用于調(diào)控電壓門控鈣通道功能的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供靶向電壓門控鈣通道的治療劑和包含所述治療劑的組合物，以及所述藥劑和組合物用以調(diào)控表達(dá)所述電壓門控鈣通道的造血細(xì)胞的功能的用途。本發(fā)明還提供篩選藥劑的方法，所述藥劑靶向給定電壓門控鈣通道且適用于作為治療劑用以調(diào)控表達(dá)所述經(jīng)靶向電壓門控鈣通道的細(xì)胞的活性。所述藥劑可為(例如)能夠結(jié)合到所述靶電壓門控鈣通道的胞外結(jié)構(gòu)域且因此能夠調(diào)控所述鈣通道的功能的抗體、適體、肽或小分子。
【專利說(shuō)明】用于調(diào)控電壓門控鈣通道功能的方法和組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及治療劑領(lǐng)域，且具體來(lái)說(shuō)涉及調(diào)控造血細(xì)胞中的電壓門控鈣通道(Cav)功能的治療劑和其篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鈣(Ca2+)離子在幾乎所有細(xì)胞類型中充當(dāng)通用的第二信使。電壓門控鈣(Cav)通道在各種細(xì)胞類型中引導(dǎo)Ca2+且由包含成孔α I亞單元以及至少ci2-亞單元、δ-亞單元、Y -亞單元和β -亞單元的復(fù)合物組成。現(xiàn)在已知Cav通道存在于許多不是傳統(tǒng)上認(rèn)為可應(yīng)激的細(xì)胞中，包括各種造血細(xì)胞。
[0003]在哺乳動(dòng)物中，已基于電生理學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)將10個(gè)Cav家族成員分成5個(gè)類別(L、P或Q、N、R、Τ)，每一者可能服務(wù)于不同的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
[0004]已經(jīng)對(duì)L型(長(zhǎng)時(shí)程)Cav通道在小鼠和人類T細(xì)胞中的表達(dá)和功能進(jìn)行了描述(庫(kù)特瑞(Kotturi)等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.) 278 =46949-46960(2003);庫(kù)特瑞和杰弗里斯(Jefferies)，分子免疫學(xué)(Mol.1mmunol.) 42:1461-1474(2005))。已知 L 型 Cav通道的四種亞型=CavL 1、0&￥1.2、0&￥1.3和0&￥1.4。已報(bào)導(dǎo)各種造血細(xì)胞中的L型Cav通道(關(guān)于評(píng)論，參見(jiàn)鈴木(Suzuki)等人，分子免疫學(xué)(Mo lec.1mmunol.) 47:640-648 (2010))。
[0005]已經(jīng)鑒別出CavL 4 (—種由Cacnalf編碼的a ICa2+通道亞單元)在嚙齒動(dòng)物和人類的視網(wǎng)膜、脾臟、胸腺、腎上腺、脊髓、骨髓、骨骼肌和T細(xì)胞中表達(dá)(巴杜(Badou)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PNAS USA) 103:15529-15534(2006);杰哈(Jha)等人，自然.免疫學(xué)(Nat.1mmunoUlO:1275-1282(2009);庫(kù)特瑞等人，2003，如前所述；庫(kù)特瑞和杰弗里斯，2005，如前所述；麥克洛瑞(McRory)等人，神經(jīng)科學(xué)雜志(J.Neurosc1.) 24:1707-1718(2004))。
[0006]已知鈣信號(hào)傳導(dǎo)在獲得性免疫中起到重要作用。還不清楚調(diào)節(jié)持續(xù)的Ca2+進(jìn)入T細(xì)胞的質(zhì)膜通道的特性和數(shù)量(庫(kù)特瑞等人，藥物科學(xué)趨勢(shì)(Trends Pharmacol.Sc1.) 27:360-367(2006))。一種已經(jīng)充分表征的進(jìn)入機(jī)制是通過(guò)Ca2+釋放激活鈣(CRAC)通道(歐.奧拉(Oh-hora)，免疫學(xué)評(píng)論(Immunol.Rev.) 231:210-224(2009))。在淋巴細(xì)胞中操作的其它候選質(zhì)膜Ca2+通道包括P2X受體、瞬時(shí)受體電位(TRP)陽(yáng)離子通道、TRP辣椒素通道、TRP麥勒他汀(melastatin)通道和電壓依賴性Ca2+通道(VDCC)。
[0007]已在人類T淋巴細(xì)胞中鑒別出CavL 4鈣通道的兩種剪接變體(庫(kù)特瑞和杰弗里斯，2005，如前所述)。已經(jīng)描述初始型⑶8+T淋巴細(xì)胞在缺少Cav通道的β 3亞單元下的缺陷性存活且此缺陷與CavL 4亞單元的耗盡相關(guān)聯(lián)(杰哈等人，2009，如前所述)。
[0008]提供此背景信息是出于使申請(qǐng)者所認(rèn)定的已知信息與本發(fā)明具有可能的相關(guān)性的目的。任何在前的信息均不應(yīng)被理解為或者解釋為對(duì)抗本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于調(diào)控電壓門控鈣通道功能的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于調(diào)控表達(dá)電壓門控鈣通道的細(xì)胞的功能的方法，其包含使所述細(xì)胞與特異性結(jié)合到所述電壓門控鈣通道的藥劑接觸，其中所述藥劑到所述電壓門控鈣通道的結(jié)合調(diào)控所述通道的活性且其中所述細(xì)胞是造血細(xì)胞。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于調(diào)控表達(dá)CavI剪接變體的細(xì)胞的活性的方法，其包含使所述細(xì)胞與特異性結(jié)合到所述CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑接觸，其中所述藥劑到所述CavI剪接變體的結(jié)合調(diào)控所述CavI剪接變體的活性且其中所述細(xì)胞是造血細(xì)胞。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供調(diào)控個(gè)體中的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的電壓門控鈣通道調(diào)控劑，其中所述調(diào)控劑結(jié)合到在造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道。 [0012]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供調(diào)控個(gè)體中的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的CavI調(diào)控劑，其中所述CavI調(diào)控劑結(jié)合到在造血細(xì)胞中表達(dá)的CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供篩選治療劑的方法，其包含以下步驟:使表達(dá)電壓門控鈣通道的造血細(xì)胞與測(cè)試藥劑接觸，以及測(cè)定所述測(cè)試藥劑是否調(diào)控所述通道的活性，其中將調(diào)控所述通道的活性的測(cè)試藥劑鑒別為治療劑。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供篩選治療劑的方法，其包含以下步驟:使表達(dá)CavI剪接變體的造血細(xì)胞與測(cè)試藥劑接觸，以及測(cè)定所述測(cè)試藥劑是否調(diào)控所述CavI剪接變體的活性，其中將調(diào)控所述CavI剪接變體的活性的測(cè)試藥劑鑒別為治療劑。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供特異性結(jié)合到在造血細(xì)胞(包括淋巴或骨髓系的細(xì)胞)中表達(dá)的電壓門控鈣通道的胞外結(jié)構(gòu)域以調(diào)控細(xì)胞功能的藥劑的用途。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供特異性結(jié)合到在T細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域以調(diào)控T細(xì)胞功能的藥劑的用途。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供阻抑個(gè)體中的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的CavL 4抑制劑，其中所述CavL 4抑制劑結(jié)合到在T細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供特異性結(jié)合到在B細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域以調(diào)控B細(xì)胞功能的藥劑的用途。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供阻抑個(gè)體中的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的CavL 4抑制劑，其中所述CavL 4抑制劑結(jié)合到在B細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供篩選免疫阻抑劑的方法，其包含以下步驟:使表達(dá)CavL 4剪接變體的T細(xì)胞與測(cè)試藥劑接觸，以及測(cè)定所述測(cè)試藥劑是否調(diào)控所述CavL 4剪接變體的活性，其中將抑制所述CavL 4剪接變體的活性的測(cè)試藥劑鑒別為免疫阻抑劑。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供篩選免疫阻抑劑的方法，其包含以下步驟:使表達(dá)CavL 4剪接變體的B細(xì)胞與測(cè)試藥劑接觸，以及測(cè)定所述測(cè)試藥劑是否調(diào)控所述CavL 4剪接變體的活性，其中將抑制所述CavL 4剪接變體的活性的測(cè)試藥劑鑒別為免疫阻抑劑。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供調(diào)控個(gè)體中的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的電壓門控鈣通道調(diào)控劑，其中所述調(diào)控劑結(jié)合到在造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]在下文說(shuō)明詳細(xì)中參照隨附圖，本發(fā)明的這些和其它特征將變得更顯而易見(jiàn)。
[0024]圖1.Cacnalf mRNA的表達(dá)。⑷野生型Cacna If mRNA在淋巴組織以及CD4+和⑶8+T細(xì)胞中的表達(dá)的檢測(cè)。(B)通過(guò)RT-PCR分析證實(shí)Cacnalf基因的破壞，在Cacnalf+(-/_)的Cacnalf胸腺轉(zhuǎn)錄物內(nèi)檢測(cè)到1xP位點(diǎn)(革巴向盒)，而在野生型(+/+)小鼠中未檢測(cè)到。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)S15轉(zhuǎn)錄物用作樣品加載對(duì)照。
[0025]圖2.CavL 4缺乏導(dǎo)致細(xì)微胸腺發(fā)育缺陷、⑶4+和⑶8+T細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少以及自發(fā)的T細(xì)胞免疫激活。(A)WT(+/+)和Cacnalf+(-/-)脾細(xì)胞的全細(xì)胞提取物中的CavL 4蛋白的免疫墨點(diǎn)分析。使用Weri視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為CavL 4-表達(dá)陽(yáng)性對(duì)照。提供GAPDH Ab染色作為樣品加載的對(duì)照。(B)將WT和Cacnalf+脾T細(xì)胞上的表面蛋白生物素化并利用抗生蛋白鏈菌素瓊脂糖珠粒進(jìn)行免疫沉淀。相等量的蛋白質(zhì)利用CavL 4Ab進(jìn)行墨點(diǎn)分析。同一墨點(diǎn)上的非特異性低分子大小條帶用于證實(shí)等量加載。(C)Cacnalf+胸腺表達(dá)減少部分的成熟SP胸腺細(xì)胞，通過(guò)針對(duì)TCRi3 hi和⑶241°細(xì)胞的電子門控所測(cè)定(百分?jǐn)?shù)展示在等值 線圖上的矩形門內(nèi))。(D)CavL 4缺乏使⑶4+對(duì)⑶8+SP胸腺細(xì)胞的比例減小。(E)WT(η = 6)和突變(η = 7)小鼠中存在的各種胸腺亞群的豐度是通過(guò)用⑶4和⑶8Ab染色來(lái)測(cè)定。(F)Cacnalf+小鼠的外周淋巴器官(包括脾臟、淋巴結(jié)(LN)和血液)顯示CD4+對(duì)CD8+T細(xì)胞的異常比率。在密度圖內(nèi)展示每一象限內(nèi)駐留的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(G)Cacnalf+小鼠的脾臟與WT相比展現(xiàn)極大地減少的T細(xì)胞(η≥6)和B細(xì)胞(η = 3)數(shù)量。I軸為對(duì)數(shù)標(biāo)尺。⑶急性激活和T細(xì)胞記憶的脾Cacnalf+CDf和⑶8+T細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物。誤差棒代表SD。< 0.01。
[0026]圖3.標(biāo)志物在胸腺細(xì)胞群上的表達(dá)。在野生型(灰色陰影)和Cacnalfl細(xì)黑色線)DP和成熟(TCRPhi)SP胸腺細(xì)胞亞群上表達(dá)的⑶44、⑶62L、TCR0和⑶69的數(shù)量。
[0027]圖4.Cacnalf+(-/_)小鼠的淋巴結(jié)(軸向淋巴結(jié)、臂淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的集合)與相比野生型(+/+)展現(xiàn)極大地減少的T細(xì)胞(η > 6)和B細(xì)胞(η=3)細(xì)胞構(gòu)成。誤差棒代表SD。**ρ < 0.01 ；***ρ < 0.001。
[0028]圖5.Cavl.4是初始型T細(xì)胞的TCR和毒胡蘿卜內(nèi)酯誘導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+的升高二者非常必需的。將WT(+/+ ;紅色線)和Cacnalf+G/-;藍(lán)色線)脾細(xì)胞加載Ca2+指示劑染料富洛4(Fluo-4)和富拉紅(Fura-Red)，進(jìn)行表面染色并懸浮于RPMI中。為最小化染料加載樣品中的變化的影響，將細(xì)胞內(nèi)Ca2+量以富洛4/富拉紅(FL-1/FL-3)隨時(shí)間的中值比繪制曲線。㈧用于辨別⑶441°和⑶44hiOT4+以及⑶8+T細(xì)胞的電子門控(框區(qū))指示于等值線圖內(nèi)。(B)脾細(xì)胞用毒胡蘿卜內(nèi)酯(Tg)刺激并通過(guò)在所指示時(shí)間點(diǎn)添加的EGTA螯合細(xì)胞外Ca2+。(C)在所指示時(shí)間(由箭頭標(biāo)示)下將用生物素化TCR Ab預(yù)涂布的脾T細(xì)胞用抗生蛋白鏈菌素(SA)或離子霉素(Im)處理。(D)在不存在游離細(xì)胞外Ca2+下執(zhí)行TCR刺激。向細(xì)胞懸浮液中添加足夠的EGTA (0.5mM)以螯合RPMI中的細(xì)胞外Ca2+(約0.4mMCa2+)，此阻斷細(xì)胞攝取。
[0029]圖6.CavL 4是在Ca2+限制期間TCR誘導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+的升高所必需的。(A)將加載有鈣指示劑染料富洛4和富拉紅并懸浮于RPMI中的野生型(+/+)和Cacnalf+(-/-)胸腺細(xì)胞(總體)在存在足以螯合RPMI中存在的Ca2+(約0.4mM)的細(xì)胞外EGTA(0.5mM)或不存在細(xì)胞外EGTA下用毒胡蘿卜內(nèi)酯(thapsigargin, Thapsi)刺激。為最小化染料加載樣品中的變化的影響，細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的量以FL-1/FL-3隨時(shí)間的比率繪制曲線。在所指示時(shí)間點(diǎn)下，在刺激的中途添加細(xì)胞外Ca2+(0.5mM)或EGTA(0.5mM)。⑶將經(jīng)⑶4和⑶8Ab染色用于辨別胸腺亞群的富洛4/富拉紅標(biāo)記的胸腺細(xì)胞在存在和不存在細(xì)胞外EGTA(0.5mM)下用TCR Ab激活。在第二次刺激的中途時(shí)，將細(xì)胞外Ca2+(0.5mM)或離子霉素(I μ g/mL)添加到樣品中。
[0030]圖7.L型CavL 4通道調(diào)介Ca2+進(jìn)入穿過(guò)初始型T細(xì)胞的質(zhì)膜。㈧呈現(xiàn)在TCR激活后針對(duì) WT(+/+，η = 7)和 Cacnalf+(-/- ；n = 5)CD44lQCD4+ 和 CD8+T 細(xì)胞記錄的樣品的內(nèi)向鋇電流跡線。細(xì)胞以500ms階躍脈沖從-80mV的保持電位去極化到+10mV。虛線指示電流測(cè)量的基線。⑶在+IOmV下在WT與Cacnal f+CDAfCDf以及CD8+T細(xì)胞之間的電流密度比較。將每一細(xì)胞的電流值正規(guī)化成電容值。(C)在+IOmV下在未經(jīng)處理的WT⑶441()T細(xì)胞(⑶4+Τ細(xì)胞，η = 8 KD8+T細(xì)胞，η = 8)與那些利用胞外結(jié)構(gòu)域特異性CavI α I亞單元Ab (⑶4+Τ細(xì)胞:η = 7 KD8+T細(xì)胞，η = 6)預(yù)處理的細(xì)胞之間的電流密度比較。(D)胞外結(jié)構(gòu)域特異性CavI α I亞單元Ab免疫沉淀CavL 4。利用胞外結(jié)構(gòu)域特異性CavI α I亞單元Ab對(duì)WT和Cacnalf+脾細(xì)胞提取物執(zhí)行免疫沉淀，隨后用CavL 4特異性Ab進(jìn)行墨點(diǎn)分析(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)程序)。同一墨點(diǎn)上的非特異性低分子大小條帶用于驗(yàn)證等量加載。(Ε和F)利用斜坡脈沖方案獲得WT⑶441°⑶4+和⑶8+T細(xì)胞在TCR激活后的樣品1-V關(guān)系。出于顯示目的，已將電流跡線經(jīng)濾波到1kHz。(E)中的頂部插圖展示在200ms內(nèi)從_80mV的保持電位跨越_130mV到70mV的范圍的斜坡脈沖方案。(E)和(F)中的實(shí)線指示全細(xì)胞1-V關(guān)系利用修改的玻爾茲曼方程(Boltzmann equation) I = G (V-Erev) / (1+exp ((Va-V) /S))的擬合，其中I是峰值電流幅值，G是最大的斜率電導(dǎo)，V是測(cè)試電位，Emv是反轉(zhuǎn)電位，Va是半激活電位，且S是斜率因子。(E)和(F)中的底部插圖代表從WT CD44l0CD4+(n = 5)和CD8+(n = 5) T細(xì)胞獲得的經(jīng)正規(guī)化1-V關(guān)系的平均值。(G和H)利用上述斜坡脈沖方案測(cè)定CacnalfvXDdf0OM+(η = 6)和CD8+(n = 6) T細(xì)胞的樣品1-V關(guān)系。誤差棒代表SEM0
*p <0.05。
[0031 ] 圖8.CavL 4功能調(diào)節(jié)Ras-ERK激活和NFAT動(dòng)員。(A)利用RAF-1-GST拉下實(shí)驗(yàn)(pull-down assay)測(cè)量 WT(+/+)和 Cacnalf+(-/-)胸腺細(xì)胞在用 TCR Ab 或 DAG 類似物PMA刺激后的經(jīng)激活Ras。將全細(xì)胞溶解產(chǎn)物(WCL)針對(duì)總Ras進(jìn)行免疫墨點(diǎn)分析以驗(yàn)證等量蛋白質(zhì)表達(dá)。(B)總體胸腺細(xì)胞用TCR Ab刺激達(dá)所指示時(shí)期。通過(guò)免疫墨點(diǎn)法測(cè)量ERK和JNK MAP激酶的磷酸化。利用奧德賽(Odyssey)軟件量化條帶強(qiáng)度并計(jì)算磷酸-ERK2/ERK2、磷酸-JNK1/JNK1的比率。未經(jīng)刺激的WT胸腺細(xì)胞任意地給定I的分?jǐn)?shù)。(C)為評(píng)價(jià)特定胸腺亞群中的ERK信號(hào)傳導(dǎo)，經(jīng)由流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定WT和Cacnalf+胸腺細(xì)胞在用TCR Ab或PMA處理來(lái)刺激達(dá)2分鐘之后的ERK激活。未經(jīng)刺激(灰色)、經(jīng)TCR刺激(黑色)和經(jīng)PMA處理(粗體)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)展示在每一柱狀圖內(nèi)。(D)將來(lái)自WT和Cacnalf+小鼠的胸腺細(xì)胞與⑶3和⑶28 Ab或僅培養(yǎng)基一起培育16小時(shí)。在核和細(xì)胞質(zhì)碎片和全細(xì)胞溶解產(chǎn)物(WCL)上執(zhí)行NFATcl的免疫墨點(diǎn)法。檢測(cè)磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)或組蛋白脫乙?；?1 (HDACl)作為加載對(duì)照。對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行量化并如上計(jì)算比率。[0032]圖9.T細(xì)胞對(duì)CavL 4功能的固有需求是正常T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需的。將經(jīng)輻照的受體宿主(Thyl.2+Ly5.1+)用 Cacnalf+(-/- ；Thyl.2+Ly5.2+)和野生型(+/+ ；Thyl.1+Ly5.2+)骨髓以1:1比率重構(gòu)。(A)評(píng)價(jià)Ly5.2+細(xì)胞在胸腺和脾臟中的起源(頂部圖板)。與野生型細(xì)胞(Thyl.1門)相比，Cacnalf+細(xì)胞(Thyl.2門)展示受體小鼠的存活降低。使用Thyl標(biāo)志物，鑒別供體淋巴細(xì)胞并測(cè)定⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的相對(duì)比例(中間和底部圖板)。在密度圖內(nèi)展示每一象限內(nèi)駐留的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(B)供體野生型T細(xì)胞對(duì)骨髓轉(zhuǎn)移I個(gè)月后的宿主小鼠的胸腺脾臟中存在的突變T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(η = 5)。誤差棒代表SD。
<0.001。(C)展示供體淋巴細(xì)胞群中的⑶441°以及⑶44htD4+和⑶8+T細(xì)胞的相對(duì)比例。在密度圖內(nèi)展示每一象限內(nèi)駐留的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
[0033]圖10.CavL 4是初始型T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑。(A)⑶44在來(lái)自WT(+/+)和Cacnalf+ (-/-)小鼠的脾CD4+TCRβ +和CD8+TCRβ +T細(xì)胞上的表達(dá)。⑶Cacnalf+小鼠展現(xiàn) CD44lQCD4+ 和 CD8+TCR β +T 細(xì)胞的明顯減少。(C) Cacnalf+QMfOM+ 和 CD8+TCR β +T 細(xì)胞展示自發(fā)性細(xì)胞凋亡的比率增加。(D)⑶62L在⑶441°⑶4+和⑶8+TCR β +T細(xì)胞上的表達(dá)。(E) Cacnalf+OMPCDf 和 CD8+TCRβ +T 細(xì)胞表達(dá)減小量的 IL-7R α。(F)由 CD44loCD4+ 和⑶8+TCRi3 +T細(xì)胞表達(dá)的Bcl-2是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量。誤差棒代表SD。
[0034]圖11.(A)Cacnalf+(_/-)CD4+TCRPhi 和 CD8+TCRPhiSP 胸腺細(xì)胞相對(duì)于野生型(+/+)展示自發(fā)性細(xì)胞凋亡的比率增加。展示在所指示門內(nèi)存在的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(B)野生型(灰色陰影)和Cacnalf + (細(xì)黑色線)⑶4+TCR β hi和⑶8+TCR β hiSP胸腺細(xì)胞上的⑶127的量。在柱狀圖內(nèi)展示野生型(頂部)和突變?nèi)?底部)的平均熒光強(qiáng)度。
[0035]圖12.CavL 4促進(jìn)存活信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)的T細(xì)胞擴(kuò)增。㈧將WT(+/+)和Cacnalf^(-/-)胸腺細(xì)胞用所指示濃度的IL_7刺激5分鐘且隨后針對(duì)磷酸化STAT5的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定磷酸-STAT5陽(yáng)性成熟⑶4+和⑶8+SP胸腺細(xì)胞的頻率。(B)通過(guò)細(xì)胞分選純化WT (Thyl.1+)和Cacnalf+(Thy1.1-)初始型CD4+和CD8+T細(xì)胞(如圖5A中所示的以電子方式門控(⑶441。))，以1:1:1:1比率混合并與所指示濃度的IL-7 一起培育。培育24小時(shí)之后，通過(guò)用偶聯(lián)到Alexa 647的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V染色來(lái)測(cè)定細(xì)胞存活。(C)將WT和突變初始型T細(xì)胞分離，準(zhǔn)備，并如(B)中一樣培養(yǎng)，只是用TCR Ab而非IL-7刺激。離體培養(yǎng)24小時(shí)后評(píng)價(jià)生存力。(D F)將來(lái)自WT(Thyl.1+)和Cacnalf+(Thyl.1_)小鼠的初始型T細(xì)胞純化，以1:1:1:1比率混合，經(jīng)CFSE標(biāo)記，并共同注射到Ragl+宿主中。(D)展示注射之前WT和Cacnalf+CDf和CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(E)CFSE稀釋指示轉(zhuǎn)移T細(xì)胞的增殖。點(diǎn)圖內(nèi)的框區(qū)域指示由自身-MHC分子和IL-7 (內(nèi)穩(wěn)態(tài))驅(qū)動(dòng)的增殖。(F)柱狀圖指示W(wǎng)T和突變供體CD4+和CD8+T細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)增殖。
[0036]圖13.CavL 4是最優(yōu)化抗原特異性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答非常必需的。用重組單核細(xì)胞增多性利斯特菌(L.monocytogenes) -OVA轉(zhuǎn)染后7天，將WT (+/+)和Cacnalf+(-/-)小鼠處死并評(píng)價(jià)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。(A)在密度圖內(nèi)展示CD8+T細(xì)胞群中⑶44+H-2Kb-0VA四聚體+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(B)代表抗原特異性⑶44+⑶8+T細(xì)胞的平均數(shù)(η = 3)。(C和D)將來(lái)自感染小鼠的脾細(xì)胞用MHC I類(0VA257_264)和MHCII類(LLO19ch2ci1)-限制肽刺激且隨后針對(duì)IFN-Y分泌進(jìn)行分析。為測(cè)定能夠分泌IFN-Y的T細(xì)胞的頻率，脾細(xì)胞單獨(dú)地僅用TCR Ab刺激。密度圖內(nèi)的數(shù)值代表分泌IFN-Y的CD4+或CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(E)累積數(shù)據(jù)指示W(wǎng)T和Cacnalf+小鼠(η = 3)中抗原特異性產(chǎn)生IFN- Y的T細(xì)胞的平均數(shù)。(F)將來(lái)自感染小鼠的脾臟的CD8+T細(xì)胞純化并與未經(jīng)處理或經(jīng)OVA257_264肽脈沖處理的51Cr標(biāo)記的RMA-S靶一起培育。誤差棒代表SD。= 0.05 ；***p
<0.001。
[0037]圖14.CavI利用阻斷抗體進(jìn)行抑制使細(xì)胞存活減小。將C57B1/6脾細(xì)胞在有(+CavI)或沒(méi)有(-Cavl)Cavl抗體的情況下培育。24小時(shí)之后，通過(guò)用膜聯(lián)蛋白V染色評(píng)價(jià)生存力。將存活指數(shù)計(jì)算為膜聯(lián)蛋白V陰性細(xì)胞對(duì)膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞的比率。誤差棒代表 SD0 *p < 0.05 ；**p < 0.01。
[0038]圖15.CavI利用阻斷抗體進(jìn)行抑制使得CD8+和CD4+T細(xì)胞增殖減小。C57B1/6脾細(xì)胞用CFSE標(biāo)記并利用板結(jié)合CD3 ε (20 μ g/ml)和CD28 (5 μ g/ml)抗體在有(+CavI)或沒(méi)有(-CavI) CavI抗 體的情況下激活5天。通過(guò)CFSE稀釋評(píng)價(jià)增殖。數(shù)值代表增殖細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
[0039]圖16呈現(xiàn)人類電壓依賴性L型鈣通道亞單元a -1F (CavL 4)(基因庫(kù)(GenBank)登錄號(hào)ΝΡ_005174)的氨基酸序列。
[0040]圖17呈現(xiàn)人類電壓依賴性L型鈣通道亞單元α -1F剪接變體(Cavl.4a)的核苷酸序列。
[0041]圖18呈現(xiàn)人類電壓依賴性L型鈣通道亞單元a-1F剪接變體(CavL 4b)的核苷酸序列。
[0042]圖19呈現(xiàn)㈧CavL 4a剪接變體和⑶CavL 4b剪接變體的預(yù)計(jì)膜拓?fù)涞氖疽庑员?br> /Jn ο
[0043]圖20呈現(xiàn)人類電壓依賴性L型鈣通道亞單元α -1F剪接變體(Cavl.4a)的氨基酸序列。
[0044]圖21呈現(xiàn)人類電壓依賴性L型鈣通道亞單元α -1F剪接變體(Cavl.4b)的氨基酸序列。
[0045]圖22.CavL 4缺乏的小鼠展示骨髓中正常B淋巴細(xì)胞發(fā)育。
[0046]圖23.CavL 4缺乏的小鼠展示改變的脾B淋巴細(xì)胞成熟。
[0047]圖24.Cavl.4缺乏導(dǎo)致改變的腹膜腔B細(xì)胞區(qū)室。
[0048]圖25.細(xì)胞固有的Cavl.4功能是正常B細(xì)胞發(fā)育所必需的。
[0049]圖26.CavL 4缺乏導(dǎo)致B細(xì)胞中受損的B細(xì)胞受體和毒胡蘿卜內(nèi)酯誘導(dǎo)的Ca2+應(yīng)答。
[0050]圖27.Cavl.4缺乏導(dǎo)致受損的B細(xì)胞受體誘導(dǎo)的線粒體Ca2+應(yīng)答。
[0051]圖28.CavL 4缺乏的B細(xì)胞展示缺陷性B細(xì)胞受體介導(dǎo)的激活。
[0052]圖29.CavL 4缺乏的B細(xì)胞展示減少的B細(xì)胞受體誘導(dǎo)的增殖。
[0053]圖30.Cavl.4缺乏的脾B細(xì)胞展示B細(xì)胞激活因子(BAFF)受體的減少的表達(dá)和響應(yīng)BAFF的較低的存活率。
[0054]圖31.CavL 4缺乏的小鼠在用TNP-聚蔗糖(Ficoll)( 一種T細(xì)胞非依賴性2型抗原)免疫后產(chǎn)生受損的抗體應(yīng)答。
【具體實(shí)施方式】[0055] 本發(fā)明涉及本文所描述的以下發(fā)現(xiàn):調(diào)控電壓門控鈣通道(例如L型鈣通道α I亞單元(CavI))的活性和/或表達(dá)可修飾表達(dá)所述通道的細(xì)胞的活性。由于不同的細(xì)胞類型表達(dá)不同類型的電壓門控鈣通道，因此藥劑可經(jīng)設(shè)計(jì)以靶向由所關(guān)注的細(xì)胞類型表達(dá)的電壓門控鈣通道且可用于特定地調(diào)控這些細(xì)胞的活性。舉例來(lái)說(shuō)，由于不同的細(xì)胞類型表達(dá)CavI的不同亞型和剪接形式，因此藥劑可經(jīng)設(shè)計(jì)以靶向由所關(guān)注的細(xì)胞類型表達(dá)的剪接變體且可用于特定地調(diào)控這些細(xì)胞的活性。
[0056]電壓門控鈣通道(包括(但不限于)CavI通道)可利用結(jié)合到鈣通道的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑靶向以調(diào)控所述鈣通道的功能，且因此修飾表達(dá)所述通道的細(xì)胞的活性。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供靶向電壓門控鈣通道的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑和所述藥劑用以調(diào)控表達(dá)電壓門控鈣通道的細(xì)胞的功能的用途。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供靶向CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑和所述藥劑用以調(diào)控表達(dá)所靶向剪接變體的細(xì)胞的功能的用途。本發(fā)明的某些實(shí)施例還提供篩選藥劑的方法，所述藥劑靶向給定電壓門控鈣通道且適于作為治療劑用以調(diào)控表達(dá)所述鈣通道的細(xì)胞的活性。舉例來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明的某些實(shí)施例中提供篩選藥劑的方法，所述藥劑靶向給定CavI剪接變體(“Cavl調(diào)控劑”)且適于作為治療劑用以調(diào)控表達(dá)所靶向剪接變體的細(xì)胞的活性。藥劑可為(例如)能夠結(jié)合到所述靶電壓門控鈣通道(包括(但不限于)CavI剪接變體)的胞外結(jié)構(gòu)域且因此調(diào)控所述鈣通道的功能的抗體、適體或小分子。在某些實(shí)施例中，所述方法、用途和組合物涉及在造血細(xì)胞(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞和/或自然殺傷細(xì)胞)中表達(dá)的電壓門控鈣通道。在某些實(shí)施例中，所述方法、用途和組合物涉及在造血細(xì)胞(例如T細(xì)胞和/或B細(xì)胞)中表達(dá)的CavI剪接變體。
[0057]以實(shí)例的方式，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供靶向在T細(xì)胞中表達(dá)的CavI剪接變體(例如CavL 4)的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑和此藥劑用于調(diào)控T細(xì)胞活性的用途。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供靶向在B細(xì)胞中表達(dá)的CavI剪接變體(例如CavL 4)的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑和此藥劑用于調(diào)控B細(xì)胞的活性的用途。
[0058]靶向在一種或一種以上類型的造血細(xì)胞(包括(但不限于)淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞)中表達(dá)的電壓門控鈣通道且抑制所述通道的活性的藥劑可用作(例如)免疫阻抑劑，所述免疫阻抑劑已發(fā)現(xiàn)在(例如)在治療自體免疫疾病、降低移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)和在治療其它需要阻抑免疫系統(tǒng)的病癥(例如治療過(guò)敏)中的應(yīng)用。舉例來(lái)說(shuō)，靶向在T細(xì)胞和/或B細(xì)胞中表達(dá)的CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域且抑制所述通道的活性的藥劑可用作(例如)免疫阻抑劑，所述免疫阻抑劑已發(fā)現(xiàn)在(例如)治療自體免疫疾病、降低移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)和在治療其它需要阻抑免疫系統(tǒng)的病癥中的應(yīng)用。在另一實(shí)例中，靶向并抑制在肥大細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道的藥劑可抑制肥大細(xì)胞脫粒且因此可用于治療過(guò)敏。
[0059]在某些其它實(shí)施例中，提供用以刺激電壓門控鈣通道(包括(但不限于)0^1通道)的活性的藥劑和方法。所述藥劑和方法可用于治療癌癥和/或治療免疫阻抑。
[0060]在某些其它實(shí)施例中，提供增加或降低電壓門控通道在細(xì)胞中的表達(dá)的藥劑和方法。舉例來(lái)說(shuō)，可使用表達(dá)電壓門控通道(包括(但不限于)CavI通道)的多核苷酸和包含這些多核苷酸的載體用以增加CavI通道的表達(dá)。
[0061]或者，可使用表達(dá)特異性針對(duì)電壓門控鈣通道(包括(但不限于)CavI通道)的反義的多核苷酸用以降低所述通道的表達(dá)。
[0062]定義
[0063]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所了解含義相同的含義。
[0064]本文參照CavI剪接變體所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指特異性結(jié)合到CavI剪接變體或以免疫方式與其反應(yīng)的免疫球蛋白分子(或其組合)，且其包括抗體的多克隆、單克隆、基因改造和以其它方式修飾的形式，包括(但不限于)嵌合抗體、人源化抗體、異源偶聯(lián)抗體(例如雙特異性抗體、雙抗體、 三抗體和四抗體)、單鏈Fv抗體(scFv)、至少含有免疫球蛋白的足以將特異性抗原結(jié)合賦予CavI剪接變體的部分的多肽和抗體的抗原結(jié)合片段?？贵w片段包括蛋白水解抗體片段(例如F(ab' ) 2片段、Fab'片段、Fab' -SH片段、Fab片段、Fv和rlgG)、重組抗體片段(例如sFv片段、dsFv片段、雙特異性sFv片段、雙特異性dsFv片段、雙抗體和三抗體)、互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)片段，駱駝抗體(參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利第6，015，695 號(hào)；第 6，005，079 號(hào)；第 5，874，541 號(hào)；第 5，840，526 號(hào)；第 5，800，988 號(hào)；和第5，759，808號(hào))和由軟骨和硬骨魚類產(chǎn)生的抗體以及其分離的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)(例如)國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)案第W003014161號(hào))。
[0065]本文所用的術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指包含來(lái)自一種宿主物種的所有或一部分的可變區(qū)連接到來(lái)自另一宿主物種的恒定區(qū)的至少一部分的多肽。
[0066]本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指包含人類抗體的經(jīng)修飾可變區(qū)的多肽，其中所述可變區(qū)的一部分已經(jīng)來(lái)自非人類物種的對(duì)應(yīng)序列取代且其中所述經(jīng)修飾可變區(qū)連接到人類抗體的恒定區(qū)的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施例中，所述可變區(qū)的所述部分是所有或一部分的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。所述術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)將非人類抗體的可變區(qū)或一個(gè)或一個(gè)以上CDR用異源蛋白剪接產(chǎn)生的雜交抗體，無(wú)論物種起源、蛋白質(zhì)類型、免疫球蛋白類別或亞類的名稱如何，只要雜交抗體展現(xiàn)所要的生物活性(即，特異性結(jié)合CavI蛋白質(zhì)的能力)即可。
[0067]本文所用的術(shù)語(yǔ)“雙特異性抗體”是指包含具有針對(duì)一個(gè)抗原位點(diǎn)的特異性的第一臂和具有針對(duì)不同的抗原位點(diǎn)的特異性的第二臂的抗體，即，雙功能抗體具有雙重特異性。
[0068]本文所用的術(shù)語(yǔ)“抑制”意指降低或阻止給定活性或功能。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，當(dāng)在藥劑的存在下產(chǎn)生的活性或功能的水平與在不存在所述藥劑下的所述水平相比降低至少10%時(shí)，那么認(rèn)為所述藥劑抑制所述活性或功能。在一些實(shí)施例中，當(dāng)在藥劑的存在下產(chǎn)生的活性或功能的水平與在不存在所述藥劑下的所述水平相比降低至少20% (例如至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%或至少80% )時(shí)，那么認(rèn)為所述藥劑抑制所述活性或功能。
[0069]術(shù)語(yǔ)“療法”和“治療”在本文中可互換使用，是指所執(zhí)行具有改良個(gè)體的狀態(tài)的目的的干預(yù)。改良可為主觀的或客觀的且涉及改善與所治療疾病相關(guān)聯(lián)的癥狀、預(yù)防所治療疾病的發(fā)展或改變所治療疾病的病理。因此，術(shù)語(yǔ)療法和治療以最廣泛意義使用，且包括預(yù)防(預(yù)防性)、緩解、減少和治愈處于各個(gè)階段的疾病。所述術(shù)語(yǔ)也涵蓋預(yù)防個(gè)體的狀態(tài)的惡化。因此，需要療法/治療的個(gè)體包括那些已經(jīng)患有疾病的個(gè)體以及那些易于或處于發(fā)展疾病的個(gè)體和那些打算預(yù)防疾病的個(gè)體。[0070]術(shù)語(yǔ)“改善”包括阻止、預(yù)防、降低或改良所治療疾病或病癥的癥狀、征象和特征中的一者或一者以上，無(wú)論是暫時(shí)地還是長(zhǎng)期的。
[0071]本文所用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”和“患者”是指需要治療的動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物或人類。
[0072]本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”是指從給定值變化大約+/_10%。應(yīng)了解，無(wú)論是否特別指出，此變化總是包括在本文所提供的任何給定值中。
[0073]當(dāng)在本文中介詞“一 (a或an) ”與術(shù)語(yǔ)“包含”組合使用時(shí)，介詞“一”的使用可意指“一個(gè)”，但也與“一個(gè)或一個(gè)以上”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或一個(gè)以上”的意義一致。
[0074]本文所用的詞語(yǔ)“包含(comprising) ”(和其語(yǔ)法變異，例如“comprise”和“comprises”)、“具有(having) ”(和其語(yǔ)法變異，例如“have”和“has”)、“包括(including) ”(和其語(yǔ)法 變異,例如“includes”和“include”)或“含有(containing) ”(和其語(yǔ)法變異，例如“contains”和“contain”)是包括式的和開(kāi)放式的且并不排除額外的、未列舉的元件或方法步驟。
[0075]預(yù)期本文所討論的任一實(shí)施例均可根據(jù)本發(fā)明的任一方法、用途或組合物來(lái)實(shí)施，且反之亦然。另外，可使用本發(fā)明的組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法和用途。
[0076]電壓門控鈣通道
[0077]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用于本文所描述的藥劑、用途和方法的靶蛋白是人類電壓依賴性鈣通道。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，用于本文所描述的藥劑、用途和方法的靶蛋白是在造血細(xì)胞中表達(dá)的人類電壓依賴性鈣通道。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，用于本文所描述的藥劑、用途和方法的靶蛋白是人類電壓依賴性L型鈣通道亞單元α-1 (CavI)。電壓門控鈣通道表達(dá)于各種細(xì)胞類型中。舉例來(lái)說(shuō)，CavI表達(dá)于許多不同的組織中，包括視網(wǎng)膜、脾臟、胸腺、腎上腺、脊髓、骨髓和骨骼肌。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，用于本文所描述的藥劑、用途和方法的靶蛋白是在造血細(xì)胞(例如來(lái)自骨髓系的細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞和樹突細(xì)胞)和來(lái)自淋巴系的細(xì)胞(包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞))中表達(dá)的電壓門控鈣通道，包括(但不限于)CavI剪接變體(例如，CavL 1、CavL 2、CavL 3或CavL 4剪接變體)。
[0078]各種電壓門控鈣通道(包括(但不限于)CavI的亞型(CavL 1、CavL 2、CavL 3和CavL 4))的氨基酸序列已在所屬領(lǐng)域中已知且可從基因庫(kù)和文獻(xiàn)中獲得，這些蛋白質(zhì)的各種剪接形式的氨基酸序列也如此。
[0079]舉例來(lái)說(shuō)，Cav1.4的視網(wǎng)膜形式在基因庫(kù)中以登錄號(hào)ΝΡ_005174列為參考序列(圖16)。已經(jīng)鑒別出此蛋白質(zhì)的各種剪接形式，包括CavL 4a和CavL 4b，這些是在T細(xì)胞中表達(dá)的(庫(kù)特瑞和杰弗里斯，2005，分子免疫學(xué)42 =1461-1474)。CavL 4a和CavL 4b的序列在本文中分別作為圖20和21提供(還參見(jiàn)圖17和18，其分別提供CavL 4a和CavL 4b的核苷酸序列))。
[0080]如果在所關(guān)注的細(xì)胞類型中表達(dá)的電壓門控鈣通道(包括(但不限于)CavI剪接變體)的序列還是未知的，那么可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知和各種一般文章中所描述的方法容易地測(cè)定(參見(jiàn)例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第 3 版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),2001;奧蘇貝爾(Ausubel)等人，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols inMolecular Biology),威立約翰(J.Wiley & Sons),紐約(New York, NY), 1992 (和 2000年的增刊)；奧蘇貝爾等人，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南:最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南的方法匯編(Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology),第 4 版，威立約翰(Wiley & Sons)，1999)。舉例來(lái)說(shuō)，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從攜載所關(guān)注的細(xì)胞類型的組織產(chǎn)生cDNA文庫(kù)?；蛘?，可從各個(gè)商業(yè)供應(yīng)商(例如克隆技術(shù)(Clontech),加利福尼亞州帕羅奧多(Palo Alto, Ca.);英杰公司(Invitrogen),加利福尼亞州卡爾斯巴德(Carlsbad, Ca.))中的一者獲得cDNA文庫(kù)。編碼電壓門控鈣通道(包括(但不限于)所關(guān)注的CavI亞型)的序列可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方法分離，例如通過(guò)利用PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)，例如涉及使用PCR或嵌套式PCR使用來(lái)自3’和5’端的共用引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物的深度測(cè)序。
[0081]在某些實(shí)施例中，涵蓋使用啟迪(Illumina) ? DNA測(cè)序技術(shù)(啟迪公司，加利福尼亞州圣地亞哥(San Diego，Ca.))來(lái)鑒別在所關(guān)注的細(xì)胞類型中表達(dá)的電壓門控鈣通道，包括(但不限于)CavI剪接變體。此技術(shù)提供經(jīng)由有效且基于目標(biāo)群的策略用于評(píng)價(jià)剪接變化的高通量、成本有效的途徑。 [0082]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，治療劑靶向CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)預(yù)測(cè)CavI的拓?fù)?包括鑒別胞外結(jié)構(gòu)域)(參見(jiàn)(例如)庫(kù)特瑞等人，(2006)，如前所述和鈴木等人，(2010)，如前所述)。
[0083]已經(jīng)鑒別出CavI的某些剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)提出的剪接變體CavL 4a和CavL 4b的通道拓?fù)?庫(kù)特瑞和杰弗里斯(2005)如前所述)且展示于圖19A和B中。
[0084]需要時(shí)，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測(cè)計(jì)算方法鑒別所選剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)(例如)考利甘(Coligan)等人，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，約翰威立，紐約)。或者，可通過(guò)各種表面映射技術(shù)鑒別胞外結(jié)構(gòu)域，例如通過(guò)將抗體能夠結(jié)合到表達(dá)CavI剪接變體的未透性化細(xì)胞針對(duì)來(lái)自CavI剪接變體的肽文庫(kù)進(jìn)行比較以測(cè)定由抗體結(jié)合的肽表位，由此鑒別在細(xì)胞的表面處發(fā)現(xiàn)的剪接變體的序列。
[0085]在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，用于本文所描述的藥劑、用途和方法的靶蛋白是在淋巴系的造血細(xì)胞(包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)中表達(dá)的CavI剪接變體。在一些實(shí)施例中，用于本文所描述的藥劑、用途和方法的靶蛋白是在造血細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體。在一些實(shí)施例中，用于本文所描述的藥劑、用途和方法的靶蛋白是在淋巴系的造血細(xì)胞(包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)中表達(dá)的CavL 4剪接變體。
[0086]治療劑
[0087]本發(fā)明的一個(gè)方面提供調(diào)控電壓門控鈣通道的表達(dá)或活性的治療劑。在某些實(shí)施例中，提供調(diào)控在造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道的表達(dá)或活性的治療劑。在某些實(shí)施例中，提供調(diào)控Cavl( “Cavl調(diào)控劑”)的表達(dá)或活性的治療劑。在某些實(shí)施例中，治療劑結(jié)合到CavI并調(diào)控其活性。根據(jù)某些實(shí)施例，治療劑靶向CavI蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域且因此作用于細(xì)胞的表面處。適宜治療劑的實(shí)例包括(但不限于)抗體、適體、合成抗體、合成抗體取代物、多肽、肽和小分子治療劑。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供靶向CavI并調(diào)控其活性且為“生物制劑”的治療劑，例如抗體、適體、抑制肽等。在一個(gè)實(shí)施例中，多核苷酸或載體表達(dá)治療劑，例如抗體、適體、多肽和肽。
[0088]在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，治療劑是抑制電壓門控鈣通道的活性的藥劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，治療劑是抑制CavI的活性的藥劑(“Cavl抑制劑”)。這些藥劑可結(jié)合到CavI并抑制其活性。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，治療劑是激活電壓門控鈣通道的活性的藥劑。在一些實(shí)施例中，治療劑是激活CavI的活性的藥劑(“Cavl激活劑”)。這些藥劑可結(jié)合到CavI并激活其活性。
[0089]在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，治療劑是選擇性結(jié)合靶電壓門控鈣通道的抗體。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，治療劑是選擇性結(jié)合靶CavI剪接變體的抗體?？贵w可選擇性結(jié)合靶CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。本文所用的術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”是指一種化合物到另一種化合物(例如，抗體到CavI蛋白)的特異性結(jié)合，其中如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分析(例如，免疫分析)所測(cè)量，結(jié)合水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯高于分析的背景對(duì)照。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)執(zhí)行免疫分析時(shí)，對(duì)照可包括僅含有抗體的反應(yīng)孔/試管(例如，在不存在靶蛋白下)，其中將抗體在不存在靶蛋白下的反應(yīng)性(例如，非特異性結(jié)合到孔/試管)的量視為背景。
[0090]結(jié)合可使用所屬領(lǐng)域的各種方法標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)量，包括(但不限于)西方墨點(diǎn)法(Western blot)、免疫墨點(diǎn)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(MA)、免疫沉淀法、表面等離子體共振、化學(xué)發(fā)光法 、熒光偏振法、磷光法、免疫組織化學(xué)分析、基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、微細(xì)胞計(jì)量術(shù)、微陣列、顯微術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)和流式細(xì)胞術(shù)。
[0091]特異性結(jié)合到電壓門控鈣通道(例如CavI剪接變體)的抗體可通過(guò)所屬領(lǐng)域已知的各種標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)產(chǎn)生。例如，多克隆抗體可通過(guò)將CavI剪接變體或其片段投與給適宜的宿主動(dòng)物(例如兔、小鼠、大鼠等)以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有特定針對(duì)所投與蛋白質(zhì)的多克隆抗體的血清來(lái)產(chǎn)生。如果需要增加免疫應(yīng)答，則可視宿主物種而定使用所屬領(lǐng)域中已知的各種佐劑，且包括(但不限于)弗氏(Freund)佐劑(完全和不完全)、礦物膠(氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂)、普流尼克(pluixmic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、鑰孔戚血藍(lán)素(keyhole limpet hemocyanin)、二硝基苯釀、BCG (卡介苗，bacille Calmette-Guerin)和短小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)。
[0092]單克隆抗體可通過(guò)(例如)使用雜交瘤、重組或噬菌體顯示技術(shù)或其組合來(lái)制備。舉例來(lái)說(shuō)，單克隆抗體可使用雜交瘤技術(shù)來(lái)產(chǎn)生，例如在哈洛(Harlow)等人,抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies:A Laboratory Manual)，(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),第2版，1988);哈默林(Hammerling)等人,在單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas) 563-681 (愛(ài)思維爾(Elsevier),紐約(N.Y.)，1981)中所教示的那些。
[0093]以實(shí)例的方式，小鼠可利用CavI剪接變體或其片段或表達(dá)CavI剪接變體或片段的細(xì)胞進(jìn)行免疫。一旦(例如)通過(guò)檢測(cè)特異性針對(duì)CavI剪接變體或片段的抗體在小鼠血清中檢測(cè)到免疫應(yīng)答，即可收獲小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞。接著通過(guò)熟知的技術(shù)將脾細(xì)胞融合到適宜骨髓瘤細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋選擇并克隆雜交瘤。接著通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方法針對(duì)分泌能夠結(jié)合CavI剪接變體或片段的抗體的細(xì)胞分析雜交瘤克隆。一般含有高水平的抗體的腹水可通過(guò)將小鼠用陽(yáng)性雜交瘤克隆。
[0094]識(shí)別電壓門控鈣通道(例如CavI剪接變體)的特異性表位的抗體片段可通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)使用諸如木瓜蛋白酶(用以產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(用以產(chǎn)生F(ab' ) 2片段)等酶來(lái)使免疫球蛋白分子溶蛋白性裂解來(lái)產(chǎn)生Fab和F (ab' )2片段。F(ab' )2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CHl結(jié)構(gòu)域。
[0095] 舉例來(lái)說(shuō)，抗體也可使用所屬領(lǐng)域中已知的各種噬菌體顯示方法來(lái)產(chǎn)生。在噬菌體顯示方法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域顯示于噬菌體粒子的表面上，所述噬菌體粒子攜帶編碼其的多核苷酸序列。此噬菌體可用于顯示從譜型或組合抗體文庫(kù)(例如人類或鼠可動(dòng)物)表達(dá)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。表達(dá)結(jié)合CavI剪接變體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體可使用(例如)經(jīng)標(biāo)記蛋白或結(jié)合或捕獲到固體表面或珠粒的片段或蛋白質(zhì)或片段利用CavI剪接變體或其片段來(lái)選擇或鑒別。這些方法中所用的噬菌體通常是包括從噬菌體表達(dá)的fd和M13結(jié)合結(jié)構(gòu)域的絲狀曬菌體,所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Fab、Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體結(jié)構(gòu)域重組融合成噬菌體基因III蛋白或基因VIII蛋白?？墒褂玫氖删w顯示方法的實(shí)例包括(例如)那些描述于以下中者:布林克曼(Brinkman)等人，免疫法雜志(J.1mmunol.Methods) 182:41-50(1995);艾姆斯(Ames)等人，免疫法雜志 184:177-186(1995);凱特波勒(Kettleborough)等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.1mmunol.) 24:952-958 (1994);帕斯(Persic)等人,基因(Gene) 187 9-18(1997);波頓(Burton)等人，免疫學(xué)進(jìn)展(Advancesin Immunology) 57:191-280(1994);國(guó)際專利申請(qǐng)案第PCT/GB91/01134號(hào)；國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)案第 WO 90/02809 號(hào)；第 WO 91/10737 號(hào)、第 WO 92/01047 號(hào)、第 WO 92/18619 號(hào)、第WO 93/11236號(hào)、第WO 95/15982號(hào)和第WO 95/20401號(hào)；以及美國(guó)專利第5，698，426號(hào)；第 5，223，409 號(hào)；第 5，403，484 號(hào)；第 5，580，717 號(hào)；第 5，427，908 號(hào)；第 5，750，753 號(hào)；第 5，821，047 號(hào)；第 5，571，698 號(hào)；第 5，427，908 號(hào)；第 5，516，637 號(hào)；第 5，780，225 號(hào)；第5，658，727 號(hào)；第 5，733，743 號(hào)和第 5，969，108 號(hào)。
[0096]噬菌體選擇之后，可分離來(lái)自噬菌體的抗體編碼區(qū)并用于產(chǎn)生全抗體(包括人類抗體)或所要抗原結(jié)合片段，并表達(dá)于適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌。舉例來(lái)說(shuō)，以重組方式產(chǎn)生Fab、Fabi和F(ab' )2片段的技術(shù)描述于國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)案第WO 92/22324號(hào)；馬利納克斯(Mullinax)等人，生物技術(shù)(BioTechniques) 12 (6) =864-869(1992);沙懷(Sawai)等人，美國(guó)生殖免疫學(xué)雜志(AJRI) 34:26-34(1995);和貝特爾(Better)等人，科學(xué)(Science) 240:1041-1043 (1988)中。
[0097]可用于產(chǎn)生單鏈Fv和抗體的技術(shù)的實(shí)例包括在美國(guó)專利第4，946，778號(hào)和第 5，258, 498 號(hào)；休斯頓(Huston)等人，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology) 203:46-88(1991);舒(Shu)等人，國(guó)家科學(xué)院院刊(PNAS) 90:7995-7999 (1993);和斯卡拉(Skerra)等人，科學(xué)240:1038-1040 (1988)中描述的那些。
[0098]產(chǎn)生嵌合抗體的方法已為所屬領(lǐng)域得知。舉例來(lái)說(shuō)，參見(jiàn)莫里森(Morrison)，科學(xué)229 =1202(1985);奧伊(Oi)等人，生物技術(shù)4:214 (1986);吉利斯(Gillies)等人，免疫法雜志 125 =191-202 (1989)和美國(guó)專利第 5，807，715 號(hào)、第 4，816，567 號(hào)和第 4，816，397 號(hào)。
[0099]人類化抗體是來(lái)自非人類物種抗體的抗體分子，所述非人類物種抗體結(jié)合具有來(lái)自所述非人類物種的一個(gè)或一個(gè)以上互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來(lái)自人類免疫球蛋白分子的框架區(qū)的所要抗原。通常，人類框架區(qū)中的框架殘基將由來(lái)自CDR供體抗體的對(duì)應(yīng)殘基取代，以改變、優(yōu)選改良到靶蛋白或蛋白質(zhì)片段。這些框架取代通過(guò)所屬領(lǐng)域中熟知的方法來(lái)鑒別，例如通過(guò)對(duì)CDR和框架殘基之間的相互作用進(jìn)行建模以鑒別對(duì)結(jié)合重要的框架殘基并進(jìn)行序列比較以鑒別具體位置處的不尋常框架殘基(參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利第5，585，089號(hào)和賴希曼(Riechmann)等人，自然(Nature) 332:323(1988))?？贵w可使用所屬領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來(lái)人源化，例如CDR移植(國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)案第WO 91/09967號(hào)和美國(guó)專利第5，225，539號(hào)、第5，530，101號(hào)和第5，585，089號(hào))、鑲飾或表面重塑(帕德蘭(Padlan),分子免疫(Molecular Immunology) 28 (4/5):489-498(1991);斯圖德尼奇卡(Studnicka)等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering) 7 (6):805-814 (1994)和洛古斯卡(Roguska)等人，國(guó)家科學(xué)院院刊91 =969-973(1994))和鏈改組(美國(guó)專利第5，565，332號(hào))。
[0100]完全的人類抗體是特別為人類患者的治療性治療所需的。人類抗體可通過(guò)各種所屬領(lǐng)域中已知的方法來(lái)制造，包括上述使用源自人類免疫球蛋白序列的抗體文庫(kù)的噬菌體顯示方法。還參見(jiàn)美國(guó)專利第4，444，887號(hào)和第4，716，111號(hào)、和國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)案第WO 98/46645 號(hào)、第 WO 98/50433 號(hào)、第 WO 98/24893 號(hào)、第 WO 98/16654 號(hào)、第 WO 96/34096號(hào)、第 WO 96/33735 號(hào)和第 WO 91/10741 號(hào)。
[0101] 人類抗體也可使用不能表達(dá)功能內(nèi)源性免疫球蛋白但可以表達(dá)人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)產(chǎn)生。舉例來(lái)說(shuō)，人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合體可隨機(jī)地或通過(guò)同源性重組引入到小鼠胚胎干細(xì)胞中。或者，除人類重鏈和輕鏈基因以外，可將人類可變區(qū)、恒定區(qū)和多變區(qū)引入到小鼠胚胎干細(xì)胞中。借助人類免疫球蛋白基因座通過(guò)同源性重組的引入可使得小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因分別或同時(shí)無(wú)功能。具體來(lái)說(shuō)，JH區(qū)的純合性缺失阻止內(nèi)源性抗體產(chǎn)生。使經(jīng)修飾胚胎干細(xì)胞擴(kuò)展并微注射到胚泡中以產(chǎn)生嵌合子小鼠。接著使嵌合子小鼠繁殖以產(chǎn)生表達(dá)人類抗體的純合后代。轉(zhuǎn)基因小鼠以正常方式利用CavI剪接變體或其片段進(jìn)行免疫。可使用常規(guī)雜交瘤技術(shù)從經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得針對(duì)CavI剪接變體或片段的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠攜載的人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化期間重排，且隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，使用此技術(shù)可以產(chǎn)生治療有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。關(guān)于產(chǎn)生人類抗體的此技術(shù)的綜述，參見(jiàn)(例如)朗伯格(Lonberg)和胡薩爾(Huszar)，國(guó)際免疫學(xué)評(píng)論(Int.Rev.Tmmunol.) 13:65-93(1995)。關(guān)于用于產(chǎn)生人類抗體和人類單克隆抗體的此技術(shù)和和用于產(chǎn)生此抗體的方案的詳細(xì)討論，參見(jiàn)(例如)國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)案第WO 98/24893號(hào)、第WO 92/01047號(hào)、第WO 96/34096號(hào)和第WO 96/33735號(hào)；歐洲專利第O 598 877號(hào)；美國(guó)專利第5，413，923號(hào)、第5，625，126號(hào)、第 5, 633, 425 號(hào)、第 5, 569, 825 號(hào)、第 5, 661, 016 號(hào)、第 5, 545, 806 號(hào)、第 5, 814, 318 號(hào)、第5，885，793號(hào)、第5，916，771號(hào)和第5，939，598號(hào)。另外，可雇傭諸如安根尼克斯公司(Abgenix, Inc.)(加利福尼亞州費(fèi)利蒙市(Freemont7Ca.))和奧沙普秦(Genpharm)(加利福尼亞州圣荷西(San Jose7Ca.))等公司使用類似于上述的技術(shù)來(lái)提供針對(duì)所選蛋白質(zhì)的人類抗體。
[0102]也可使用稱為“引導(dǎo)選擇”的技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別所選表位的完全人類抗體。在此方法中，使用所選非人類單克隆抗體(例如小鼠抗體)用于引導(dǎo)識(shí)別同一表位的完全人類抗體的選擇(參見(jiàn)杰斯普(Jespers)等人,生物技術(shù)(Bio/technology) 12:899-903 (1988)) ?
[0103]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋的抗體包括以其它分子不阻止抗體結(jié)合到其靶蛋白的方式將所述其它分子共價(jià)附著到抗體修飾的衍生物。以實(shí)例的方式，抗體衍生物可包括已通過(guò)(例如)以下修飾的抗體:糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生、溶蛋白性裂解或連接到細(xì)胞配位體或其它蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中也涵蓋包含包括一個(gè)或一個(gè)以上非典型氨基酸的抗體的衍生物。
[0104]在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，治療劑是選擇性結(jié)合CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域的適體。適體可選擇性結(jié)合CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。適體包括采取特異性序列依賴性形狀且以高親和性和特異性結(jié)合到靶蛋白的單鏈核酸分子(例如DNA或RNA)。適體的長(zhǎng)度通常為100個(gè)核苷酸或更少,例如長(zhǎng)度為75個(gè)核苷酸或更少或50個(gè)核苷酸或更少(例如介于約10個(gè)與約100個(gè)核苷酸之間，或介于約10個(gè)與約50個(gè)核苷酸之間)。在一些實(shí)施例中，適體可為鏡像適體(也稱為SPIEGELMER?)。鏡像適體是高親和性L-對(duì)映體核酸(例如，L-核糖或L-2'-脫氧核糖單元)，其與D-寡核苷酸(例如，適體)相比顯示高抗酶促降解性。適體和鏡像適體的靶結(jié)合性質(zhì)是從寡核苷酸的隨機(jī)池開(kāi)始通過(guò)活體外選擇過(guò)程來(lái)設(shè)計(jì)，如(例如)沃特扎卡(Wlotzka)等人，國(guó)家科學(xué)院院刊99(13) =8898-90(2002)中所描述。
[0105]在一些實(shí)施例中，適體可為肽適體。肽適體包括在兩個(gè)末端附著到蛋白質(zhì)骨架的肽環(huán)(例如，其特異性針對(duì)CavI剪接變體)。此雙重結(jié)構(gòu)約束極大地使肽適體的結(jié)合親和性增加到與那些抗體結(jié)合水平相當(dāng)?shù)乃??？勺儹h(huán)長(zhǎng)度通常在約8個(gè)與約20個(gè)氨基酸之間(例如，在約8個(gè)與約15個(gè)或約8個(gè)與約12個(gè)氨基酸之間)，且所述骨架是適宜的穩(wěn)定、可溶、小且無(wú)毒的 蛋白質(zhì)。適宜蛋白質(zhì)的實(shí)例包括(但不限于)硫氧化還原蛋白-A、胱抑素(stefin)A三重突變體、綠色熒光蛋白、水蛭抑制劑C(eglin C)或細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Spl。肽適體選擇可使用不同的系統(tǒng)進(jìn)行，例如酵母雙雜交系統(tǒng)(例如，Gal4酵母雙雜交系統(tǒng))或LexA相互作用陷阱系統(tǒng)。
[0106]在一些實(shí)施例中，治療劑是合成抗體或合成抗體取代物，其二者均可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方法來(lái)制備(參見(jiàn)(例如)西度(Sidhu)和費(fèi)爾烏斯(Fellouse),自然化學(xué)生物學(xué)(Nature Chemical Biology) 2:682-688 (2006))。合成抗體取代物一般是基于肽。
[0107]在某些實(shí)施例中，治療劑是結(jié)合肽，其可如所屬領(lǐng)域中已知可通過(guò)(例如)噬菌體顯示或酵母雙雜交技術(shù)來(lái)鑒別。
[0108]本發(fā)明的一些實(shí)施例提供為小分子的治療劑，其可(例如)通過(guò)篩選市售組合文庫(kù)或天然產(chǎn)物文庫(kù)來(lái)獲得。
[0109]治療劑可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)針對(duì)其靶向CavI并調(diào)控其活性的能力來(lái)測(cè)試，例如那些在下文中在標(biāo)題為“篩選治療劑的方法”的章節(jié)中所描述的技術(shù)。
[0110]本發(fā)明的某些實(shí)施例提供靶向在淋巴系或骨髓系的造血細(xì)胞(例如，B細(xì)胞、T細(xì)胞或NK細(xì)胞)中表達(dá)的電壓門控鈣通道的電壓門控鈣通道調(diào)控劑。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供靶向在淋巴系的造血細(xì)胞(例如，B細(xì)胞、T細(xì)胞或NK細(xì)胞)中表達(dá)的CavI剪接變體的CavI調(diào)控劑。這些調(diào)控劑靶向CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施例中，這些治療劑是CavI抑制劑且發(fā)現(xiàn)可用作免疫阻抑劑。在某些其它實(shí)施例中，這些治療劑是在肥大細(xì)胞上表達(dá)的電壓門控鈣通道的抑制劑且發(fā)現(xiàn)可用于治療過(guò)敏中。
[0111]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供靶向在淋巴系的造血細(xì)胞(例如，B細(xì)胞、T細(xì)胞或NK細(xì)胞)中表達(dá)的CavL 4剪接變體的CavI調(diào)控劑。這些調(diào)控劑可靶向CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施例中，這些治療劑是CavL 4抑制劑且發(fā)現(xiàn)可用作免疫阻抑劑。
[0112]還提供醫(yī)藥組合物，其包含結(jié)合到CavI并調(diào)控其活性的治療劑和一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑和/或佐劑。如果需要，其它活性試劑可包括在組合物中。這些其它活性試劑可包括(例如)其它已知免疫調(diào)控化合物。此些組合物經(jīng)調(diào)配用于投與給動(dòng)物，包括人類。醫(yī)藥組合物可經(jīng)調(diào)配用于通過(guò)各種途徑投與。舉例來(lái)說(shuō)，組合物可經(jīng)調(diào)配用于經(jīng)口、局部、直腸或不經(jīng)腸投與或用于通過(guò)吸入或噴霧投與。本文所用的術(shù)語(yǔ)不經(jīng)腸包括皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、鞘內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
[0113]用于通過(guò)各種途徑投與的各種醫(yī)藥組合物和制備醫(yī)藥組合物的方法已為所屬領(lǐng)域已知且描述于(例如)“雷明頓:藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐(Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy) ”(原名“雷明頓醫(yī)藥科學(xué)(Remingtons PharmaceuticalSciences)，，);真納羅A.(Gennaro, A.),利平科特.威廉斯.威爾金斯出版公司(Lippincott, Williams & Wilkins)，賓夕法尼亞州費(fèi)城(Philidelphia, PA) (2000)。
[0114]篩選治療劑的方法[0115]本發(fā)明的一個(gè)方面提供篩選靶向給定電壓門控鈣通道的藥劑的方法，所述藥劑適于作為治療劑用以調(diào)控表達(dá)剪接變體的細(xì)胞的活性。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中提供篩選靶向給定CavI剪接變體的藥劑的方法，所述藥劑適于作為治療劑用以調(diào)控表達(dá)剪接變體的細(xì)胞的活性。
[0116]—般來(lái)說(shuō)，篩選方法包含使表達(dá)所關(guān)注的電壓門控鈣通道(例如所關(guān)注的CavI剪接形式)的造血細(xì)胞與候選治療劑接觸，并測(cè)定所述候選治療劑是否調(diào)控鈣通道的活性。適當(dāng)細(xì)胞包括(例如)肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。
[0117]在某些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含鑒別在所關(guān)注的靶細(xì)胞或組織中表達(dá)的CavI剪接變體的一個(gè)初始步驟或多個(gè)步驟。此可如(例如)在以上章節(jié)“Cavl剪接變體”中所描述的來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，方法還包含鑒別可由候選治療劑靶向的所選剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域的步驟，也如以上章節(jié)“Cavl剪接變體”中所描述。
[0118]CavI剪接變體的活性的調(diào)控可(例如)以鈣通道活性的水平或細(xì)胞功能的水平來(lái)評(píng)價(jià)。
[0119]在某些實(shí)施例中，篩選方法包含評(píng)價(jià)候選化合物調(diào)控鈣通道活性的能力。在一些實(shí)施例中，方法包含評(píng)價(jià)候選化合物抑制鈣通道活性的能力。
[0120]鈣通道活性可使用所屬領(lǐng)域中已知的用于評(píng)價(jià)進(jìn)入細(xì)胞中或跨越細(xì)胞膜的鈣通量的各種方法來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)電壓鉗電生理方法(具體來(lái)說(shuō)，全細(xì)胞“膜片鉗”分析)和基于熒光的分析。
[0121]對(duì)于電壓鉗電生理記錄，用玻璃微量移液管破壞細(xì)胞膜以使移液管腔與細(xì)胞質(zhì)連接。此方式可測(cè)量質(zhì)膜兩端的膜電位。當(dāng)鈣通道被激活且鈣跨越膜進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，膜電位改變且借助此方法測(cè)量此改變。“膜片鉗”分析描述于(例如)莫爾納(Molndr)和希克曼(Hickman),膜片鉗方法和實(shí)驗(yàn)指南(Patch-clamp methods and protocols),胡馬納出版社(Humana Press) (2007)。
[0122]基于熒光的分析可用于測(cè)量細(xì)胞中鈣濃度的增加。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將細(xì)胞與可跨越質(zhì)膜并駐留在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的鈣敏感染料(例如，富洛4或富拉紅，從英杰生命科技公司(Invitrogen Life Technologies)購(gòu)得)一起培育。當(dāng)允許鈣跨越膜進(jìn)入細(xì)胞的鈣通道被激活時(shí)，鈣將結(jié)合所述染料并改變其熒光性質(zhì)。例如，熒光中的富洛4染料將增加，同時(shí)熒光中的富拉紅染料將降低。可測(cè)量染料熒光性質(zhì)的變化并將其與胞質(zhì)鈣濃度或鈣通量的增加相關(guān)聯(lián)?；跓晒獾姆治龇椒枋鲇?例如)瓊(June)和莫爾(Moore)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)離子(Measurement of Intracellular 1ns by Flow Cytometry).最新免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols in Immunology).5.5.1-5.5.20 (2004)) ?
[0123]此外，可利用各種市售試劑盒來(lái)測(cè)量鈣通量且了用于本發(fā)明方法中，例如富洛4Direct?鈣分析試劑盒(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)和BD?鈣分析試劑盒(BD生物科學(xué)(BioSciences))。
[0124]鈣通量相對(duì)于對(duì)照的實(shí)質(zhì)變化指示候選藥劑調(diào)控CavI剪接變體的鈣通道活性。對(duì)照可為指示未用候選藥劑處理的樣品(例如細(xì)胞)中的鈣通量的已知值。舉例來(lái)說(shuō)，與對(duì)照相比，鈣通道活性降低至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70%、至少約80%或至少約90%指示候選藥劑抑制鈣通道活性，且因此候選藥劑是CavI活性的抑制劑。與此相反，與對(duì)照相比，鈣通道活性增加(例如)至少約20%、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %或至少約90 %指示候選藥劑激活鈣通道活性，且因此候選藥劑是CavI活性的激活劑。 [0125]適當(dāng)?shù)墓δ芊治隹捎伤鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員考慮所涉及的細(xì)胞類型容易地測(cè)定。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和/或細(xì)胞激活可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。舉例來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄因子(例如NFkB或NFAT)的誘導(dǎo)、細(xì)胞因子分泌或溶細(xì)胞能力可使用所屬領(lǐng)域已知技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)各種造血細(xì)胞的免疫功能的適宜分析已為所屬領(lǐng)域得知。
[0126]實(shí)施此些分析的方法已為所屬領(lǐng)域熟知(參見(jiàn)(例如)精編最新免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南:最新免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南的方法匯編(Short Current Protocols in Immunology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Immunology), 2005,約翰威立出版公司(John Wiley & Sons Inc.)新澤西州(New Jersey);肥大細(xì)胞:方法和實(shí)驗(yàn)指南(MastCells:Methods and Protocols),克里希納斯瓦米(Krishnaswamy)和智(Chi), 2005,胡馬納出版社；和嗜中性粒細(xì)胞方法和實(shí)驗(yàn)指南系列:分子生物學(xué)方法(Neutrophil Methodsand Protocols Series:Methods in Molecular Biology),第 412 期，奎恩(Quinn)等人(編輯)2007，胡馬納出版社)。
[0127]在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，方法包含鑒別為電壓門控鈣通道活性的抑制劑的候選化合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，方法包含鑒別為CavI活性的抑制劑的候選化合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，方法包含鑒別為CavL 4活性的調(diào)控劑的候選化合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，方法包含鑒別為CavL 4活性的抑制劑的候選化合物。
[0128]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，篩選方法包含使表達(dá)所關(guān)注的CavI剪接變體的B細(xì)胞、T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或脾細(xì)胞與候選治療劑接觸并評(píng)價(jià)所述候選藥劑抑制鈣通道活性的能力。根據(jù)此實(shí)施例，可將抑制鈣通道活性的候選藥劑選擇為適宜作為免疫阻抑劑的治療劑。
[0129]在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，方法包含鑒別為CavI活性的刺激劑的候選化合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，方法包含鑒別為CavL 4活性的刺激劑的候選化合物。
[0130]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，篩選方法包含使表達(dá)所關(guān)注的CavI剪接變體的B細(xì)胞、T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或脾細(xì)胞與候選治療劑并評(píng)價(jià)所述候選藥劑刺激鈣通道活性的能力。
[0131]治療劑的用途
[0132]本發(fā)明的一個(gè)方面提供治療劑用以調(diào)控表達(dá)所靶向電壓門控鈣通道(包括(但不限于)CavI剪接變體)的造血細(xì)胞的活性的用途。[0133]在某些實(shí)施例中，治療劑靶向在淋巴系的造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道且可用于調(diào)控免疫功能。在某些實(shí)施例中，治療劑靶向在淋巴系的造血細(xì)胞中表達(dá)的CavI剪接變體且可用于調(diào)控免疫功能。在一些實(shí)施例中，治療劑抑制在淋巴系的造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道的活性且可用于阻抑免疫應(yīng)答(例如以治療自體免疫疾病、降低移植排斥的風(fēng)險(xiǎn))。在一些實(shí)施例中，治療劑抑制CavI剪接變體的活性且可用于阻抑免疫應(yīng)答(例如以治療自體免疫疾病、降低移植排斥的風(fēng)險(xiǎn))。在一些實(shí)施例中，治療劑抑制CavL 4剪接變體的活性且可用于阻抑免疫應(yīng)答(例如以治療自體免疫疾病、降低移植排斥的風(fēng)險(xiǎn))。
[0134]在某些實(shí)施例中，治療劑靶向在骨髓系的造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道且可用于調(diào)控免疫功能。
[0135]在一些實(shí)施例中，治療劑增加在造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道的活性且可用于增加免疫應(yīng)答(例如，在免疫受損的個(gè)體中)。在一些實(shí)施例中，治療劑增加CavI剪接變體的活性且可用于增加免疫應(yīng)答(例如，在免疫受損的個(gè)體中)。在一些實(shí)施例中，治療劑增加CavL 4剪接變體的活性且可用于增加免疫應(yīng)答。
[0136]在一些實(shí)施例中，治療劑靶向在T細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道且因此可用于調(diào)控T細(xì)胞活性。在一 些實(shí)施例中，治療劑靶向在T細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體且因此可用于調(diào)控T細(xì)胞活性。某些實(shí)施例提供靶向在T細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的治療劑用以抑制T細(xì)胞到抗原的結(jié)合的用途。一些實(shí)施例提供靶向在T細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的治療劑抑制T細(xì)胞成熟的用途。此些治療劑具有用作(例如)免疫阻抑劑的應(yīng)用，其可用于治療自體免疫疾病、降低移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)以及用于治療其它需要阻抑免疫系統(tǒng)的病癥。
[0137]在一些實(shí)施例中，治療劑靶向在B細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道且因此可用于調(diào)控B細(xì)胞活性。在一些實(shí)施例中，治療劑靶向在B細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體且因此可用于調(diào)控B細(xì)胞活性。某些實(shí)施例提供靶向在B細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的治療劑用以抑制BCR介導(dǎo)的激活和/或BCR誘導(dǎo)的增殖的用途。一些實(shí)施例提供靶向在B細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的治療劑用于抑制B細(xì)胞成熟的用途。此些治療劑具有用作(例如)免疫阻抑劑的應(yīng)用，其可用于治療自體免疫疾病或消弱抗體應(yīng)答的產(chǎn)生以及用于治療其它需要阻抑免疫系統(tǒng)的病癥。
[0138]可根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例治療的自體免疫疾病的實(shí)例包括(但不限于)發(fā)炎性(類風(fēng)濕性)關(guān)節(jié)炎、喬本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、惡性貧血(perniciousanemia)、發(fā)炎性腸病(克羅恩氏病(Crohn’ s disease)和潰瘍性結(jié)腸炎)、干癬、腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、阿狄森氏病(Addison’ s disease)、I型糖尿病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、皮肌炎、薛格連氏綜合癥(Sjogren’ s syndrome)、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、萊特爾綜合癥(Reiter’ s syndrome)和格雷夫斯氏病(Grave’ s disease)。可針對(duì)這些疾病中的任一者來(lái)測(cè)量應(yīng)答的臨床測(cè)量。舉例來(lái)說(shuō)，可使用疼痛的減小、組織(例如，關(guān)節(jié))炎癥的減小、改良的組織(例如，腎)功能或改良的消化食物的能力作為成功的免疫阻抑的指示劑。
[0139]某些實(shí)施例涵蓋投與靶向在造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道的治療劑連同已知消炎劑或免疫阻抑劑。某些實(shí)施例涵蓋投與靶向T細(xì)胞CavL 4剪接變體的治療劑連同已知消炎劑或免疫阻抑劑。某些實(shí)施例涵蓋投與靶向B細(xì)胞CavL 4剪接變體的治療劑連同已知消炎劑或免疫阻抑劑。免疫阻抑劑的實(shí)例包括非類固醇消炎劑(例如雙氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(difIunisal)、依托度酸(etodolac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)、奈普生(naproxen)、奧沙普秦(oxaprozin)、批羅昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、塞來(lái)昔布(celecoxib)或羅非昔布Crofecoxib))、類固醇類(例如可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone)、強(qiáng)的松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)或曲安西龍(triamcinolone)和免疫阻抑劑(例如環(huán)孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、麥考酹酸(mycophenolic acid)或雷帕霉素(sirolimus))。其它實(shí)例包括生物應(yīng)答修飾劑(例如肯尼列(Kineret) ? (阿那白滯素(anakinra))、恩利(Enbrel) ? (依那西普(etanercept))或瑞米凱德(Remicade) ? (英利昔單抗(infliximab)))、緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物(DMARD)(例如阿拉瓦(Arava) ? (來(lái)氟米特(Ieflunomide)))、海爾根(Hyalgan) ? (玻尿酸)和欣維可(Synvisc) ? (海蘭(hylan)G-F20)。
[0140]本發(fā)明的某些實(shí)施例提供增加在造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道(例如CavI剪接變體)的活性的治療劑用以在免疫受損的個(gè)體中的增加免疫應(yīng)答的用途，例如用于治療或預(yù)防免疫受損的個(gè)體的機(jī)會(huì)性感染。免疫受損的個(gè)體更易于受到機(jī)會(huì)性感染，例如病毒、真菌、原生動(dòng)物或細(xì)菌感染、朊病毒病(prion disease)和某些贅生物。那些可視為免疫受損者包括(但不限于)患有AIDS (或HIV陽(yáng)性)的個(gè)體、患有嚴(yán)重的綜合性免疫缺陷癥(SCID)、糖尿病的個(gè)體、已進(jìn)行移植且服用免疫阻抑劑的個(gè)體和那些接受針對(duì)癌癥的化學(xué)療法者。免疫受損個(gè)體還包括患有大多數(shù)形式的癌癥(除了皮膚癌以外)、鐮狀細(xì)胞性貧血，囊性纖維化的個(gè)體、那些沒(méi)有脾臟的個(gè)體、患有腎終末期疾病(透析)的個(gè)體和那些在過(guò)去一年通過(guò)藥丸或注射頻繁服用皮質(zhì)類固醇的個(gè)體?；加袊?yán)重的肝、肺或心臟疾病個(gè)個(gè)體也可是免疫受損的。
[0141]為更好的理解本文所述本發(fā)明，陳述以下實(shí)例。應(yīng)了解，這些實(shí)例打算描述本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施例且并不打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0142]實(shí)例
[0143]實(shí)例1:CAV1.4鈣通道調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)和初始型T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)
[0144]實(shí)施以下實(shí)驗(yàn)以測(cè)定CavL 4在T細(xì)胞生物學(xué)中的生理功能。
[0145]實(shí)驗(yàn)方法:
[0146]總RNA提取和RT-PCR.總RNA是使用Trizol ?試劑(英杰公司)按制造商的指示從各種樣品中提取。經(jīng)分離的RNA用DNase I處理以移除受污染的DNA。使用I微克的總RNA利用隨機(jī)引物和superscript II (英杰公司)來(lái)合成第一鏈cDNA。為檢測(cè)組織中的Cavl.4，利用同義引物(5' -CAT ACT GGA GGA AAG CCA GGA-3')和反義引物(5' -TGGAGT GTG TGG AGC GAG TAG A-3')來(lái)執(zhí)行初始PCR。利用同義引物(5' -GAC GAA TGC ACAAGA CAT GC-3')和反義引物(5' -CM GCA CAA GGT TGA GGA CA-3')實(shí)施隨后的嵌套式PCR 擴(kuò)增。為檢測(cè) Cavl.4 突變的 mRNA，利用同義引物(5’ -CATACTGGADGGAAAGCCAGGA-3’ )和反義引物(5’CGTCCCTCTTCAGCAAGAGAA-3，)執(zhí)行第一輪PCR。利用同義引物(5，-GCCCATAACTTCGTATAATGTATGC-3’ )和反義引物(5，-CAAGCACAAGGTTGAGGACA-3 ’ )執(zhí)行第二嵌套式PCR。
[0147]抗體(Ab).針對(duì)CD3e(2Cll)、CD4(GK1.5)、CD8a(53-6.7)、CD8b(53.58)、TCRβ (H57-597)、CD 19(ebio1D3)、CD24(Ml/69)、CD25(PC61.5)、CD44(ΙΜ7)、CD62L (MEL-14)、CD69(H1.2F3)、CD127(A7R34)、Thyl.1 (HIS51)、Thyl.2(53-2.1)、CD45.2 (104)、PD-1 CJ43)、PD-Ll (MIH5)和 CCR7 (EB1-1)用于流式細(xì)胞術(shù)的單克隆抗體是從易生物科學(xué)公司(eBioscience)購(gòu)得。使用以下抗體用于免疫墨點(diǎn)法:兔多克隆抗〇3￥1.4(麥克洛瑞等人，2004)、抗磷酸-?44和？42 MAPK(9101，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)公司(CellSignaling))、抗 ERK2 (sc-154,圣克魯茲(Santa Cruz))、抗磷酸-JNK(9251,細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)公司)、抗JNK(9252，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)公司)、抗-NFATcl (7A6，賽默飛世爾科技(ThermoScientific))、抗-GAPDH(MAB374，日本化工(Chemicon))和抗-HDACl (10E2，圣克魯茲)。
[0148]骨髓轉(zhuǎn)移試驗(yàn).骨髓(BM)細(xì)胞是從Thyl.1野生型(Thyl.1+CD45.2+)或Cacnalf+(Thy1.2+CD45.2+)小鼠的股骨提取物制得。成熟T細(xì)胞用生物素化Thyl.1或抗Thyl.2 Ab染色且隨后用抗生蛋白鏈菌素連接的免疫磁珠(Dynabeads)(英杰公司)使其耗盡。接著將野生型和突變BM細(xì)胞50: 50混合，然后靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移到經(jīng)亞致死輻照(1000拉德(rad))⑶45.1+宿主(Thyl .2+CD45.1+)中。在繼承性轉(zhuǎn)移后30天回收來(lái)自脾臟和胸腺的細(xì)胞；Thyl.1、Thyl.2和⑶45.2是用于辨別野生型和突變供體細(xì)胞的基礎(chǔ)。
[0149]小鼠.將先前已描述的Cacnalf^小鼠(曼瑟(Mansergh)等人,2005)在C57BL/6J(B6)背景上培育至少 13 代。B6、B6.PL-ThyIa/Cy (Thy 1.1+)、Β6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ(Ly5.1+)和 Β6.Ragl+ 均是從杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jackson Laboratory)(緬因州巴港(Bar Harbor, ME))獲得。所有研究均遵循英屬哥倫比亞大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)(University of British Columbia，s Animal Care Committee)和加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)(the Canadian Council on Animal Care) 二者設(shè)定的指導(dǎo)方針。
[0150]流式細(xì)胞術(shù).所有Ab培育均在冰上實(shí)施。膜聯(lián)蛋白V_PE(BD生物科學(xué))、抗Bcl-2(3F11 ;BD生物科學(xué))和同種型對(duì)照Ab染色是如先前所述實(shí)施(普若艾陶(Priatel)等人，2000，2006)。數(shù)據(jù)利用 FACScan 或 FACSCalibur 和 CellQuest 軟件(BD 生物科學(xué))或LSRII和FACSDiVa軟件(BD生物科學(xué))進(jìn)行采集。數(shù)據(jù)利用Flowjo軟件(翠絲塔公司(Treestar, Inc))進(jìn)行分析。
[0151]Ca2+通量分析.將存于含有2% FCS的HBSS(漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s balancedsalt solution))中的脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞(IO7個(gè)細(xì)胞/mL)用I μ M富洛4、2 μ M富拉紅和0.02%普流尼克(所有均來(lái)自英杰公司)在室溫下標(biāo)記45分鐘。洗滌之后，將細(xì)胞在冰上用CD44-APC、CD8-APC-eFluor 780(易生物科學(xué)公司)和CD4-PE Ab染色達(dá)20分鐘。將樣品懸浮于RPMI (含有約0.4mM Ca2+)中并在37°C下預(yù)熱15分鐘。如先前所述執(zhí)行毒胡蘿卜內(nèi)酯(I μ M)和離子霉素(I μ g/mL)刺激以及反向添加游離細(xì)胞外Ca2+(0.5mM)(劉(Liu)等人，1998)。通過(guò)補(bǔ)充含有0.5mM EGTA的RPMI培養(yǎng)基實(shí)施細(xì)胞外Ca2+的螯合。為了 TCR刺激，通過(guò)添加20 μ g/mL抗生蛋白鏈菌素來(lái)激活經(jīng)5 μ g/mL生物素化⑶3 ε Ab (克隆145-2C11 ;易生物科學(xué)公司)預(yù)涂布的脾細(xì)胞。在BD LSR II流式細(xì)胞儀上利用FACSDiva軟件或在BD FACSCalibur上利用CellQuest軟件采集Ca2+通量數(shù)據(jù)并利用Flowjo (翠絲塔公司)針對(duì)所指示T細(xì)胞子集進(jìn)行電子門控并繪制富洛4/富拉紅比率對(duì)時(shí)間的曲線來(lái)進(jìn)行分析。[0152]電生理分析.將從WT和Cacnalf+小鼠的淋巴結(jié)和脾臟產(chǎn)生的單細(xì)胞懸浮液用0)44(頂7)、CD4(GK1.5)和 CD8a(53_6.7) Ab 染色，且隨后利用 BD FACSAria 分離 CD441()CD4+和⑶8+T細(xì)胞。由于絕大部分(> 99% )分選出的⑶441()T細(xì)胞為⑶62Lhi，因此將其視為初始型。如針對(duì)Ca2+通量分析所述實(shí)行TCR刺激。對(duì)于Ca2+通道阻斷試驗(yàn)，將細(xì)胞與特異性針對(duì)CavL 3和CavL 4的胞外結(jié)構(gòu)域的Ab (圣克魯茲；sc-32070) 一起預(yù)培育。在具有pClamplO軟件的Axopatch200B放大器(阿克森儀器(Axon Instruments))上實(shí)施全細(xì)胞膜片鉗記錄和分析。膜片電極是從薄壁硼娃酸鹽玻璃(世界精密儀器(World PrecisionInstruments))在水平微量移液管牽拉儀(薩特儀器(Sutter Instruments))上拉制。當(dāng)電極充滿細(xì)胞內(nèi)溶液時(shí)，具有4-8ΜΩ的電阻。在全細(xì)胞記錄期間使用模擬能力補(bǔ)償和80%串聯(lián)電阻補(bǔ)償。對(duì)于單脈沖記錄，將細(xì)胞從-SOmV的保持電位以IOs間隔去極化到+IOmV并使用P/4漏電減法程序。在將峰值電流幅值正規(guī)化到對(duì)應(yīng)細(xì)胞電容值時(shí)，呈現(xiàn)電流密度。為獲得1-V關(guān)系，使用從_130mV到70mV的200ms斜坡脈沖方案以及_80mV保持電位和P/4漏電減法程序。數(shù)據(jù)是以50kHz取樣且以IOkHz濾波并在室溫(20°C -22°C )下執(zhí)行全細(xì)胞記錄。細(xì)胞外溶液含有IOOmM BaCl2UOmM HEPES，利用NaOH調(diào)節(jié)到pH 7.4。移液管中所用的細(xì)胞內(nèi)溶液含有 140mM TEA-Cl、5mM EGTAUOmM HEPESUmM MgATP2，利用 TEA-OH 調(diào)節(jié)到pH 7.4。
[0153] 磷酸流式細(xì)胞術(shù)信號(hào)傳導(dǎo).胸腺細(xì)胞在刺激之前在含有IOmM HEPES的HBSS中培育30分鐘。如上所述將細(xì)胞刺激達(dá)所指示時(shí)間，用2%甲醛固定10分鐘、通過(guò)離心沉降并在-20°C下在90%甲醇中透性化過(guò)夜。為測(cè)定STAT5磷酸化，將透性化細(xì)胞用偶聯(lián)到AlexaFluor647 (BD 生物科學(xué))的抗 STAT5 (pY649)mAb、抗 CD8 a -PE 和抗 CD4_PE_Cy7 于室溫下處理I小時(shí)。如所述執(zhí)行ERK活性的流式細(xì)胞測(cè)量(普若艾陶等人，2002)。
[0154]免疫墨點(diǎn)法.為檢測(cè)CavL 4，通過(guò)免疫墨點(diǎn)法分析脾細(xì)胞。或者，利用EasyS印小鼠T細(xì)胞富集試劑盒(干細(xì)胞技術(shù)公司(StemCell Technologies, Inc.))從脾細(xì)胞制劑分離T細(xì)胞。分離膜蛋白并在免疫墨點(diǎn)法之前如先前所報(bào)告將樣品之間的蛋白質(zhì)量正規(guī)化(伍達(dá)德(Woodard)等人，2008)。利用Alexa 680偶聯(lián)抗兔IgG Ab (L1-Cor生物科學(xué))檢測(cè)一級(jí)Ab的結(jié)合。利用奧德賽紅外成象系統(tǒng)(L1-Cor生物科學(xué))使蛋白質(zhì)條帶可視化。利用奧德賽軟件量化信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)于信號(hào)傳導(dǎo)分析，通過(guò)TCR刺激(如上)將胸腺細(xì)胞激活達(dá)所指示時(shí)間。作為激活的陽(yáng)性對(duì)照，將胸腺細(xì)胞在37°C下與lOOng/mL PMA —起培育10分鐘。如先前所述評(píng)價(jià)Ras活性(戴維(David)等人,2005)。通過(guò)免疫墨點(diǎn)法檢測(cè)磷酸化和總ERK和JNK。磷酸化的倍數(shù)增加表示為總蛋白質(zhì)的比率且正規(guī)化為未經(jīng)刺激野生型對(duì)照。
[0155]NFAT動(dòng)員分析.制備來(lái)自WT或Cacnalf+小鼠的胸腺的單細(xì)胞懸浮液并利用板結(jié)合CD3 ε (145-2Cll)Ab(10y g/ml)和可溶性CD28 (I μ g/ml)或僅培養(yǎng)基培育16小時(shí)。將全細(xì)胞在RIPA緩沖液中細(xì)胞溶解達(dá)10分鐘。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分利用NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒(賽默飛世爾科技)制備并通過(guò)免疫墨點(diǎn)法分析。如上所述檢測(cè)一級(jí)Ab的結(jié)合。激活的倍數(shù)增加表示為適當(dāng)加載對(duì)照的比率并正規(guī)化為未經(jīng)激活的野生型對(duì)照。
[0156]初始型T細(xì)胞存活分析.如上述在電生理分析中所述分選WT(Thyl.1+)和Cacnalf+ (Thyl.2+) OMfOM+和CD8+T細(xì)胞。將經(jīng)純化WT和突變初始型CD4+和CD8+T細(xì)胞以相等比率(1:1:1:1)混合并以200，000個(gè)總細(xì)胞/孔在96孔平底板中培養(yǎng)。將細(xì)胞用所指示劑量的mIL-7(易生物科學(xué)公司)處理或在預(yù)涂布有10μ g/mL⑶3 (145-2C11) Ab的孔中培養(yǎng)。24小時(shí)后，通過(guò)利用⑶8和Thyl.1Ab標(biāo)記樣品、在室溫下與膜聯(lián)蛋白V-Alexa647 (南方生物科技(Southern Biotech)) 一起在含有Ca2+的緩沖液中培育15分鐘且隨后在BD FACSCalibur上采集數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定生存力。
[0157]繼承性轉(zhuǎn)移試驗(yàn).對(duì)于初始型T細(xì)胞轉(zhuǎn)移，如上述在電生理分析中所述分選訂(11^1.1+)和0&0^1廠/-(11^1.2+)00441。0)4和0)81'細(xì)胞，以1: I: I: I 比率混合，利用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)(英杰公司)進(jìn)行熒光標(biāo)記并共同注入Ragl+宿主中。轉(zhuǎn)移后I周，將脾細(xì)胞分離并利用相關(guān)Ab染色用于辨別供體WT和突變T細(xì)胞。
[0158]細(xì)菌感染和抗原特異性T細(xì)胞的檢測(cè).小鼠以靜脈內(nèi)方式(1.V.)利用約IO4個(gè)菌落形成單位(CFU)的rLM-0VA(表達(dá)單核細(xì)胞增多性利斯特菌的卵白蛋白)進(jìn)行感染。脾細(xì)胞用CD8 α (53-6.7)和CD44(IM7)Ab和H_2Kb-0VA四聚體(iTag MHC四聚體，貝克曼庫(kù)爾特公司(Beckman Coulter))進(jìn)行染色。如所述執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和細(xì)胞毒性分析(普若艾陶等人，2007)。
[0159]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.對(duì)于大多數(shù)分析，統(tǒng)計(jì)顯著性是利用未配對(duì)司徒登氏t檢驗(yàn)(Student’s t test )來(lái)測(cè)定。對(duì)于電生理分析,通過(guò)具有無(wú)重復(fù)的雙因素設(shè)計(jì)的ANOVA檢驗(yàn)測(cè)量統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0160]結(jié)果:
[0161]CavL 4缺乏導(dǎo)致⑶4+和⑶8+T細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少和自發(fā)的T細(xì)胞激活
[0162]為表征CavL 4在野生型(WT)小鼠中的表達(dá)，執(zhí)行RNA分析并揭示在胸腺、脾臟和外周⑶4+和⑶8+T細(xì)胞中的表達(dá)(參見(jiàn)圖1A)。先前描述CavL 4在正發(fā)育的和成熟T細(xì)胞中表達(dá)的觀察結(jié)果引起了 Cacnalf+小鼠是否顯示T細(xì)胞表型的調(diào)查研究。已預(yù)先通過(guò)基因祀向、插入終止密碼子并提前終止Cacnalf翻譯(曼瑟等人,2005)產(chǎn)生Cacnalf+小鼠。為驗(yàn)證Cacnalf+小鼠中的基因靶向，執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，以檢測(cè)Cacnalf+小鼠中特異性攜載1xP位點(diǎn)的經(jīng)破壞CavL 4轉(zhuǎn)錄物(圖1B)。另外,CavL 4抗體(Ab)墨點(diǎn)法揭示Cacnalf+脾全細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)損失(圖2A)。小鼠脾細(xì)胞與Weri視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞之前的CavL 4蛋白質(zhì)大小差異可是由于擇性剪接(庫(kù)特瑞和杰弗里斯，2005)或細(xì)胞類型特異性翻譯后修飾的緣故。為確立CavL 4是否在T細(xì)胞質(zhì)膜處，將WT和Cacnalf+脾T細(xì)胞表面生物素化并利用CavL 4Ab對(duì)抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)珠粒免疫沉淀進(jìn)行墨點(diǎn)分析(圖2B)。特定地在WT T細(xì)胞中檢測(cè)到CavL 4大小條帶證明CavL 4通道在T細(xì)胞表面處表達(dá)。
[0163]缺少功能性CavL 4通道的胸腺細(xì)胞的分析揭示到T細(xì)胞成熟的變化次數(shù)。在Cacnalf+胸腺中⑶4+對(duì)⑶8+單陽(yáng)性(SP)胸腺細(xì)胞的比率稍微朝向⑶8+系偏移(圖2C)，且成熟胸腺細(xì)胞(稱為⑶241()TCRi3 hi)的比率相對(duì)于WT減少(圖2D)。CavL 4缺乏對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響也反映在成熟CD4+SP胸腺細(xì)胞的數(shù)量降低50 %、而CD8+SP胸腺細(xì)胞的數(shù)量在很大程度上無(wú)變化上(圖2E)。然而，各種成熟和激活標(biāo)志物在Cacnalf+雙陽(yáng)性(DP)和TCRP+SP亞群上的表達(dá)近似平行于WT，此表示類似數(shù)量的TCRP、⑶44、⑶69和⑶62L(圖3)?？傮w來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)暗示CavL 4功能促進(jìn)陽(yáng)性選擇，具體來(lái)說(shuō)⑶4+SP系的分化。
[0164]外周淋巴區(qū)室(包括脾臟、淋巴結(jié)(LN)和外周血液)的檢查揭示，Cacnalf+相對(duì)于WT小鼠展現(xiàn)降低的⑶4+T細(xì)胞的頻率和減小的⑶4+對(duì)⑶8+T細(xì)胞的比率(圖2F)。此外，基于脾臟(圖2G)和LN(圖4)細(xì)胞回收，發(fā)現(xiàn)Cacnalf+小鼠對(duì)于⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞和B細(xì)胞子集存在顯著地淋巴細(xì)胞減少。而且，在Cacnalf+小鼠中外周⑶4+T細(xì)胞的損失比⑶8+T細(xì)胞更加明顯。與Cacnalf+T細(xì)胞數(shù)量的下降相關(guān)聯(lián)，⑶4+TCRβ +和⑶8+TCR3 +T細(xì)胞二者展示自發(fā)的急性T細(xì)胞激活的跡象，此表示增加數(shù)量的CD44、CD122和程序性死亡(PD)-1和減少的⑶62L(圖2H)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)闡明，CavL 4依賴性Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于初始型⑶4+和⑶8+T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和靜止是必要的。
[0165]CavL 4是TCR誘導(dǎo)的和貯存池操作的胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+的升高非常需要的
[0166]將加載有指示劑染料用于測(cè)量細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+且經(jīng)⑶4和⑶8 Ab加⑶44 Ab標(biāo)記用于辨別CD4410 (初始型)或CD44hi (記憶型)CD4.和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(圖5A)的WT和Cacnalf+脾細(xì)胞用所指示激動(dòng)劑刺激以研究Cacnalf+小鼠中的Ca2+輸送不足。為測(cè)定來(lái)自細(xì)胞內(nèi)貯存池的Ca2+釋放是否勝任經(jīng)由質(zhì)膜通道調(diào)節(jié)Ca2+流入，將脾T細(xì)胞用毒胡蘿卜內(nèi)酯處理(圖5B)。毒胡蘿卜內(nèi)酯(ER的Ca2+-ATPase的抑制劑)通過(guò)阻斷細(xì)胞將Ca2+泵送到肌質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中誘導(dǎo)細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度的升高且其次激活質(zhì)膜結(jié)合的Ca2+通道，此觸發(fā)Ca2+自細(xì)胞外部的進(jìn)入(瑟斯托普(Thastrup)等人，1990)。明顯地，展現(xiàn)極大地減小的Cacnal f+OMfCDfT細(xì)胞當(dāng)毒胡蘿卜內(nèi)酯刺激時(shí)細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+增加，而Cacnal f+CDd#。和⑶44hkD8+T細(xì)胞相對(duì)于其WT對(duì)應(yīng)物也展示明顯減小(圖5B)。另一方面，來(lái)自⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的Ca2+流出看來(lái)并非因CavL 4缺乏而有所損害，如通過(guò)添加Ca2+螯合劑乙二醇四乙酸(EGTA)所闡明。與初始型CD4+T細(xì)胞之間的比較相比，WT和Cacnalf+CDA^OM+T細(xì)胞顯示極為相似的Ca2+應(yīng)答。總之，這些觀察結(jié)果闡明，CavL 4通道是⑶441°⑶4+T細(xì)胞中的SOCE非常需要的且在⑶441°和⑶44hkD8+T細(xì)胞中的SOCE的需要程度較小。[0167]為研究CavL 4通道是否可以調(diào)節(jié)TCR信號(hào)傳導(dǎo)，將經(jīng)生物素化⑶3 Ab預(yù)涂布的WT和突變脾細(xì)胞通過(guò)抗生蛋白鏈菌素(SA)添加來(lái)激活。在WT T細(xì)胞中，TCR交聯(lián)誘導(dǎo)細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度迅速升高且保持升高達(dá)持續(xù)時(shí)間(圖5C)。與對(duì)于毒胡蘿卜內(nèi)酯處理觀察到的應(yīng)答自相矛盾，Cacnair7XD^和⑶8+T細(xì)胞二者對(duì)TCR刺激的應(yīng)答極弱，無(wú)論其表面⑶44表型如何。差異性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞CavL 4功能依賴于針對(duì)毒胡蘿卜內(nèi)酯而非TCR應(yīng)答的基礎(chǔ)尚不清楚(圖5B)。另外，Cacnair7T細(xì)胞、具體來(lái)說(shuō)CD441()CD4+T細(xì)胞子集當(dāng)用離子霉素處理時(shí)與WT相比實(shí)現(xiàn)極大減小的峰值Ca2+濃度。離子霉素經(jīng)由其離子載體性質(zhì)增加細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度，釋放細(xì)胞內(nèi)Ca2+貯存池且隨后刺激質(zhì)膜Ca2+通道開(kāi)放和來(lái)自細(xì)胞外部的Ca2+流入(摩爾根(Morgan)和雅各布(Jacob), 1994)。離子霉素應(yīng)答在Cacnalf+T細(xì)胞中被極大地削弱的發(fā)現(xiàn)暗示，CavL 4功能有助于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的儲(chǔ)存或?qū)τ贑a2+從細(xì)胞內(nèi)貯存池釋放之后其輸入來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。
[0168]為測(cè)定CavL 4是否介導(dǎo)上述涉及Ca2+應(yīng)答的過(guò)程中的一者或兩者，當(dāng)細(xì)胞外Ca2+由EGTA螯合時(shí)(防止Ca2+攝入且由此移除來(lái)自細(xì)胞內(nèi)貯存池的Ca2+釋放)，在TCR刺激之后監(jiān)測(cè)Ca2+應(yīng)答。在TCR接合之后在EGTA存在下所觀察到短暫細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的升高發(fā)現(xiàn)相對(duì)于WT在Cacnalf+T細(xì)胞中有所降低(圖OT)。此外，充足的細(xì)胞外Ca2+(促使跨越質(zhì)膜的Ca2+流入)導(dǎo)致WT T細(xì)胞中顯著性細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+潮涌，而Cacnalf+T細(xì)胞的增加明顯較小。另外，已發(fā)現(xiàn)CavL 4還在胸腺細(xì)胞中起作用且當(dāng)在不存在細(xì)胞外Ca2+下執(zhí)行TCR刺激時(shí)，對(duì)于細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+升高甚為重要(圖6)。
[0169]為驗(yàn)證CavL 4調(diào)節(jié)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞中，在TCR刺激之后通過(guò)在膜片鉗試驗(yàn)中采用鋇(Ba2+)作為載體監(jiān)測(cè)通道電流。用作Ca2+模擬物的Ba2+提供許多關(guān)鍵益處，因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)以下擴(kuò)大電流:(I)以更高電導(dǎo)通過(guò)Ca2+通道、⑵有效地阻斷鉀通道和(3)降低與Ca2+流入相關(guān)聯(lián)的二次信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。利用單掃描方案從_80mV到+IOmV來(lái)表征Cacnalf+/+和Cacnalf+OMfCDf和CD8+T細(xì)胞中的Ca2+電流。TCR交聯(lián)之后在WT中檢測(cè)到電流但在突變T細(xì)胞中未檢測(cè)到(圖7A和7B)。為測(cè)定L型通道在質(zhì)膜處是否起作用，將在存在或不存在胞外結(jié)構(gòu)域特異性CavI α I亞單元Ab下的TCR誘導(dǎo)的內(nèi)向電流進(jìn)行比較。已發(fā)現(xiàn)將Ab添加到WT⑶441°⑶4+和⑶8+T細(xì)胞阻斷在TCR刺激之后觀察到的內(nèi)向電流(圖7C)。此外，利用對(duì)照山羊Ab進(jìn)行處理未揭示對(duì)內(nèi)向電流的任何效應(yīng)。為驗(yàn)證胞外結(jié)構(gòu)域CavIa I亞單元Ab是否識(shí)別CavL 4，將WT和Cacnalf+脾細(xì)胞提取物與胞外結(jié)構(gòu)域CavI α I亞單元Ab 一起培育且疫沉淀利用CavL 4Ab進(jìn)行墨點(diǎn)分析(圖7D)。特別地在WT中檢測(cè)到CavL 4條帶而在Cacnalf+細(xì)胞中未檢測(cè)到支持當(dāng)TCR接合時(shí)CavL 4充當(dāng)Ca2+流入的導(dǎo)管的結(jié)論。
[0170]為進(jìn)一步表征在WT和Cacnalf+T細(xì)胞中TCR誘導(dǎo)的Ca2+電流的類型，使用斜坡脈沖方案以在TCR交聯(lián)時(shí)測(cè)量1-V曲線(圖7E和7F)。1-V關(guān)系的峰值電壓(Vmax)對(duì)于WTCD44lQCD4+和 CD8+T 細(xì)胞來(lái)說(shuō)分別為 16.3 ±5.2mV(n = 5)和 24.4 ±3.3mV(n = 5)。從經(jīng)修改的玻耳茲曼(Boltzmann)擬合獲得的半激活電位(Va)對(duì)于⑶4+T細(xì)胞為-0.2±4.7mV(n=5)且對(duì)于⑶8+T細(xì)胞為1.3±3.5mV(n = 5)。這些Va值與檢查在異源系統(tǒng)中表達(dá)的L型CavL 4通道的特性的先前報(bào)道 相當(dāng)(鮑曼(Baumann)等人,2004 ;麥克洛瑞等人,2004)。相比之下，Cacnair7XD^和⑶8+T細(xì)胞不響應(yīng)斜坡脈沖展示任何內(nèi)向電流(圖7G和7H)。總體來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)暗示，CavL 4是通過(guò)TCR信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)操作且其可在正發(fā)育的和初始型T細(xì)胞中用來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)Ca2+貯存池。
[0171]CavL 4功能調(diào)節(jié)Ras-ERK激活和NFAT動(dòng)員
[0172]為論述CavL 4通道是否影響Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)(在很大程度上涉及控制T細(xì)胞存活和分化的途徑)(阿爾貝羅拉-伊拉(Alberola-1la)和埃爾南德斯-霍約什(Hernandez-Hoyos)，2003)，開(kāi)始研究以測(cè)量在TCR刺激之后這些下游效應(yīng)子的激活狀態(tài)。對(duì)于Ras信號(hào)傳導(dǎo)，將WT和Cacnalf+胸腺細(xì)胞用TCR Ab刺激且隨后通過(guò)利用Raf-1-GST融合蛋白使Ras-GTP沉淀來(lái)評(píng)價(jià)Ras激活(圖8A)。已發(fā)現(xiàn),Cacnalf+胸腺細(xì)胞誘導(dǎo)比野生型細(xì)胞少50%的Ras-GTP。相比之下，當(dāng)細(xì)胞用二酰基甘油(DAG)類似物PMA刺激時(shí)，在各基因型之間經(jīng)激活Ras的量相當(dāng)類似。接下來(lái)，在TCR刺激后所指示時(shí)間下在所有胸腺細(xì)胞中實(shí)施下游作用MAP激酶ERK和JNK的激活分析(圖8B)。在Cacnalf+胸腺細(xì)胞中相對(duì)于WT在TCR交聯(lián)后ERK激活的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間減小。然而，在TCR刺激時(shí)WT和Cacnalf+胸腺細(xì)胞之間的JNK磷酸化的比較揭示僅存在邊緣差異。相比之下，發(fā)現(xiàn)PMA處理引發(fā)強(qiáng)ERK和JNK磷酸化，而無(wú)論細(xì)胞基因型如何?？傮w來(lái)說(shuō)，這些研究揭示CavL 4缺乏選擇性地影響ERK的激活。為評(píng)價(jià)在Cacnalf+成熟SP胸腺細(xì)胞中ERK激活是否受影響，在用TCR Ab刺激或PMA處理之前和之后利用磷酸-流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)ERK活性(圖8C)。在TCR刺激時(shí)Cacnair7TDf和⑶8+SP胸腺細(xì)胞相對(duì)于WT展現(xiàn)減小的ERK激活，而在PMA刺激時(shí)未展現(xiàn)。
[0173]NFAT蛋白質(zhì)(胸腺細(xì)胞發(fā)育和T細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑)經(jīng)磷酸化且主要駐留在靜止T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(歐.奧拉，2009)。當(dāng)T細(xì)胞受體刺激時(shí)，Ca2+信號(hào)誘導(dǎo)絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶鈣神經(jīng)素的激活，此催化NFAT去磷酸化并觸發(fā)其隨后易位到細(xì)胞核。為測(cè)定在TCR接合之后不足的Ca2+釋放是否影響Cacnalf+胸腺細(xì)胞中的NFAT易位和激活，檢查WT和Cacnalf+胸腺細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞核部分中的NFATcl量(圖8D)。發(fā)現(xiàn)Cacnalf+胸腺細(xì)胞與WT細(xì)胞相比具有較少的細(xì)胞核NFATcl?？傊@些試驗(yàn)闡明，CavL 4依賴性Ca2+進(jìn)入調(diào)節(jié)NFAT和ERK途徑的激活。
[0174]T細(xì)胞固有的CavL 4功能是正常T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需要的
[0175]為測(cè)定在T細(xì)胞自身中CavL 4功能的損失是否有助于受損的T細(xì)胞發(fā)育和/或外周T細(xì)胞維持，執(zhí)行骨髓轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，其中將相等數(shù)量的T細(xì)胞耗盡的WT (Thyl.1+Ly5.2+)和Cacnalf+(Thy1.2+Ly5.2+)骨髓轉(zhuǎn)移 到經(jīng)輻照同基因型(Ly5.1+)宿主中。轉(zhuǎn)移后I個(gè)月，胸腺和脾臟中供體細(xì)胞頻率(Ly5.2+)的評(píng)價(jià)揭示對(duì)于宿主的T細(xì)胞重構(gòu)，Cacnalf+骨髓細(xì)胞與WT的競(jìng)爭(zhēng)極差(圖9A)。胸腺和外周中WT供體CD4+和CD8+T細(xì)胞的頻率實(shí)質(zhì)上分別高于Cacnalf+OM+和CD8+T細(xì)胞的頻率(圖9A和9B)。此外，CD441。對(duì)CD44hiCD4+和⑶8+T細(xì)胞群的比率的比較展示，Cacnalf+脾供體T細(xì)胞相對(duì)于野生型供體T細(xì)胞朝向記憶表型偏移(圖9C)。另外，這些試驗(yàn)暗示，Cacnalf+小鼠中Cacnalf+CD44hiT細(xì)胞的提高的頻率并不是由于淋巴細(xì)胞減少的緣故，而是由于不能維持CacnalfvXDAft5T細(xì)胞?？傊@些結(jié)果闡明，T細(xì)胞原粒子和/或成熟T細(xì)胞中CavL 4的細(xì)胞固有的功能是有效的T細(xì)胞重構(gòu)所需的。
[0176]CavL 4是初始型T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑
[0177]Cacnalf+小鼠的淋巴細(xì)胞減少且大多數(shù)殘留T細(xì)胞具有經(jīng)激活或記憶表型的發(fā)現(xiàn)暗示，CavL 4功能是初始型T細(xì)胞維持所必需的。另外，T細(xì)胞子集基于⑶44表達(dá)的比較揭示，Cacnalf+小鼠相對(duì)于WT展現(xiàn)⑶441()T細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p失，而⑶44hiT細(xì)胞數(shù)量受影響非常小(圖1OA和10B)。為測(cè)定各群組之間細(xì)胞更新率是否有差異，將WT和Cacnalf+T細(xì)胞用細(xì)胞凋亡標(biāo)志物膜聯(lián)蛋白V染色(圖10C)。CacnairACDAft5相對(duì)于其WT對(duì)應(yīng)物顯示增強(qiáng)的膜聯(lián)蛋白V反應(yīng)性，而⑶44hiT細(xì)胞未顯示。Cacnair7TDAft5T細(xì)胞的表面表型檢查展示，其看起來(lái)成熟了，其相對(duì)于⑶62L、TCRii和⑶69表達(dá)類似WT初始型T細(xì)胞(參見(jiàn)(例如)圖10D)。總之，這些數(shù)據(jù)暗示，Cacnalf+小鼠中⑶441()T細(xì)胞的有限數(shù)量至少部分地是由于其降低的適應(yīng)性的緣故。
[0178]通過(guò)IL-7 受體(IL-7R) (IL_7Ra (CD127)與共有 Y -鏈(CD132)的異二聚體)的信號(hào)傳導(dǎo)在初始型T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到管控作用，且在小鼠和人類二者中IL-7或IL-7R的損失導(dǎo)致T細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少和嚴(yán)重的免疫缺乏(蘇赫(Surh)和斯普林特(Sprent)，2008)。因此，研究IL-7R在Cacnal f+OMfT細(xì)胞中的表達(dá)(圖10E)。發(fā)現(xiàn)Cacnalf+OMfT細(xì)胞僅表達(dá)WT CD 127量的約50 %，但是表達(dá)WT CD 132。WT和Cacnair7XD^和CD8+TCRi3 +SP胸腺細(xì)胞之間膜聯(lián)蛋白V的反應(yīng)性和IL-7R的分析揭示與上文針對(duì)外周⑶441()T細(xì)胞的比較所指出的類似的發(fā)現(xiàn)(圖11)。盡管⑶127表達(dá)減小，但Cacnal f+QMfOM+和CD8+T細(xì)胞顯示W(wǎng)T數(shù)量的促存活蛋白Bcl_2 (圖10F)。這些發(fā)現(xiàn)暗示，CavL 4可部分地通過(guò)⑶127調(diào)節(jié)影響初始型T細(xì)胞適應(yīng)性。
[0179]CavL 4促使存活信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)的T細(xì)胞擴(kuò)增
[0180]為測(cè)定CavL 4缺乏和其在IL_7Ra表達(dá)中的伴隨減少功能上是否顯著，通過(guò)追蹤其下游效應(yīng)子STAT5的磷酸化狀態(tài)來(lái)監(jiān)測(cè)IL-7R信號(hào)傳導(dǎo)(圖12A)。將WT和CacnaIf+OM+和⑶8+SP胸腺細(xì)胞用各個(gè)劑量的IL-7刺激并用磷酸-Y647 STAT5特異性Ab進(jìn)行染色。Cacnalfv-QM+和CD8+SP胸腺細(xì)胞展示與WT相比，在所測(cè)試的所有IL-7劑量下STAT5磷酸化均明顯減小。然后，研究CavL 4缺乏是否影響IL-7促使T細(xì)胞存活的能力。通過(guò)細(xì)胞分選來(lái)分離WT和Cacnair7TDAfT細(xì)胞并將置于具有所指示濃度的IL-7的培養(yǎng)基中，并在24小時(shí)后經(jīng)由膜聯(lián)蛋白V染色評(píng)價(jià)其生存力(圖12B)。發(fā)現(xiàn)Cacnalf+CDAfT細(xì)胞遠(yuǎn)不能像WT那樣利用IL-7來(lái)維持其活體外存活。另外，當(dāng)置于TCR Ab涂布的孔中離體培養(yǎng)24小時(shí)，Cacnal f+CDAfCDfT細(xì)胞相對(duì)于WT展現(xiàn)減小的存活(圖12C)?？傮w來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)暗示，CavL 4通道蛋白通過(guò)IL-7或TCR信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)影響初始型T細(xì)胞存活。
[0181]初始型T細(xì)胞區(qū)室的大小受IL-7和自身肽-主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子二者的可用性的限制(蘇赫和斯普林特，2008)。為檢查CacnalfvXDAft5T細(xì)胞在活體內(nèi)的增殖可能性，將WT (Thyl.1+)和Cacnalf+ (Thyl.2+) CD44loCD4+和CD8+T細(xì)胞純化，以1:1:1:1比率混合在一起，用羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)進(jìn)行標(biāo)記并共同注入先天性淋巴細(xì)胞減少的Ragl+宿主中(圖12D)。在活體內(nèi)駐留7天之后，回收供體T細(xì)胞并經(jīng)由CFSE稀釋評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖(圖12E)。通過(guò)使用同基因型標(biāo)志物Thyl.1，已發(fā)現(xiàn)所回收供體WT細(xì)胞的比例遠(yuǎn)大于Cacnalf+細(xì)胞。通過(guò)對(duì)可能響應(yīng)來(lái)自IL-7和自身肽-MHC分子的誘因的供體T細(xì)胞進(jìn)行電子門控(凱佩爾(Kieper)等人，2005)，發(fā)現(xiàn)CacnalfvTDf和⑶8+T 細(xì)胞經(jīng)歷比WT⑶4+和⑶8+T細(xì)胞少的細(xì)胞分裂(圖12F)?？傮w來(lái)說(shuō)，這些研究暗示細(xì)胞固有的CavL 4功能對(duì)于T細(xì)胞適當(dāng)響應(yīng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)和存活誘因是至關(guān)重要的。
[0182]CavL 4功能是功能性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答必需的
[0183]為研究在免疫應(yīng)答中CavL 4功能的需求，將WT和Cacnalf+小鼠用表達(dá)重組單核細(xì)胞增多性利斯特菌的卵白蛋白(rLM-OVA)進(jìn)行攻擊。Cacnalf+小鼠當(dāng)用rLM-OVA進(jìn)行攻擊時(shí)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上降低數(shù)量的OVA反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞(圖13A和13B)。功能性抗原特異性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的數(shù)目在Cacnalf+小鼠中相對(duì)于WT顯著減少(圖13C和13D)。另外，在Cacnalf+小鼠中生產(chǎn)IFN-Y的⑶8+T細(xì)胞效應(yīng)子的總數(shù)目也減少(圖13E)。接著，評(píng)估來(lái)自rLM-OVA感染W(wǎng)T和Cacnalf+小鼠的純化CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞溶解功能(圖13F)。Cacnair7-小鼠相對(duì)于WT展現(xiàn)產(chǎn)生抗原特異性CTL的能力極大地消弱?？傊?，這些研究展示，CavL 4對(duì)于增加生產(chǎn)性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答是至關(guān)重要的。
[0184]討論:
[0185]Cav通道是控制可興奮細(xì)胞中Ca2+進(jìn)入的主要通道且調(diào)節(jié)許多過(guò)程，包括肌肉收縮、神經(jīng)信號(hào)傳輸和基因轉(zhuǎn)錄(范思凱(Feske)，2007)。然而，Cav通道在非可興奮細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞)中的生物作用界定較不充分。鑒別出構(gòu)成在昏睡小鼠品系中觀察到的神經(jīng)和免疫系統(tǒng)缺陷的起因的VDCC的β 4亞單元中的突變與免疫調(diào)節(jié)中的Cav功能有關(guān)(伯吉斯(Burgess)等人，1997)。另外，描述β 3調(diào)節(jié)亞單元缺乏的小鼠的手稿已認(rèn)為Cav通道在調(diào)控TCR信號(hào)傳導(dǎo)和⑶8+Τ細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起作用(杰哈等人，2009)。為研究L型CavL 4通道在發(fā)育中和成熟T細(xì)胞中的生理功能，分析其成孔α?亞單元缺乏的小鼠。此實(shí)例中所描述的研究指示，CavL 4通道對(duì)于初始型⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞的存活和病原體特異性⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞相應(yīng)的產(chǎn)生二者均至關(guān)重要。此外，初始型⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞展示SOCE、TCR誘導(dǎo)的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的升高和下游TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而言均依賴于CavL 4功能。[0186] Cacnalf+小鼠的分析揭示，發(fā)育和分化的各個(gè)階段的T細(xì)胞對(duì)于調(diào)介Ca2+應(yīng)答展示對(duì)CavL 4的不同相對(duì)依賴性。舉例來(lái)說(shuō)，Cacnalf^SP胸腺細(xì)胞相對(duì)于WT在TCR或毒胡蘿卜內(nèi)酯誘導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+的升高方面展現(xiàn)比當(dāng)比較外周初始型和記憶型WT和Cacnalf+T細(xì)胞時(shí)所觀察到的較適度的降低。
[0187]CavL 4通道可通過(guò)對(duì)RasGRPl (Ras-鳥苷酸交換因子)的效應(yīng)調(diào)節(jié)Ras-ERK級(jí)聯(lián)。RasGRPl的兩個(gè)“EF手臂”結(jié)構(gòu)域通過(guò)結(jié)合Ca2+、決定其細(xì)胞定位和Ras-ERK信號(hào)傳導(dǎo)的持續(xù)時(shí)間起作用(特謝羅(Teixeiro)和丹尼爾斯(Daniels), 2010)。另外，Cav1.4的損失影響TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)暗示，Cacnalf+小鼠中的中心或外周耐受將受損。盡管還未執(zhí)行利用Cacnalf+TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的陰性選擇研究，但Cacnalf+小鼠中的脾調(diào)節(jié)T (Treg)細(xì)胞(定義為CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞)的數(shù)目為WT中的Treg細(xì)胞的50% (Cacnalf+ =
0.84±0.23X 106對(duì)WT = 1.75±0.44X IO6)。然而，很可能胸腺中自體反應(yīng)性T細(xì)胞的刪除或其在外周中調(diào)節(jié)T細(xì)胞的阻抑均未受CavL 4缺乏干擾，因?yàn)樵贑57BL/6背景上培育13代的Cacnalf+小鼠看起來(lái)健康，所檢查的各個(gè)組織中沒(méi)有任何整體組織學(xué)異常，且保持淋巴細(xì)胞減少。
[0188]CavL 4對(duì)于初始型⑶4+和⑶8+T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的發(fā)現(xiàn)暗示，通道調(diào)控其存活所需的信號(hào):在IL-7暴露之后當(dāng)其與自身肽-MHC分子和IL-7R信號(hào)傳導(dǎo)接觸時(shí)TCR信號(hào)傳導(dǎo)(蘇赫和斯普林特，2005)。先前工作已暗示樹突細(xì)胞上的MHC分子的初始型T細(xì)胞TCR識(shí)別觸發(fā)其存活所需的小的Ca2+應(yīng)答(勒維(Revy)等人，2001)。因此，我們假設(shè)與自身抗原的低親和性TCR相互作用也許作為TCR信號(hào)傳導(dǎo)的直接結(jié)果或通過(guò)與SHMl的相互作用誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞打開(kāi)CavL 4通道(帕克(Park)等人，2010 ;王(Wang)等人，2010)。顯然，已發(fā)現(xiàn)CavL 4以及CavL 3具有低激活閾值，對(duì)于其激活不需要強(qiáng)烈的去極化(里普斯科姆(Lipscombe)等人,2004)。CavL 4介導(dǎo)的來(lái)自細(xì)胞外部的Ca2+流入可能誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)以及有助于對(duì)于TCR存活信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要的細(xì)胞內(nèi)Ca2+貯存池的強(qiáng)力填充。我們懷疑有至少兩個(gè)輔助因素可有助于Cacnalf+T細(xì)胞在刺激時(shí)所觀察到的Ca2+釋放缺陷:(I)降低的ER Ca2+貯存池，其導(dǎo)致減小的SOCE和⑵減小的通過(guò)CRAC通道的內(nèi)向Ca2+通量，其協(xié)作而損害Ca2+依賴性信號(hào)傳導(dǎo)。顯然，低級(jí)別TCR信號(hào)傳導(dǎo)和初始型T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)已展示依賴于RasGRPl (普若艾陶等人，2002)?？傊@些數(shù)據(jù)暗示，由淋巴表達(dá)的CavL 4通道控制的Ca2+電流影響初始型T細(xì)胞的生存力且可是保存表達(dá)TCR的不同譜型的初始型T細(xì)胞群所必需的。
[0189]實(shí)例2:利用阻斷抗體抑制CAvI減?、?+和⑶4+T細(xì)胞的存活
[0190]T細(xì)胞存活分析
[0191]將C57B1/6脾細(xì)胞在96孔平底板中以5X106個(gè)細(xì)胞/孔在RPMI完全培養(yǎng)基中在有或沒(méi)有胞外結(jié)構(gòu)域特異性CavI α I亞單元抗體(克隆SC-32070 ;圣克魯茲)下培養(yǎng)。此抗體是針對(duì)CavL 3產(chǎn)生，但與CavL 4交叉反應(yīng)。如圖7D中所示，此抗體結(jié)合脾細(xì)胞中的CavL 4。
[0192]24小時(shí)后，通過(guò)以下測(cè)定生存力:將樣品用⑶8 (克隆53-6.7 ;BD生物科學(xué))和⑶4 (克隆GKl.5 ；BD生物科學(xué))抗體標(biāo)記，與膜聯(lián)蛋白V-Alexa 647 (英杰公司)在含Ca2+的緩沖液中在室溫下培育15分鐘且隨后在BD FACSCalibur上采集數(shù)據(jù)。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提供于圖14中。[0193]如實(shí)例I中所述，缺少CavL 4蛋白的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞在外周中展現(xiàn)減小的存活。為驗(yàn)證抑制CavL 4功能導(dǎo)致降低的T細(xì)胞適應(yīng)性，將脾細(xì)胞在有或沒(méi)有胞外結(jié)構(gòu)域特異性CavI α I亞單元抗體下培育。如圖14中所示，在阻斷抗體存在下，⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞顯示增強(qiáng)的膜聯(lián)蛋白V反應(yīng)性，此指示增加的細(xì)胞凋亡。因此，此實(shí)例證實(shí)CavL 4通道有助于初始型T細(xì)胞維持且利用阻斷抗體抑制CavL 4功能損害T細(xì)胞存活。
[0194]實(shí)例3:利用阻斷抗體抑制CAvI減?、?+和⑶4+Τ細(xì)胞增殖.[0195]T細(xì)胞增殖分析
[0196]C57B1/6脾細(xì)胞經(jīng)CFSE (英杰公司)標(biāo)記并在96孔平底板中以5 X IO6個(gè)細(xì)胞/孔在RPMI完全培養(yǎng)基中在有或沒(méi)有CavIAb (克隆SC-32070 ;圣克魯茲)下培養(yǎng)。將細(xì)胞用10 μ g/mL板結(jié)合CD3 ε (克隆145-2C11)和5 μ g/ml板結(jié)合CD28 (克隆37.51)抗體激活。5天后，將樣品用⑶8 (克隆53-6.7 ；BD生物科學(xué))和⑶4 (克隆GKl.5 ；BD生物科學(xué))抗體標(biāo)記并通過(guò)CFSE稀釋使用BD FACSCalibur評(píng)價(jià)T細(xì)胞增殖。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提供于圖15中。
[0197]如實(shí)例I中所示，缺少CavL 4蛋白質(zhì)減?、?+和⑶8+T細(xì)胞增殖可能性。為證實(shí)細(xì)胞表面CavL 4的抑制影響T細(xì)胞分裂，將經(jīng)CFSE標(biāo)記的脾細(xì)胞通過(guò)TCR利用板結(jié)合⑶3和可溶性CD28抗體激活并在有或沒(méi)有胞外結(jié)構(gòu)域特異性CavI α I亞單元抗體下培育。如圖15中所示，在阻斷抗體存在下，發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細(xì)胞經(jīng)歷較少的細(xì)胞分裂。此實(shí)例闡明利用阻斷抗體抑制CavL 4功能減小TCR激活之后的T細(xì)胞增殖。[0198]實(shí)例4:CAV1.4鈣通道在B淋巴細(xì)胞中的作用.[0199]實(shí)施以下試驗(yàn)以測(cè)定CavL 4在B細(xì)胞生物學(xué)中的生理功能。
[0200]實(shí)驗(yàn)方法:
[0201]小鼠:先前已描述Cacnalf-/-小鼠(曼瑟等人，2005)。將這些小鼠與C57BL/6 (⑶45.2+)背景回交達(dá)至少13代。從杰克遜實(shí)驗(yàn)室(緬因州巴港)獲得Β6.SJL-Ptprca Pep3b/BoyJ(CD45.1+)小鼠。根據(jù)加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)和英屬哥倫比亞大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)(the Animal Care Committee of the University of BritishColumbia)設(shè)定的指導(dǎo)方針執(zhí)行研究。
[0202]流式細(xì)胞術(shù):為研究B細(xì)胞發(fā)育，制備骨髓、脾臟和腹膜腔灌洗液的單細(xì)胞懸浮液且在紅細(xì)胞溶解后，將細(xì)胞在冰上利用各種抗體對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物染色30分鐘用于鑒別特定B細(xì)胞子集，如圖中所指示。為評(píng)價(jià)BAFF受體的表面表達(dá)，將脾細(xì)胞用BAFF受體、B220、IgM、CD21和CD23抗體進(jìn)行表面染色。使用BD? LSR II流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué))利用FACSDiva?軟件采集數(shù)據(jù)并利用Flowjo軟件(翠絲塔)進(jìn)行分析。
[0203]脾B細(xì)胞純化和活體外刺激:對(duì)于原代鼠類B細(xì)胞純化，從野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠的脾臟制備單細(xì)胞懸浮液。紅細(xì)胞溶解之后，使用EasySep小鼠B細(xì)胞富集試劑盒(干細(xì)胞技術(shù)公司)根據(jù)制造商說(shuō)明書陰性選擇B淋巴細(xì)胞。然后將已通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析通常> 90% B220+的經(jīng)純化脾B淋巴細(xì)胞重新懸浮于補(bǔ)充有10% FBS、2mML-谷氨酰胺、50 μ Μβ-巰基乙醇、IOmM HEPES 和 100U/mL 盤尼西林(penicillin)、100 μ g/ml鏈霉素(streptomycin)的RPMI 1640(英杰公司)中。為評(píng)價(jià)當(dāng)刺激時(shí)表面激活標(biāo)志物的表達(dá)水平，脾B細(xì)胞未經(jīng)刺激或經(jīng)F (ab ' ) 2片段山羊抗小鼠IgM(杰克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))、抗小鼠0)40(易生物科學(xué))或脂多糖(LPS,因沃唯真(Invivogen))以所指示濃度刺激。24小時(shí)之后，細(xì)胞用B220、⑶69和⑶86抗體染色并通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析。
[0204]對(duì)于增殖分析，將經(jīng)純化的B淋巴細(xì)胞用2uM羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE，分子探針公司(Molecular Probes))染色并在存在或不存在所指示濃度的抗IgM或LPS下培養(yǎng)。72小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析CFSE稀釋。
[0205]為評(píng)價(jià)當(dāng)BAFF刺激時(shí)B細(xì)胞的存活，將經(jīng)純化脾B細(xì)胞在存在或不存在所指示濃度的重組小鼠BAFF(R & D系統(tǒng))下培養(yǎng)72小時(shí)。利用碘化丙啶(propidium iodide)(分子探針公司)染色之后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。使用BD? LSR II流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué))利用FACSDiva?軟件采集數(shù)據(jù)并利用Flowjo軟件(翠絲塔)進(jìn)行分析。
[0206]骨髓嵌合體:將來(lái)自⑶45.2+野生型或Cacnalf-/-小鼠的供體骨髓與來(lái)自⑶45.1+⑶45.2+同基因型野生型小鼠的競(jìng)爭(zhēng)骨髓以1:1的比率混合。將每小鼠總共3X IO6個(gè)骨髓細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到經(jīng)歷1，100拉德Y輻照的受體⑶45.1+野生型小鼠中。重構(gòu)后8周，收集脾臟、骨髓和腹膜腔細(xì)胞用于分析。
[0207]細(xì)胞質(zhì)和線粒體Ca2+測(cè)量:為研究CavL 4在B細(xì)胞Ca2+通量中的參與，在室溫下將來(lái)自野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠的脾細(xì)胞加載存于含有2% FBS的HBSS中的細(xì)胞內(nèi)鈣染料富洛4和富拉紅(分子探針公司)達(dá)45分鐘。洗滌之后，細(xì)胞在冰上用B220抗體表面染色達(dá)30分鐘。將樣品懸浮于RPMI中并在刺激之前在37°C下預(yù)熱15分鐘。在所指示時(shí)間點(diǎn)下將細(xì)胞用30μ g/mL F(ab' )2片段山羊抗小鼠IgM(杰克遜免疫研究公司)、I μ M毒胡蘿卜內(nèi)酯(分子探針公司)或I μ g/mL離子霉素(西格瑪公司(Sigma))刺激。通過(guò)添加乙二醇四乙酸(EGTA)實(shí)施細(xì)胞外Ca2+的螯合。將脾B淋巴細(xì)胞(B220+)中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平以富洛4/富拉紅隨時(shí)間的比率繪制曲線。為評(píng)價(jià)Cavl.4缺乏是否導(dǎo)致線粒體鈣攝入的變化，將來(lái)自野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠的脾細(xì)胞加載羅德2 (Rhod_2)(分子探針公司)(線粒體Ca2+指示劑)并通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析。羅德2在加載到細(xì)胞中之前被還原為二氫羅德2，其已展示改良細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體局部化之間的辨別。羅德2標(biāo)記的細(xì)胞然后用B220抗體染色并如上文所指示在存在或不存在用以破壞線粒體膜電位的擬基氰基 3_ 氯苯腙(carbonyl cyanide3-chlorophenylhydrazone, CCCP,分子探針公司)或用以螯合細(xì)胞外Ca2+的EGTA下進(jìn)行刺激。在來(lái)自野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠加載有細(xì)胞內(nèi)鈣染料富洛4和富拉紅的脾細(xì)胞中實(shí)施平行試驗(yàn)以評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)和線粒體鈣水平變化之間的關(guān)系。在BD? LSR II流式細(xì)胞儀上使用FACSDiva?軟件采集數(shù)據(jù)并利用Flowjo (翠絲塔)分析。
[0208]TNP-聚蔗糖免疫:為引起T細(xì)胞非依賴性2型抗體應(yīng)答，將年齡和性別匹配的C57BL/6和Cacnalf-/-小鼠腹腔內(nèi)注射50 μ g2，4，6-三硝基苯酚(TNP)-氨基乙基羧甲基(AECM)-鹿聚糖(生物研究技術(shù)公司(Biosearch Technologies))。在免疫之前且在注射之后7天收集血清并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)進(jìn)行分析。ELISA板在4°C下用TNP-BSA涂布過(guò)夜，洗滌并用1% (vol/voDBSA在37°C下封阻I小時(shí)。然后添加血清樣品的連續(xù)稀釋液并在37°C下培育I小時(shí)。將板洗滌之后，添加辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗小鼠IgM或抗小鼠IgG3 (南方生物科技)并在37°C下再培育I小時(shí)，隨后與SureBlue Reserve四甲基聯(lián)苯胺底物溶液(KPL)反應(yīng)并在450nm下測(cè)量吸光度。
[0209]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用Graphpad Prism軟件使用雙尾未配對(duì)司徒登氏t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性。將P <0.05的值視為顯著。數(shù)據(jù)表示為平均值土SD。
[0210]結(jié)果
[0211]CavL 4缺乏的小鼠在骨髓中展示正常B淋巴細(xì)胞發(fā)育。
[0212]圖22A闡明，Cav1.4缺乏的小鼠在骨髓中的B淋巴細(xì)胞的頻率和數(shù)目未改變。通過(guò)經(jīng)B220抗體標(biāo)記的骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞分析來(lái)測(cè)定骨髓中的B淋巴細(xì)胞的頻率(淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))和總數(shù)。圖22B闡明，Cav1.4缺乏的小鼠從前祖B細(xì)胞(pre-pro-B cell)階段到未成熟階段具有未改變的進(jìn)展，但骨髓中的再循環(huán)成熟B淋巴細(xì)胞的數(shù)目有明顯減少。骨髓中每一 B淋巴細(xì)胞(B220+)子集的總數(shù)是通過(guò)經(jīng)各種抗體標(biāo)記的細(xì)胞的流式細(xì)胞分析來(lái)測(cè)定。根據(jù)哈迪門控方案(Hardy gating scheme)定義各群:前祖 B 細(xì)胞，B220+CD43+BP-1-HSA-;祖 B 細(xì)胞，B220+CD43+BP-1-HSA+ ;早期前B 細(xì)胞，B220+CD43+BP-1+HSA+;晚期前 B 細(xì)胞，B220+CD43-1gM_IgD-;未成熟前 B 細(xì)胞，B220+CD43-1gM+IgD-;和再循環(huán)成熟 B 細(xì)胞(成熟)，B220+CD43_IgM+IgD+。**p < 0.01。
[0213]CavL 4缺乏的小鼠展示改變的脾B淋巴細(xì)胞成熟。
[0214]圖23A闡明CavL 4缺乏的小鼠展現(xiàn)減小的脾B細(xì)胞的頻率和數(shù)目。通過(guò)經(jīng)B220抗體標(biāo)記的脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析來(lái)測(cè) 定脾臟中的B淋巴細(xì)胞的頻率(淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))和總數(shù)。圖23B闡明，Cav1.4缺乏的小鼠展現(xiàn)改變的脾B細(xì)胞子集的百分?jǐn)?shù)，其中邊緣區(qū)B細(xì)胞的頻率和數(shù)目顯著減小。通過(guò)經(jīng)針對(duì)所指示表面分子的抗體標(biāo)記的脾細(xì)胞的流式細(xì)胞分析來(lái)測(cè)定脾臟中每一 B淋巴細(xì)胞(B220+)子集的的頻率和總數(shù)。B細(xì)胞群定義如下:過(guò)渡期 Tl，CD93+CD23-1gMhigh IgD-/low CD21/35_/low ;過(guò)渡期 T2，CD93+CD23+IgMhighIgDhigh CD21/351ow ;過(guò)渡期T3，CD93+CD23+IgMlow IgDhigh CD21/351ow ;濾泡型 I (Fol)，CD93-CD23+IgMlow IgDhigh CD21/35int.;濾泡型 II (Fo2)，CD93_/low CD23+IgMhighIgDhigh CD21/35int.;邊緣區(qū)前體(MZP)CD93_/low CD23+sIgMhigh CDld+IgDhighCD21/35high ;和邊緣區(qū)(MZ)CD93-CD23_IgMhigh IgDlow CD21/35high。*p < 0.05，**p< 0.01 和 ***p < 0.001。
[0215]Cavl.4缺乏導(dǎo)致改變的腹膜腔B細(xì)胞區(qū)室。
[0216]圖24闡明Cavl.4缺乏導(dǎo)致改變的腹膜腔B細(xì)胞區(qū)室。A.通過(guò)經(jīng)B220抗體標(biāo)記的細(xì)胞的流式細(xì)胞分析來(lái)測(cè)定腹膜腔中B淋巴細(xì)胞的頻率(淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))。B.通過(guò)經(jīng)B220、⑶Ilb和⑶5抗體標(biāo)記的細(xì)胞的流式細(xì)胞分析來(lái)測(cè)定腹膜腔中每一 B淋巴細(xì)胞(B220+)子集的百分?jǐn)?shù)。B細(xì)胞群定義如下:常規(guī)B2 B細(xì)胞，B220+⑶lib-;Bla B細(xì)胞，B220+CDllb+CD5+ ;和 Blb B 細(xì)胞，B220+CDllb+CD5_。**p < 0.01 和 ***p < 0.001。
[0217]細(xì)胞固有的Cavl.4功能是正常B細(xì)胞發(fā)育所需的。
[0218]圖25闡明細(xì)胞固有的Cavl.4功能是正常B細(xì)胞發(fā)育所需的。重構(gòu)后8周分析靜脈內(nèi)注射野生型⑶45.1+⑶45.2+(競(jìng)爭(zhēng)者)加野生型⑶45.2+(供體)骨髓或野生型CD45.1+CD45.2+(競(jìng)爭(zhēng)者)加Cacnalf-/_CD45.2+(供體)骨髓的I: I混合物的經(jīng)致死輻照的同基因型CD45.1+野生型受體小鼠的B細(xì)胞發(fā)育的流式細(xì)胞術(shù)。結(jié)果表示為骨髓(A)、脾臟(B)和腹膜腔(C)中⑶45.2+供體淋巴細(xì)胞對(duì)⑶45.1+⑶45.2+競(jìng)爭(zhēng)者淋巴細(xì)胞的比率(+/+藍(lán)色正方形，野生型CD45.2+供體對(duì)CD45.1+CD45.2+競(jìng)爭(zhēng)者細(xì)胞；-/-紅色三角形，Cacnalf-/-CD45.2+供體對(duì)CD45.1+CD45.2+競(jìng)爭(zhēng)者細(xì)胞)。B細(xì)胞群定義如下:在骨髓中，總 B 細(xì)胞，B220+;祖 B 細(xì)胞，B220+IgM-CD43+;前 B 細(xì)胞，B220+IgM_CD43-;未成熟B細(xì)胞，B2201owIgM+ ;和再循環(huán)成熟B細(xì)胞，B220highIgM+ ;在脾臟中，過(guò)渡期TlB 細(xì)胞，B220+IgM+CD2rCD23-;過(guò)渡期 T2B 細(xì)胞，B220+IgM+CD21+CD23+ ;濾泡 B 細(xì)胞，8220+181^0)21-;和邊緣區(qū)B細(xì)胞，B220+IgM+CD21+CD23-;且在腹膜腔中，常規(guī)B2B細(xì)胞，B220+CDllb-;Bla B 細(xì)胞，B220+CDllb+CD5+;且 Blb B 細(xì)胞，B220+CDllb+CD5_。
[0219]CavL 4缺乏導(dǎo)致B細(xì)胞中受損的B細(xì)胞受體和毒胡蘿卜內(nèi)酯誘導(dǎo)的Ca2+應(yīng)答。
[0220]圖26闡明CavL 4缺乏導(dǎo)致B細(xì)胞中受損的B細(xì)胞受體和毒胡蘿卜內(nèi)酯誘導(dǎo)的Ca2+應(yīng)答。將野生型(+/+，藍(lán)色線)和Cacnalf-/-(-/_，紅色線)脾細(xì)胞加載細(xì)胞內(nèi)Ca2+染料富洛4和富拉紅，利用B220抗體進(jìn)行表面染色并通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析。將脾B淋巴細(xì)胞(B220+)中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平以富洛4/富拉紅隨時(shí)間的比率繪制曲線。將脾B淋巴細(xì)胞用抗IgM(BCR)、離子霉素(1n)或毒胡蘿卜內(nèi)酯(Tg)在所指示時(shí)間點(diǎn)下刺激。通過(guò)EGTA添加螯合細(xì)胞外Ca2+。
[0221]Cavl.4缺乏導(dǎo)致受損的B細(xì)胞受體誘導(dǎo)的線粒體Ca2+應(yīng)答。
[0222]圖27闡明Cavl.4缺乏導(dǎo)致受損的B細(xì)胞受體誘導(dǎo)的線粒體Ca2+應(yīng)答。將野生型(+/+，藍(lán)色線)和Cacnalf-/-(-/_，紅色線)脾細(xì)胞加載細(xì)胞內(nèi)Ca2+染料富洛4和富拉紅(A)或線粒體Ca2+染料 羅德2 (B)，利用B220抗體進(jìn)行表面染色并通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析。將脾B淋巴細(xì)胞(B220+)中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平以富洛4/富拉紅隨時(shí)間的比率繪制曲線。將細(xì)胞用抗IgM(BCR)或離子霉素(1n)在所指示時(shí)間點(diǎn)下在存在或不存在用以破壞線粒體膜電位的羰基氰基3-氯苯腙或用以螯合細(xì)胞外Ca2+的EGTA下進(jìn)行刺激。
[0223]CavL 4缺乏的B細(xì)胞展示缺陷性B細(xì)胞受體介導(dǎo)的激活。
[0224]圖28闡明CavL 4缺乏的B細(xì)胞展示缺陷性B細(xì)胞受體介導(dǎo)的激活。野生型(+/+，藍(lán)色線)和Cacnalf-/-(-/-，紅色線)脾細(xì)胞未經(jīng)刺激(灰色)或經(jīng)抗IgM、抗⑶40或LPS以所指示濃度刺激24小時(shí)，利用B220、⑶69 (A)和⑶86 (B)抗體進(jìn)行表面染色并通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析。劃分線之上的數(shù)值代表表面標(biāo)志物上調(diào)的脾B細(xì)胞(B220+)的百分?jǐn)?shù)。
[0225]CavL 4缺乏的B細(xì)胞展示減小的B細(xì)胞受體誘導(dǎo)的增殖。
[0226]圖29闡明CavL 4缺乏的B細(xì)胞展示減小的B細(xì)胞受體誘導(dǎo)的增殖。野生型(+/+，藍(lán)色線)和Cacnalf-/-(-/-，紅色線)經(jīng)CFSE標(biāo)記的脾細(xì)胞未經(jīng)刺激(灰色)或經(jīng)抗IgM或LPS以所指示濃度刺激72小時(shí)且然后利用B220抗體進(jìn)行表面染色并通過(guò)流式細(xì)胞進(jìn)行分析。劃分線之上的數(shù)值代表分裂細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
[0227]Cavl.4缺乏的脾B細(xì)胞響應(yīng)BAFF展示減小B細(xì)胞激活因子(BAFF)受體的表達(dá)和較低的存活率。
[0228]圖30闡明Cavl.4缺乏的脾B細(xì)胞響應(yīng)BAFF展示減小B細(xì)胞激活因子(BAFF)受體的表達(dá)和較低的存活率。A.來(lái)自野生型(+/+，黑色)和Cacnalf-/-(-/-，灰色)小鼠的總B220+脾B細(xì)胞和脾B細(xì)胞子集中的BAFF受體的表面表達(dá)的流式細(xì)胞分析。B細(xì)胞群定義如下:過(guò)渡期 TlB細(xì)胞，B220+IgM+CD21XD23-;過(guò)渡期 T2B 細(xì)胞，B220+IgM+CD21+CD23+ ;濾泡B 細(xì)胞，8220+181^0)211^;和邊緣區(qū) B 細(xì)胞，B220+IgM+CD21+CD23-。B.將來(lái)自野生型(+/+，藍(lán)色線)和Cacnalf-/-(-/-，紅色線)小鼠的經(jīng)純化脾B細(xì)胞在存在或不存在所指示濃度的重組小鼠BAFF下培養(yǎng)72小時(shí)且然后用碘化丙啶染色。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)活細(xì)胞(碘化丙啶陰性細(xì)胞)的百分?jǐn)?shù)。< 0.05和、< O-Ol0
[0229]CavL 4缺乏的小鼠在用TNP-聚蔗糖(T細(xì)胞非依賴性2型抗原)免疫之后產(chǎn)生受損的抗體應(yīng)答。
[0230] 圖31闡明CavL 4缺乏的小鼠在用TNP-聚蔗糖(T細(xì)胞非依賴性2型抗原)免疫之后產(chǎn)生受損的抗體應(yīng)答。野生型(η = 5)和Cacnalf-/-(n = 5)小鼠腹腔內(nèi)注射TNP-聚蔗糖并通過(guò)ELISA測(cè)定免疫后所引發(fā)的特異性抗體的水平。在第O天(野生型，+/+黑色線；Cacnalf-/-，-/-灰色線)和免疫后第7天(野生型，+/+藍(lán)色線；Cacnalf-/-，-/-紅色線)的TNP特異性抗IgM㈧和抗IgG3⑶抗體應(yīng)答。
[0231]參考文獻(xiàn):
[0232]阿爾貝羅拉-伊拉J.和埃爾南德斯-霍約什G.(2003).Ras/MAPK級(jí)聯(lián)和陽(yáng)性選擇的對(duì)照(The Ras/MAPK cascade and the control of positive selection).免疫學(xué)評(píng)論 191，79-96。
[0233]巴杜A.、杰哈 Μ.Κ.、瑪札 D.(Matza，D.)、邁哈勒 W.Z.(Mehal，W.Z.)、特雷瑟爾 M.(Freichel，Μ.)、法羅茲戴特 V.(Flockerzi, V.)和弗拉維爾 R.A.(Flavell，R.A.)(2006).Cav通道的β調(diào)節(jié)亞單元在T淋巴細(xì)胞功能中的關(guān)鍵作用(Critical role forthe beta regulatory subunits of Cav channels in T lymphocyte function).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA) 103，15529-15534。
[0234]鮑曼L、格斯特納 A.(Gerstner, A.)、宗格 X.(Zong，X.)、比爾 M.(Biel, Μ.)和沃爾-斯科特C.(Wahl-SchottiC.) (2004).來(lái)自小鼠視網(wǎng)膜的L型Ca2+通道Cavl.4 α I的功會(huì)泛表征(Functional characterization of the L-type Ca2+channel Cavl.4alphal frommouse retina).眼科學(xué)研究與視力學(xué)(Invest.0phthalmol.Vis.Sc1.) 45，708-713。
[0235]伯吉斯D.L、瓊斯 J.M.(Jones，J.M.)、梅斯勒 Μ.H.(Meisler, Μ.H.)和諾貝爾斯J.L.(Noebels，J.L.) (1997).Ca2+通道β亞單元基因Cchb4的突變與昏睡(Ih)小鼠的共濟(jì)失調(diào)和發(fā)作相關(guān)聯(lián)(Mutation of the Ca2+channel beta subunit gene Cchb4isassociated with ataxia and seizures in the lethargic (Ih)mouse).細(xì)胞(Cell) 88，385-392。
[0236]卡特羅爾W.A.(Catterall，W.A.) (2000).電壓門控Ca2+通道的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)(Structure and regulation of voltage-gated Ca2+channels).細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)年評(píng)(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.) 16，521-555。
[0237]戴維M.D.、科克蘭 C.L (Cochrane，C.L )、鄧肯 S.K.(Duncan，S.K.)和施拉德?tīng)朖.W.(Schrader, J.W.) (2005).純脂多糖或合成脂質(zhì)A通過(guò)依賴于Six家族激酶和PI3K的途徑誘導(dǎo)原代巨嗷細(xì)胞中p21Ras的激活(Pure lipopolysaccharide or syntheticlipid A induces activation of p21Ras in primary macrophages through a pathwaydependent on Src family kinases and PI3K).免疫學(xué)雜志(J.1mmunol.) 175，8236-8241。
[0238]范思凱S.(2007).淋巴細(xì)胞激活中的鈣信號(hào)傳導(dǎo)和疾病(Calcium signallingin lymphocyte activation and disease).自然評(píng)論:免疫學(xué)(Nat.Rev.1mmunol.) 7,690-702。
[0239]格拉夫頓G.(Grafton, G.)、斯托克斯 L.(Stokes，L.)、特勒爾 Κ.M.(Toellner,K.Μ.)和戈登J.(Goixlon，J.) (2003).具有L型特征通過(guò)B細(xì)胞受體接合激活的非電壓門控.丐通道(A non-voltage-gated calcium channel with L-type characteristicsactivated by B cell receptor ligation).生物化學(xué)藥理學(xué)(Biochem.Pharmacol.)66，2001-2009。
[0240]基沃克Y.(Gwack，Y.)、斯里坎特S.(Srikanth，S.)、歐?奧拉Μ.、霍根P.G.(Hogan,P.G.)、林巴迪 E.D.(Lamperti，E.D.)、山下 M.(Yamashita，M.)、姬蓮娜絲 C.(Gelinas，C.)、尼姆斯D.S.(Neems，D.S.)、佐佐木Y.(Sasaki，Y.)、范思凱S.等人(2008).在缺乏ORAIl的小鼠中毛發(fā)脫落和缺陷性T細(xì)胞和B細(xì)胞功能(Hair loss and defective T-and B-cellfunction in mice lacking 0RAI1).分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.) 28，5209-5222。
[0241]杰哈Μ.K.、巴杜Α.、邁斯納Μ.(Meissner，Μ.)、麥克洛瑞J.E.、特雷瑟爾Μ.、法羅茲戴特V.和弗拉維爾R.A.(2009).初始型⑶8+Τ淋巴細(xì)胞在缺少電壓門控鈣通道的β3調(diào)節(jié)亞單兀下的缺陷性存活(Defective survival of naive CD8+T lymphocytes in theabsence of the beta3regulatory subunit of voltage-gated calcium channels).自然.免疫學(xué) 10,1275-1282。
[0242]凱佩爾W.C.、特洛伊 A.(Troy，A.)、布格哈特 J.T.(Burghardt，J.T.)、拉姆西 C.(Ramsey, C.)、理 J.Y.(Lee，J.Y.)、江 H.Q.(Jiang, H.Q.)、達(dá)默 W.(Dummer，W.)、沈H.(Shen，H.)、塞夫拉J.J.(Cebra, J.J.)和蘇赫C.D.(2005).最近的免疫狀態(tài)決定驅(qū)動(dòng)內(nèi)穩(wěn)態(tài) T 細(xì)胞擴(kuò)增的抗原的來(lái)源(Recent immune status determines the source ofantigens that drive homeostatic T cell expansion).免疫學(xué)雜志 174，3158-3163。
[0243]庫(kù)特瑞M.F.和杰弗里斯W.A.(2005).在人類T淋巴細(xì)胞中表達(dá)的L型鈣通道剪接變體的分子表征(Molecular characterization of L-type calcium channel splicevariants expressed in human T lymphocytes).分子免疫學(xué) 42，1461-1474。
[0244]庫(kù)特瑞M.F.、卡羅 D.A.(Carlow, D.A.)、理 J.C.、澤爾 i覃納 H.J.(Ziltener,
H.J.)和杰弗里斯W.A.(2003).T淋巴細(xì)胞中的電壓依賴性鈣通道的鑒別和功能表征(Identificationand functional characterization of voltage-dependent calciumchannels in T lymphocytes).生物化學(xué)雜志 278，46949-46960。
[0245]庫(kù)特瑞M.F.、亨特 S.V.(Hunt，S.V.)和杰弗里斯 W.A.(2006).CRAC 和 Cav-樣通道在T細(xì)胞中的作用:不止一個(gè)看門者？(Roles of CRAC and Cav-1ike channels in Tcells:More than one gatekeeper?)藥物科學(xué)趨勢(shì) 27，360-367。
[0246]里普斯科姆D.、海爾頓 T.D.(Helton，Τ.D.)和徐 W.(Xu，W.) (2004).L 型鈣通道:其真實(shí)狀況(L-type calcium channels:The low down).神經(jīng)生理學(xué)雜志(J.Neurophysiol).92，2633-2641。
[0247]劉Κ.Q.、邦內(nèi)爾 S.C.(Bunnell，S.C.)、戛耐克 C.B.(Gurniak，C.B.)和博格LJ.(Berg, L.J.) (1998).T細(xì)胞受體引發(fā)的鈣釋放與Itk缺乏T細(xì)胞中的電容性鈣進(jìn)入無(wú)關(guān)(T cell receptor-1nitiated calcium release is uncoupled from capacitativecalcium entry in Itk-deficient T cells).實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)187，1721-1727。
[0248]曼瑟F.、奧爾頓 N.C.(Orton, N.C.)、韋塞 J.P.(Vessey, J.P.)、拉隆德M.R.(Lalonde，M.R.)、斯特拉(Stell，W.K.)、特倫布萊 F.(Tremblay, F.)、巴爾內(nèi)斯S.(Barnes, S.)、蘭考特 D.E.(Rancourt, D.E.)和本奇-漢森 N.T.(Bech-Hansen，N.T.)(2005).鈣通道基因Cacnalf的突變破壞小鼠視網(wǎng)膜中的鈣信號(hào)傳導(dǎo)、突觸傳遞和細(xì)胞組織(Mutation of the calcium channel gene Cacnalf disrupts calcium signaling，synaptic transmission and cellular organization in mouse retina).人類分子遺傳學(xué)(Hum.Mol.Genet.) 14，3035-3046。
[0249]麥克洛瑞J.E.、哈米德 J.(Hamid, J.)、多林 C.J.(Doering, C.J.)、加西亞 E.(Garcia, Ε.)、帕克 R.、海明 K.(Hamming K.)、陳 L.(Chen, L.)、希爾德布蘭德M.(Hildebrand, Μ.)、比德?tīng)?A.M.(Beedle，Α.Μ.)、費(fèi)爾德坎普 L.(Feldcamp，L.)等人(2004).CACNA1F基因編碼具有獨(dú)特的生物物理特性和組織分布的L型鈣通道(TheCACNAIF gene encodes an L-type calcium channel with unique biophysicalproperties and tissue distribution).神經(jīng)科學(xué)雜志 24，1707-1718。
[0250]摩爾根A.J.和雅各布R.(1994).離子霉素通過(guò)剌激貯存池調(diào)節(jié)的陽(yáng)離子進(jìn)入而不是通過(guò)直接作用于質(zhì)膜來(lái)增強(qiáng)Ca2+流入(1nomycin enhances Ca2+influx bystimulating store-regulated cation entry and not by a direct action at theplasma membrane)生物化學(xué)雜志(Biochem.J.) 300，665-672。
[0251]歐?奧拉M.(2009).T系細(xì)胞的發(fā)育和功能中的鈣信號(hào)傳導(dǎo)(Calcium signalingin the development and function of T-1 ineage cells).免疫學(xué)評(píng)論 231，210-224。
[0252]帕克C.Y.、謝格洛維托夫 A.(Shcheglovitov, A.)和多爾梅茨克 R.(Dolmetsch，R.)(2010).CRAC通道激活劑STMl結(jié)合并抑制L型電壓門控鈣通道(The CRAC channelactivator STIMl binds and inhibits L-type voltage-gated calcium channels).科學(xué)330,101-105。
[0253]普若艾陶J(rèn).J.、崔 D.(Chui，D.)、比羅網(wǎng) N.(Hiraoka，Ν.)、西蒙斯 C.J.(Simmons,
C.J.)、理查德森 Κ.B.(Richardson, K.B.)、裴吉 D.M.(Page，D.Μ.)、福田 Μ.(Fukuda，Μ.)、瓦基 N.M.(Varki，N.M.)和馬爾斯 J.D.(Marth，J.D.) (2000).ST3Gal_I 唾液酸轉(zhuǎn)移酶通過(guò)調(diào)控0-多糖生物合成控制CD8+T淋巴細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)(The ST3Gal-1 sialyltransferasecontrols CD8+T lymphocyte homeostasis by modulating 0-glycan biosynthesis).免疫(Immunity)12，273-283。
[0254]普若艾陶J(rèn).J.、泰赫 S.J.(Teh，S.J.)、道爾 N.A.(Dowen N.A.)、斯通 J.C.(Stone，J.C.)和泰赫H.S.(2002).RasGRPl轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于T細(xì)胞發(fā)育、內(nèi)穩(wěn)態(tài)和分化至關(guān)重要的低級(jí)別TCR信號(hào)(RasGRPl transduces low-grade TCR signals which are critical for T celldevelopment，homeostasis，and differentiation).免疫 17，617-627。
[0255]普若艾陶J(rèn).J.、陳X.、德漢吉S.(Dhanji，3.)、亞伯拉罕1 (Abraham, Ν.)和泰赫H.S.(2006).RasGRPl傳遞對(duì)CD4T細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的前分化TCR信號(hào)傳導(dǎo)(RasGRPltransmits prodifferentiation TCR signaling that is crucial for CD4 T celldevelopment).免疫學(xué)雜志 177，1470-1480。
[0256]普若艾陶J(rèn).J.、陳 X.、監(jiān)凱維奇 L.A.(Zenewicz,L.A.)、沈 H.、哈德 K.W.(Harder,1(.胃.)、霍維茨13.(Horwitz，M.S.)和泰赫H.S.(2007).缺少RasGRPl的小鼠中的慢性免疫缺乏導(dǎo)致⑶4T細(xì)胞免疫激活和耗盡(Chronic immunodeficiency in mice lackingRasGRPl results in CD4 T cell immune activation and exhaustion).免疫學(xué)雜志 179，2143-2152。
[0257]勒維P.、索斯佩德拉M.(Sospedra，Μ.)、巴伯爾B.(Barbour，B.)和特勞特曼A.(Trautmann, A.) (2001).T細(xì)胞與樹突細(xì)胞之間形成的功能抗原非依賴性突出(Functional antigen-1ndependent synapses formed between T cells and dendriticcells).自然.免疫學(xué) 2,925-931。
[0258]斯托克斯L.、戈登J.和格拉夫頓G.(2004).人類T細(xì)胞中的非電壓門控L型Ca2+通道:主要α成孔和輔助β -亞單元的藥理學(xué)和分子表征(Non-voltage-gated L-typeCa2+channels in human T cells !pharmacology and molecular characterization ofthe major alpha pore-forming and auxiliary beta-subunits).生物化學(xué)雜志 279，19566-19573。
[0259]斯特羅姆Τ.M.(Strom, Τ.Μ.)、納克圖拉G.(Nyakatura，G.)、阿普費(fèi)爾施泰特-塞拉 E.(ApfeIstedt-Sylla, E.)、海勒布蘭德 H.(Hellebrand, H.)、洛倫茲 B.(Lorenz, B.)、韋伯 B.H.(Weber, B.H.)、沃茲 K.(Wutz，K.)、吉威拉艾莫 N.(Gutwi I linger, N.)、陸澤K.(RUthehK.)、德雷舍爾B.(DrescheriB.)等人(1998).不完全性X連鎖先天性靜止性夜盲癥中的 L型鈣通道基因突變(An L-type calcium-channeI gene mutated in incompleteX-1inked congenital stationary night blindness).自然?遺傳學(xué)(Nat.Genet.) 19，260-263。
[0260]蘇赫C.D.和斯普林特J.(2005).成熟T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)(Regulation ofmature T cell homeostasis).免疫學(xué)研討文輯(Semin.1mmunol).17，183-191。
[0261]蘇赫C.D.和斯普林特J.(2008).初始型和記憶型T細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Homeostasisof naive and memory T c ells).免疫 29，848-862。
[0262]鈴木y.、吉丸 Τ.(Yoshimaru, Τ.)、井上 Τ.(Inoue，Τ.)、布村 S.(Nunomura, S.)和拉斯C.(Ra，C.) (2008).高親和性免疫球蛋白E受體(Fe印silonRI)調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞中的線粒體鈣攝入和二氫吡啶受體介導(dǎo)的鈣流入:Fc^psilonR10鏈基于免疫受體酪氨酸的激活基序的作用(The high-affinity immunoglobulin E receptor(FcepsilonRI)regulates mitochondrial calcium uptake and a dihydropyridine receptor-mediatedcalcium influx in mast cells:Role of the FcepsilonRIbeta chain immunoreceptortyrosine-based activation motif).生物化學(xué)藥理學(xué) 75，1492-1503。
[0263]特謝羅E.和丹尼爾斯Μ.A.(2010).ERK和細(xì)胞死亡:ERK定位和T細(xì)胞選擇(ERK and cell death:ERK location and T cell selection).歐洲生物化學(xué)雜志(FEBSJ.) 277，30-38。
[0264]瑟斯托普0.、卡倫 P.J.(Cullen，P.J.)、德洛巴克 Β.K.( Dr0bak.Β.Κ.)、漢萊M.R.(Hanley，M.R.)和道森A.P.(Dawson，A.P.) (1990).毒胡蘿卜內(nèi)酯(腫瘤促進(jìn)劑)通過(guò)特異性抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2(+)-ATPase排放細(xì)胞內(nèi)Ca2+C:存池(Thapsigargin，a tumorpromoter， discharges intracellular Ca2+stores by specific inhibition of theendoplasmic reticulum Ca2 (+)-ATPase).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊 87，2466-2470。
[0265]維格Μ.(Vig，Μ.)和基內(nèi)特J.P.(Kinet，J.P.) (2009).免疫細(xì)胞中的鈣信號(hào)傳導(dǎo)(Calcium signaling in immune cells).自然.免疫學(xué) 10，21-27。
[0266]維格Μ.、迪哈文 W.1.(DeHaven, W.1.)、伯德 G.S.(Bird, G.S.)、比林斯利J.M.(Billingsley，J.M.)、王 H.、拉奧 P.E.(Rao，P.E.)、哈欽斯 A.B.(Hutchings，A.B.)、苑萬(wàn)M.H.(Jouvin，M.H.)、帕特尼 J.W.(Putney，J.W.)和基內(nèi)特 J.P.(Kinet，J.P.) (2008).缺少貯存池操作的鈣釋放激活的鈣通道的CRACMl孔亞單元的小鼠中的缺陷性肥大細(xì)胞效應(yīng)子功倉(cāng)泛(Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACMl poresubunit of store-operated calcium release-activated calcium channels).自然.免疫學(xué) 9，89-96。
[0267]王Y.、登格 X.(Deng，X.)、曼卡雷拉 S.(Mancarella, S.)、韓德隆 E.(Hendron, Ε.)、江口 S.伍811吐^.)、索博洛芙丄(Soboloff，J.)、iX.D.(Tang’X.D.)和希爾 D.L.(Gill,
D.L.) (2010).鈣忙存池傳感器STIMl相互地控制Orai和CaVl.2通道(The calcium storesensor, STIM1, reciprocally controls Orai and CaVl.2channels).科學(xué) 330,105-109。
[0268]伍達(dá)德G.E.、薩雷多 G.M.(Salido, G.Μ.)和羅薩多 J.A.(Rosado, J.A.)(2008).當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+貯存池耗盡時(shí)增強(qiáng)的Orail到質(zhì)膜中的類似胞吐插入(Enhanced exocytotic-like insertion of Orail into the plasma membrane uponintracellular Ca2+store depletion).美國(guó)生理學(xué)雜志:細(xì)胞生理學(xué)(Am.J.Physiol.Cell Physiol.).294，C1323-C1331。
[0269]說(shuō)明書中所引用的所有專利、公開(kāi)案(包括公開(kāi)的專利申請(qǐng)案)的揭示內(nèi)容和數(shù)據(jù)庫(kù)條目明確地以其整體引用的方式并入本文中，并入的程度好像每一所述個(gè)別專利、公開(kāi)案和數(shù)據(jù)庫(kù)條目均明確并個(gè)別地指示以引用的方式并入一般。
[0270] 盡管已參照某些特定實(shí)施例描述本發(fā)明，但本發(fā)明的各種修改對(duì)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。對(duì)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的所有這些修改均打算包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于調(diào)控表達(dá)CavI剪接變體的細(xì)胞的功能的方法，其包含使所述細(xì)胞與特異性結(jié)合到所述CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑接觸，其中所述藥劑到所述CavI剪接變體的結(jié)合調(diào)控所述CavI剪接變體的活性且其中所述細(xì)胞是造血細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥劑到所述CavI剪接變體的所述結(jié)合抑制所述CavI剪接變體的所述活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥劑到所述CavI剪接變體的所述結(jié)合激活所述CavI剪接變體的所述活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述CavI剪接變體是CavL 4剪接變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3和4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述細(xì)胞是淋巴系的造血細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3和4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述細(xì)胞是T細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞的所述功能包含T細(xì)胞成熟。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞的所述功能包含抗原結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3和4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述細(xì)胞是B細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細(xì)胞的所述功能包含B細(xì)胞成熟。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細(xì)胞的所述功能包含BCR誘導(dǎo)的激活。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述藥劑是抗體或適體。
13.—種調(diào)控個(gè)體的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的CavI調(diào)控劑，其中所述CavI調(diào)控劑結(jié)合到在造血細(xì)胞中表達(dá)的CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述造血細(xì)胞屬于淋巴系。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法,其中所述造血細(xì)胞是T細(xì)胞或B細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求13到15中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述藥劑是抗體或適體。
17.—種篩選治療劑的方法，其包含以下步驟: 使表達(dá)CavI剪接變體的造血細(xì)胞與測(cè)試藥劑接觸，以及 測(cè)定所述測(cè)試藥劑是否調(diào)控所述CavI剪接變體的活性， 其中將調(diào)控所述CavI剪接變體的活性的測(cè)試藥劑鑒別為治療劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述CavI剪接變體是CavL4剪接變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述造血細(xì)胞屬于淋巴系。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述測(cè)試藥劑是能夠結(jié)合到所述CavI剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求17到20中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述藥劑是抗體或適體。
22.—種特異性結(jié)合到在T細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域以調(diào)控T細(xì)胞功能的藥劑的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中所述T細(xì)胞功能包含T細(xì)胞成熟。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中所述T細(xì)胞功能包含抗原結(jié)合。
25.一種特異性結(jié)合到在B細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域以調(diào)控B細(xì)胞功能的藥劑的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其中所述B細(xì)胞功能包含B細(xì)胞成熟。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其中所述B細(xì)胞功能包含BCR誘導(dǎo)的激活。
28.根據(jù)權(quán)利要求22到27中任一權(quán)利要求所述的用途，其中所述藥劑是抗體或適體。
29.—種抑制個(gè)體的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的CavL 4抑制劑，其中所述CavL 4抑制劑結(jié)合到在T細(xì)胞和/或B細(xì)胞中表達(dá)的CavL 4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述藥劑是抗體或適體。
31.一種篩選免疫阻抑劑的方法，其包含以下步驟: 使表達(dá)CavL 4剪接變體的T細(xì)胞和/或B細(xì)胞與測(cè)試藥劑接觸，以及 測(cè)定所述測(cè)試藥劑是否調(diào)控所述CavL 4剪接變體的活性， 其中將抑制所述CavL 4剪接變體的活性的測(cè)試藥劑鑒別為免疫阻抑劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述測(cè)試藥劑是能夠結(jié)合到所述CavL4剪接變體的胞外結(jié)構(gòu)域的藥劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述藥劑是抗體或適體。
34.一種用于調(diào)控表達(dá)電壓門控鈣通道的細(xì)胞的功能的方法，其包含使所述細(xì)胞與特異性結(jié)合到所述電壓門 控鈣通道的藥劑接觸，其中所述藥劑到所述電壓門控鈣通道的結(jié)合調(diào)控所述通道的活性且其中所述細(xì)胞是造血細(xì)胞。
35.一種調(diào)控個(gè)體的免疫應(yīng)答的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的電壓門控鈣通道調(diào)控劑，其中所述調(diào)控劑結(jié)合到在造血細(xì)胞中表達(dá)的電壓門控鈣通道。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103957936SQ201280039007
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月10日
【發(fā)明者】威爾弗雷德·A·杰弗里斯, 凱拉·奧米盧西克, 莉蓮·諾哈拉, 耿·博克·崔 申請(qǐng)人:威爾弗雷德·A·杰弗里斯, 凱拉·奧米盧西克, 莉蓮·諾哈拉, 耿·博克·崔