本發明提供了一種用于治療或預防炎癥的方法，所述炎癥包括冠狀動脈斑塊炎癥、細菌誘導性炎癥、病毒誘導性炎癥和與創傷、急性疼痛和手術過程相關的炎癥，所述方法包括向動物施用非毒性且治療有效量的組合物，所述組合物包括經提取和純化的蠟粉霜。
[0086]令人驚奇地發現，本發明的提取物和組合物表現出優異的抗炎活性，因此具有廣泛的各種治療和美容用途。
[0087]在某些實施方式中，所述組合物結合其它施用形式施用，所述其他施用形式例如為膜、貼劑或粘膜粘附性固體劑型。所述固體劑型可以在施用所述組合物之前、同時或之后施加。所述固體劑型能夠幫助將藥物輸送至影響更嚴重的或機械更容易到達的組織，而所述組合物將藥物輸送至其他地方。所述固體劑型中的藥物可以與本發明的組合物的藥物相同或不同。例如，可以采用冊02/094300和美國專利如.7，285，295中描述的劑型。或者，可以米用于2007年6月20日申請、名稱為“Ant1-1nflammatory Dissolvable Film”、序列號為11/765，587的申請中所描述的膜。
[0088]在某些實施方式中，針對全身性施用調整其他劑型，例如通過口服劑型或通過靜脈注射劑型。
[0089]本文描述的所需效果可以采用許多不同的方式來實現。本發明的化合物和組合物可以通過能夠與藥品、營養藥物食品、食物和飲料等結合使用的任何常規方法來施用。
[0090]一種用于治療炎癥的藥物組合物，所述炎癥包括冠狀動脈斑塊炎癥、細菌誘導性炎癥、病毒誘導性炎癥和與創傷、急性疼痛和手術程序相關的炎癥，所述組合物包含如本文所述的蠟粉霜提取物和可選的佐劑或載體。
[0091]一種用于治療和減輕炎癥的方法，所述炎癥包括冠狀動脈斑塊炎癥、細菌誘導性炎癥、病毒誘導性炎癥和與創傷、急性疼痛和手術程序相關的炎癥，所述方法包括向動物施用非毒性且治療有效量的如本文所述的蠟粉霜提取物和可選的佐劑或載體。
[0092]逝量
[0093]實現所期望的治療或美容效果所需的化合物或組合物的量當然取決于很多因素，如施用方式、動物(待治療的受試對象)的病癥和大小。這種劑量調整完全處在本領域的技術人員的能力范圍之內。
[0094]然而，作為一個指導原則，假設在粉霜提取物中的活性組分的分子量為約300道爾頓，所述組合物的有效臨床劑量在口服施用時可以如下所示(以受試對象的每kg重量計):[0095]約10 μ g/kg 至 3mg/kg
[0096]更優選為約100 μ m/kg 至 lmg/kg
[0097]更優選為約500 μ g/kg至800 μ g/kg的窄范圍
[0098]比上面所述的那些劑量較低的劑量可能對于局部應用是足夠的，并且可以為約10 μ g至Img/劑量(或者甚至更低)，即，比口服攝入所需的低至少70倍。
[0099]本發明的化合物和組合物可以通過如下方式施用于患者:
[0100].局部施加
[0101]?在藥物組合物中，其中它們與合適的載體或者賦形劑混合以用于口服、含服或其他常規用法
[0102].混合在食物中
[0103].混合在飲料中
[0104].混合在營養藥物食品中
[0105].混合在膳食補充劑如維生素和咀嚼片中
[0106].組合作為生物藥物制劑的一部分
[0107]使用生理上可接受的載體將這里所公開的用于實踐本發明的化合物和組合物配制成適于全身性施用的劑量是處在本發明的范圍之內。載體的正確選擇和合適的制造實踐、本發明的化合物和組合物，特別是配制成溶液的那些化合物和組合物可以通過胃腸外施用，如通過靜脈內注射施用。所述化合物和組合物可以使用本領域所熟知的藥學上可接受的載體容易地配制成適合于口服施用的劑量。這樣的載體使本發明的化合物和組合物可以被配制成片劑、丸劑、膠囊(包括軟凝膠膠囊)、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、漿劑和懸浮劑等以供待治療患者口服攝入。
[0108]包含一種或多種本發明化合物的藥物組合物包括其中以有效量包含以實現它們的預期目標的活性組分的組合物。有效量的確定完全處在本領域的技術人員的能力范圍之內，尤其在本文提供的詳細披露內容的基礎上。
[0109]除了所述活性組分之外，這些藥物組合物還可以含有合適的藥學上可接受的載體，所述載體包括便于將活性化合物加工成藥學上可以使用的制劑的賦形劑和輔料。配制用于口服施用的制劑可以是片劑、糖錠劑、膠囊劑或溶液劑的形式。
[0110]本發明的輸送組合物可以通過本身已知的方式，例如常規的混合、溶解、制粒、糖衣制備、制粉、乳化、包封、包埋或冷凍干燥工藝進行制造。
[0111]用于腸胃外施用的制劑包括水溶性形式的粉霜提取組合物的水溶液。此外，可以將活性化合物的懸浮液制備成適當的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯或脂質體。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液的粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。可選的是，該懸浮液還可以包含合適的穩定劑或增加所述化合物的溶解度的試劑以允許制備高度濃縮的溶液。
[0112]用于口服使用的制劑可以通過以下方式獲得:將活性組合物與固體賦形劑組合，可選地研磨所得的混合物，并且在添加合適的輔料(如果需要的話)之后，加工顆粒混合物，從而得到片劑或糖錠劑內核。合適的賦形劑包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的話，可以加入崩解劑，如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，如藻酸鈉。
[0113]為糖錠劑內核提供合適的包衣。為了這個目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可以可選地含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝膠(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。可以將染料或顏料添加到片劑或糖錠劑包衣中以識別或表征不同的活性化合物劑量的組合。
[0114]可用于口服的藥學制劑包括由明膠制成的推入配合式膠囊，以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨糖醇制成的軟密封膠囊。推入配合式膠囊劑可以含有與填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂以及可選的穩定劑混合的活性組分。在軟膠囊中，活性化合物可被溶解或懸浮在合適的液體，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可以添加穩定劑。
[0115]口服的液體制劑可以呈例如乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以作為在使用前以水或其它適宜媒介物重新配制的干燥產品的形式存在。這樣的液體制劑可含有常規的添加劑，例如懸浮劑如山梨糖醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠、氫化食用脂肪、乳化劑例如卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯或阿拉伯樹膠；非水性媒介物(其可以包括食用油)，例如扁桃仁油、分餾的椰子油、油酯如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐劑，例如對羥基苯甲酸甲 酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸；以及如果需要的話，常規的調味劑或著色劑。
[0116]在本發明的另一種形式中，本發明的化合物和組合物可通過食物、飲料和營養藥物食品施用，包括但不限于以下形式:
[0117]I)乳制品一如奶酪、黃油、牛奶和其他乳品飲料、涂醬(spread)和乳乳品混合物、冰淇淋和酸奶；
[0118]2)脂肪基產品一如人造黃油、涂醬、蛋黃醬、起酥油、烹飪和煎炸油和敷料；
[0119]3)谷物基產品一包括谷粒(例如，面包和面條)，不管這些商品是否經過蒸煮、焙烤還是以其他方式加工；
[0120]4)甜食一如巧克力、糖果、口香糖、甜品、非乳制品配料(例如Cool Whip.? )、果汁冰糕、酥皮和其他餡料；
[0121]5)飲料一不論是酒精類還是非酒精類飲品，并且包括可樂及其他軟飲料、果汁飲料、膳食補充劑和膳食替代飲料，如以Boost?和Ensure?為商標名售賣的那些飲料；
[0122]6)雜項產品一包括蛋和蛋制品、加工食物如湯、預制面醬和預成型的飯菜等。[0123]本發明的化合物和組合物可通過諸如混合、輸注、注射、共混、分散、乳化、浸潰、噴霧和捏合等技術被直接加入食品、營養藥物食品或飲料中而沒有進一步改變。或者，所述化合物和組合物可在被攝入之前由消費者直接施加至食品上或飲料中。這些都是簡單和經濟的輸送方式。
[0124]雖然本文所述的組合物、方法和工藝的形式構成了本發明的優選實施方式，但是應當理解的是，本發明并不限于這些精確的形式。如本領域的技術人員而言清楚了解的那樣，可以將上述的各種實施方式組合以提供進一步的實施方式。如果有必要的話，本發明組合物、方法和工藝(包括其特定的組分)的諸多方面可加以改變以最好地采用本發明的系統、方法、節點和組分和概念。這些方面被認為是充分地處在本發明所要求保護的范圍之內。例如，上述的各種方法可以省略一些行為，包括其他的行為，和/或以不同于所示的實施方式中給出的順序執行行為。
[0125]另外，在本文所教導的方法中，各種行為可能會以不同于所展示和描述的順序來執行。此外，所述方法可以省略一些行為，和/或采用額外的行為。
[0126]根據以上描述，可以對本發明系統、方法和制品進行這些和其他的改變。一般而言，在后面的權利要求中，所使用的術語不應該被解釋為將本發明限制于說明書和權利要求書中所公開的【具體實施方式】，而是應該被解釋為包括所述權利要求所限定的所有可能的實施方式和全部范圍的等同物。因此，本發明并不限于本公開內容，相反，本發明的范圍完全由后面的權利要求來確定。
[0127]實施例:
[0128]實施例1:提取和純化步驟
[0129]材料與方法
[0130]使用刮刀通過刮擦蜂蠟蠟燭獲得蜜蜂粉霜。所述蠟燭通過當地零售商獲得，并且全部蠟燭都是由同一批次獲得。在使用之前，將蜂蠟蠟燭大致地冷卻I至2周。蜂蠟蠟燭中的蠟來自不用化學品的農場。在蠟中沒有包含維生素E、胡桃油或動物副產物。
[0131]蠟燭在15°C的環境溫度下被存儲在密封的玻璃罐中數周，這個時間對于使粉霜顯現在蠟燭的表面上是足夠的。刮擦蠟燭并將刮擦物收集到由金屬蓋密封的玻璃容器中并于15°C存儲。刮擦蠟燭獲得的產物含有蜂蠟污染物，該蜂蠟污染物通過使用醇萃取來去除。還可以在采用或者未采用機械作用例如攪拌和/或超聲處理的情況下，通過施用水/乙醇混合物洗滌蜂蠟來從蜂蠟分離出蜜蜂粉霜。
[0132]從蜂蠟刮擦物將蜜蜂粉霜提取到Imm的70%乙醇和30%過濾水的混合物中。對溶液進行5次超聲處理，時間為I分鐘，在500rpm(約40克力)對所得的懸浮液離心3分鐘以除去大的顆粒物質。該顆粒物質主要是蜂蠟。收集懸浮液并以5001等分試樣儲存于_20°C。在本研究中使用的稀釋液和含有10mg/ml蜜蜂粉霜的基準母液為數納克(ng/ml ;109g/ml)級。在Krebs緩沖液中配制所有來自母液(懸浮液)的稀釋液。本研究所用的樣品量在表I中顯示。
[0133]表1.添加至毫升的有機浴液體積的蜜蜂粉霜的不同劑量的N-值。
[0134]

納克/mi In
【權利要求】
1.一種抗炎組合物，所述抗炎組合物包含蠟粉霜的提取物。
2.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物包含至少一種蛋白質、脂肪酸和肽。
3.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物包含約20重量％至30重量的以ωη-9脂肪酸計的總脂肪酸。
4.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物包含比率為約1.4至1.6:1的C16:0和C18:ln9。
5.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物包含比率為約5至7:1的C18:ln9和C18:3n3。
6.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物包含比率為約2.2至2.9:1的C16:0和總粗制蛋白質。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中，所述蠟粉霜衍生自蜂蠟。
8.一種用于預防或治療需要治療的動物中的炎癥疾病的方法，所述方法包括向所述動物施用治療有效量的包含蠟粉霜的提取物的組合物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述組合物包含至少一種蛋白質、脂肪酸和肽。
10.根據權利要求8所述的方法，其中，所述組合物包含約20重量％至30重量的以ωη-9脂肪酸計的總脂肪酸。
11.根據權利要求8所述 的方法，其中，所述組合物包含比率為約1.4至1.6:1的C16:0和 C18:ln9。
12.根據權利要求8所述的方法，其中，所述組合物包含比率為約5至7:1的C18:ln9和 C18:3n3。
13.根據權利要求8所述的方法，其中，所述組合物包含比率為約2.2至2.9:1的C16:0和總粗制蛋白質。
14.一種從蜂蠟中提取蜜蜂粉霜的方法，所述方法包括如下步驟:將蜜蜂粉霜溶解在水性溶劑中以制得蜜蜂粉霜溶液。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述蠟粉霜衍生自蜂蠟。
16.根據權利要求14所述的方法，其中在溶解之前，以粉末形式從所述蜂蠟的外部表面刮下蜜蜂粉霜，然后將所述蜜蜂粉霜懸浮在水性溶劑溶液中，并且隨后去除顆粒物質。
17.根據權利要求14所述的方法，其中，所述蜜蜂粉霜溶液中的蜜蜂粉霜的濃度為10mg/ml 以上。
18.根據權利要求14所述的方法，其中，所述水性溶劑是親水性的。
19.根據權利要求14所述的方法，其中，所述水性溶劑選自由包含如下物質組成的組:丙酮、醇、甲酸、乙酸、甲酰胺、BTX、二硫化碳、二甲基亞砜、四氯化碳、氯仿、醚、四氫呋喃、糠醛和己烷。
20.根據權利要求14所述的方法，其中，所述水性溶劑是水性醇。
21.根據權利要求14所述的方法，其中，水性溶劑是乙醇/水。
22.治療有效量的蜜蜂粉霜提取物在治療炎癥中的用途。
23.根據權利要求22所述的用途，其中，所述用途包括局部施用。
24.包含蜜蜂粉霜提取物的食物產品。
25.包含蜜蜂粉霜提取物的飲料。
26.包含蜜蜂粉霜提取物的營養藥物食品。
27.包含蜜蜂粉霜提取物的藥物制劑。
28.包含蜜蜂粉霜提取物的膳食補充劑。
29.包含蜜蜂粉霜提取物`的局部制劑。
【文檔編號】A61K35/64GK103491968SQ201280011990
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年1月6日 優先權日:2011年1月8日
【發明者】彭妮·科琳·凱恩, 羅納德·鄧肯·馬西森 申請人:彭妮·科琳·凱恩