專利名稱：一種美洲大蠊提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及一種美洲大蠊提取物的制備方法。
背景技術：
美洲大蠊(Periplaneta americana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，其入藥始載于《神農本草經》，其中把它列為中品，謂“味:咸、寒；治:血瘀證堅寒熱、破積聚、喉咽閉、內寒無子”。“蟑螂”為其俗名首見于《本草綱目拾遺》，也稱其為石姜、滑蟲；各地方有其不同的稱法，如:偷油婆、茶婆子、灶螞子等。蜚蠊科(Blattidae)是一個龐大的昆蟲家族，在地球上已生存了 3.2億年，與恐龍屬同一時代出現的生物。無疑它是世界上生命力最強、最古老、至今繁衍最成功的昆蟲類群之一。近幾年來隨著我國對傳統中醫藥資源研究開發的重視，有些學者對這一幾千年來無法根絕的害蟲進行了應用方面的研究，并取得了可喜的成就，發掘出了這一傳統意義上的害蟲的正面價值。以美洲大蠊醇提物純化制成的產品“康復新液”，在燒傷、燙傷等外傷創面的良好療效。發明專利(專利號03117804.9) “美洲大蠊藥用浸膏提取工藝”中用熱水將美洲大蠊滅活后，采用80%乙醇回流提取、回收乙醇并進行油水分離，醇提后藥渣加入適量水65 75°C溫浸提取，藥液濃縮后進行油水分離，合并醇提藥液低于75°C真空濃縮成浸膏；發明專利(申請號200610021993.6) “美洲大蠊提取物、含該提取物的藥物組合物及其制備方法”中美洲大蠊原料經石油醚脫脂后，采用水提醇沉法或醇提水沉法制備浸膏等。相關文獻報道及相關發明專利中美洲大蠊提取物或成品色澤較深、腥臭味較重。某些患者使用過程中有抵觸情緒，甚至出現惡心、嘔吐等胃腸道不適的情況，導致不能繼續治療，延誤病情。

發明內容
本發明所要解決的問題是:如何提供一種美洲大蠊提取物的制備方法，該制備方法能克服現有技術中所存在的缺陷，能顯著改善美洲大蠊提取物性狀，特別是解決了成品色澤深、腥臭味重的弊端，增強患者治療過程中的依從性。并且本發明的美洲大蠊提取物在制備治療創面修復的藥物中有很好的療效。一種美洲大蠊提取物，其特征在于該提取物的制備過程包括如下方法:
①.取美洲大蠊鮮蟲、干蟲或經脫脂后的干蟲，稱取適量，加丙酮進行回流，得到脫脂原
料；
②.加水煎煮提取2 4次；
③.將步驟②所得的濾液濃縮至相對密度1.02 1.25 (60°C測)，加入乙醇，靜置，濾
過；
④.將步驟③所得的濾液回收乙醇至無醇味，加水，濾過或離心；
⑤.將步驟④所得的上清液通過大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；⑥.將步驟⑤所得的流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；
⑦.將步驟⑥所得的流出液減壓濃縮、干燥，粉碎。進一步，美洲大蠊提取物的制備方法具體包括如下步驟:
①.取美洲大蠊鮮蟲、干蟲或經脫脂后的干蟲，挑去雜質及非藥用部位，稱取精選的原料適量，加丙酮回流2-4次，每次加入2-5倍量，每次回流0.5-1.5小時得到脫脂原料，揮去丙酮；
②.加水煎煮提取2 4次，每次加入藥材重量5 20倍體積的水，每次煎煮提取
0.5 2小時，濾過；
③.將步驟②所得的濾液濃縮至相對密度1.02 1.25 (60°C測)，加入乙醇至含醇量達55% 90%，在-5°C 25°C靜置6 24小時，濾過；
④.將步驟③所得的濾液回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于0.1 2克原生藥，濾過或離心；
⑤.將步驟④所得的上清液通過大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；
⑥.將步驟⑤所得的流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；
⑦.將步驟⑥所得的流出液70°C以下減壓濃縮、干燥，粉碎。再進一步， 一種美洲大蠊提取物的制備方法，其特征在于其制備方法包括如下步驟:
①.取美洲大蠊鮮蟲、干蟲或經脫脂后的干蟲，挑去雜質及非藥用部位；稱取步驟①精選的原料適量，加丙酮回流3次，每次加入8-12倍量，每次回流I小時得到脫脂原料，揮去丙酮；
②.加水煎煮提取2-4次，每次加入藥材重量8-15倍體積的水，每次煎煮提取0.5 2小時，濾過；
③.將步驟②所得的濾液濃縮至相對密度1.02 1.15 (60°C測)，加入乙醇至含醇量達75% 85%，在(TC 15°C靜置8 18小時，濾過；
④.將步驟③所得的濾液回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于0.5 2克原生藥，濾過或離心；
⑤.將步驟④所得的上清液通過大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；
⑥.將步驟⑤所得的流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；
⑦.將步驟⑥所得的流出液70°C以下進行減壓濃縮、干燥，粉碎。經過發明人研究，優選的制備方法為步驟③所述濾液濃縮至相對密度1.05 (60°C測)。優選的步驟⑤所述吸附樹脂柱為極性、弱極性和非極性大孔樹脂。優選的步驟⑥所述聚酰胺柱中聚酰胺的粒度為100 200目。本發明還提供了上述方法制備的美洲大蠊提取物。
本發明還提供一種美洲大蠊提取物在制備定向誘導間充質干細胞分化為表皮細胞的誘導液中的應用。上述美洲大蠊提取物可加入藥學上可接受的輔料制成凝膠劑、涂膜劑、貼劑、片齊U、膠囊、軟膠囊、口服液、滴丸、噴霧劑、顆粒劑或注射液等多種內服外用制劑。本發明的有益效果:采用本發明所得的美洲大蠊提取物水溶性良好、色澤淺、幾乎無腥臭味，質量穩定可靠，患者依從性高，在治療各種創面等方面具有很好的臨床推廣運用價值。


圖1左上:CD29陽性表達率98.6±1.8% ;右上:CD34陽性表達率0.6±0.2% ;左下:CD44陽性表達率93.3±2.1% ;右下:CD90陽性表達率89.2±4.5%。
具體實施例方式下面結合實施例以及實驗室數據對本發明作進一步描述: 實施例1
稱取美洲大蠊鮮蟲40kg，加丙酮加熱回流4次，每次加入3倍量，每次回流I小時，揮去丙酮，加水煎煮提取3次，每次加入藥材重量5倍體積的水，每次煎煮提取I小時，濾過；濾液70°C減壓濃縮至相對密度1.08(60°C測)，加入乙醇至含醇量達75%，在0°C靜置12小時，濾過；濾液常壓回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于I克原生藥，濾過；濾液通過DlOl型大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；所得的流出液70°C減壓濃縮、干燥，粉碎，得淺黃色美洲大蠊提取物2.3公斤，無腥臭味。實施例2
稱取美洲大蠊干蟲30kg，加丙酮加熱回流3次，每次加入4倍量，每次回流60分鐘，揮去丙酮，加水煎煮提取3次，每次加入藥材重量10倍體積的水，每次煎煮提取I小時，濾過；濾液75°C減壓濃縮至相對密度1.05 (60°C測)，加入乙醇至含醇量達80%，在4°C靜置12小時，濾過；濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于I克原生藥，濾過；濾液通過HPD100型大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；所得的流出液75°C減壓濃縮、干燥，粉碎，得淺黃色美洲大蠊提取物3.2公斤，無腥臭味。實施例3
稱取用美洲大蠊干蟲25kg加丙酮加熱回流3次，每次加入3倍量，每次回流30分鐘，揮去丙酮，加水煎煮提取2次，每次加入藥材重量20倍體積的水，每次煎煮提取2小時，濾過；濾液68°C減壓濃縮至相對密度1.25 (60°C測)，加入乙醇至含醇量達55%，在25°C靜置24小時，濾過；濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于2克原生藥，離心；上清液通過AB-8型大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；所得的流出液79°C減壓濃縮、干燥，粉碎，得淺黃色美洲大蠊提取物2.8公斤，無腥臭味。實施例4稱取用美洲大蠊干蟲40kg，加丙酮加熱回流3次，每次加入2倍量，每次回流40分鐘，揮去丙酮，加水煎煮提取3次，每次加入藥材重量12倍體積的水，每次煎煮提取0.5小時，濾過；濾液80°C減壓濃縮至相對密度1.15 (60°C測)，加入乙醇至含醇量達90%，在-5°C靜置6小時，濾過；濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于1.5克原生藥，濾過；濾液通過HPD400型大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；所得的流出液65°C減壓濃縮、干燥，粉碎，得淺黃色美洲大蠊提取物3.8公斤，無腥臭味。參比實施例1
將干燥的美洲大蠊粗碎，每IOOKg粗粉加300Kg水，浸泡0.5小時后，溫度約在70°C，提取三次，第一次7小時；第二次加水200Kg，提取5小時；第三次加水200Kg，提取3小時；合并三次提取液，過濾，濾液濃縮至相對密度為1.05^1.08 (70°C)時，加入濃度為93% w/w的乙醇，使成含醇量為40%，70°C保溫攪拌20分鐘，靜置10小時，棄去上層油脂，下層藥液過濾，濾液回收乙醇，減壓濃縮至相對密度為1.15^1.18 (70°C)，常壓濃縮至水分< 25%的膏，即得含美洲大蠊提取物，備用。以下通過具體藥效學實驗證明本發明的有益效果:
試驗例I 本發明藥物組合物誘導間充質干細胞定向分化為表皮細胞
1、材料和儀器
材料:骨髓來源于臨床骨髓穿刺檢查正常患者，無血液系統疾病和家族遺傳病史，患者知情同意
藥物、試劑及儀器:
美洲大蠊提取物(以下簡稱ML提取物)是由實施例2方法制備的D u Ib e c c ο最低必需培養基(D M E M )、D is P a s e I 1、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(E D T A )、淋巴細胞分離液、相關抗體等無菌超凈工作臺CO2恒溫培養箱
C X 4 O普通光學顯微鏡和C K 4 O倒置相差顯微鏡 Beckman21R低溫高速離心機 MD100 - 2電子天平 培養瓶、培養皿、培養板等
2、分組 共四組:
空白組:采用含10% FBS的L 一 DMEM培養基培養；
陽性組:在空白組基礎上加入誘導劑(成分為10-7mol/L地塞米松+20 ng/mL EGF, +15ng/mL bFGF+ 1%ITS(胰島素轉鐵蛋白))；
藥物組:采用含0.01g/ml ML提取物的L 一 DMEM培養基培養；
藥物+陽性組:在空白組基礎上加入誘導劑及0.01g/ml美洲大蠊提取物。3、實驗方法
(一)骨髓間充質干細胞的分離培養(I)分離培養
無菌條件下取臨床骨髓穿刺檢查正常患者2mL健康骨髓，用DMEM培養液等倍稀釋混勻后，加入到含Ficoll淋巴細胞分離液的試管中，400g離心30min，收集界面層的單個核細胞，D-Hank’s液洗滌細胞2次，重懸細胞于含體積分數為10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中，置37°C、含體積分數為5% CO2、飽和濕度恒溫培養箱培養。3d后首次換液，棄去未貼壁細胞，保留貼壁細胞繼續培養。待細胞基本長滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化傳代。(2)傳代2次后對細胞進行鑒定:形態觀察及免疫熒光檢測
收集細胞，調整細胞懸液濃度，每張爬片上接種10000個細胞。第二天，取出玻璃爬片，PBS清洗3次。固定液固定15分鐘。封閉液封閉I小時。一抗孵育2h-12h。PBS清洗3次，二抗孵育lh_2h。DAPI孵育5分鐘。PBS清洗封片。檢測的間充質干細胞細胞表面標志物為:大鼠抗人的抗體⑶29，⑶34，⑶44，⑶90的表達情況，以鑒定該培養細胞是否為骨髓間充質干細胞。免疫熒光。檢測結果見圖1，左上:⑶29陽性表達率98.6± 1.8%;右上:⑶34陽性表達率0.6±0.2% ;左下:CD44陽性表達率93.3 ±2.1% ;右下:CD90陽性表達率89.2 ±4.5%，說明成功得到了間充質干細胞。(二)定向誘導骨髓間充質干細胞分化為表皮細胞
(I)培養
取第3代間充質干細胞，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化成細胞懸液，隨機分為四組:空白組(采用含10% FBS的L 一 DMEM培養基培養)、陽性組(在空白組基礎上加入誘導劑)、藥物組(采用含0.01g/ml ML提取物的L 一 DMEM培養基培養)、藥物+陽性組(在空白組基礎上加入誘導劑及0.01 g/ml ML提取物)，將第3代細胞接種在PLL處理過的玻璃爬片上，分別加入上述培養基，每組各設3個平行組，按照常規細胞培養。(2)檢測
按照常規細胞培養要求繼續培養7天后，收集細胞，按照免疫熒光檢測的方法進行培養細胞爬片制作，進行細胞角蛋白CK19(該指標為表皮細胞特征性標志物)表達的檢測。通過CK19表達情況鑒定表皮干細胞是否形成。熒光染色結果顯示:空白組無CK19表達為陰性，陽性組、藥物組及藥物+陽性組均有CK19的表達，其中藥物組(ML提取物)CK19表達顯著，說明ML提取物具有誘導人間充質干細胞hMSCs分化為表皮干細胞的作用。試驗例2提取物對小鼠的急性毒性及半數致死劑量
1、實驗材料
1.1.實驗藥物:
實施例2提取物干粉，黃棕色粉末，味腥，易吸潮，易溶于水。提取物溶液濃度分別為0.lg/ml，0.2g/ml，0.4g/ml紅棕色澄清液體，以上樣品均由四川好醫生攀西藥業有限責任公司提供。1.2.實驗動物及環境條件:
昆明種小鼠，SPF級(三級)合格動物。試驗環境條件:本試驗應用設施符合SPF (三)級標準的動物實驗室內進行。室內通過自動空調控制室溫在19 21°C，相對濕度控制在50 65%。通過自動換氣裝置調節室內空氣。人工控制熒光照明，每天8 20時明，2(Γ8時暗。實驗動物分籠飼養，動物每籠不超過5只，自由飲水，常規全價飼料，定時定量喂養，每天下午4時左右，小鼠喂食8g/20g b.w.。1.3.實驗試劑
氯化鈉注射液(0.9%)，規格:500ml:4.5g，其它試劑均為市售，分析純。1.4.試驗儀器
JA1003電子天平，上海精科天平，d=lmg ；
EB-3200D電子天平，由日本島津生產，d=0.0lg ；
YB電子天平，上海海康電子儀器廠生產，d=0.1g ；
手術器械、秒表、直尺、灌胃針等。、實驗方法與結果
2.1、提取物對小鼠的急性毒性試驗藥物配制:采用四川好醫生攀西藥業有限責任公司按照實施例2方法制備的提取物，制成濃度分別為0.lg/ml,0.2g/ml，0.4g/ml紅棕色澄清液體，用量筒計量最后所得藥液體積，供實驗用。預試驗:取體重18 22g小鼠40只，雌雄各半，按體重隨機分成10組，每組4只，自由飲水，禁食6小時后，各組按0.4ml/10g體重分別灌胃70%、56%、45%提取物液體，對照組灌胃等體積生理鹽水，觀察小鼠給藥后毒性反應及死亡情況，觀察7天，每天一次，各組動物死亡情況如表1: 表I本發明美洲大蠊提取物的毒性結果
權利要求
1.一種美洲大蠊提取物的制備方法包括如下的步驟: ①.取美洲大蠊鮮蟲、干蟲或經脫脂后的干蟲，稱取適量，加丙酮進行回流，得到脫脂原料； ②.加水煎煮提取2 4次； ③.將步驟②所得的濾液濃縮至相對密度1.02 1.25 (60°C測)，加入乙醇，靜置，濾過； ④.將步驟③所得的濾液回收乙醇至無醇味，加水，濾過或離心； ⑤.將步驟④所得的上清液通過大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性； ⑥.將步驟⑤所得的流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性； ⑦.將步驟⑥所得的流出液減壓濃縮、干燥，粉碎。
2.一種美洲大蠊提取物的制備方法包括如下步驟: ①.取美洲大蠊鮮蟲、干蟲或經脫脂后的干蟲，挑去雜質及非藥用部位，稱取精選的原料適量，加丙酮回流2-4次，每次加入2-5倍量，每次回流0.5-1.5小時得到脫脂原料，揮去丙酮； ②.加水煎煮提取2 4次，每次加入藥材重量5 20倍體積的水，每次煎煮提取0.5 2小時，濾過； ③.將步驟②所得的濾液濃縮至相對密度1.02 1.25 (60°C測)，加入乙醇至含醇量達55% 90%，在-5°C 25°C靜置6 24小時，濾過； ④.將步驟③所得的濾液回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于0.1 2克原生藥，濾過或離心； ⑤.將步驟④所得的上清液通過大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性； ⑥.將步驟⑤所得的流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性； ⑦.將步驟⑥所得的流出液70°C以下減壓濃縮、干燥，粉碎。
3.一種美洲大蠊提取物的制備方法，其特征在于其制備方法包括如下步驟: ①.取美洲大蠊鮮蟲、干蟲或經脫脂后的干蟲，挑去雜質及非藥用部位；稱取步驟①精選的原料適量，加丙酮回流3次，每次加入8-12倍量，每次回流I小時得到脫脂原料，揮去丙酮； ②.加水煎煮提取2-4次，每次加入藥材重量8-15倍體積的水，每次煎煮提取0.5 2小時，濾過； ③.將步驟②所得的濾液濃縮至相對密度1.02 1.15 (60°C測)，加入乙醇至含醇量達75% 85%，在(TC 15°C靜置8 18小時，濾過； ④.將步驟③所得的濾液回收乙醇至無醇味，加水至每毫升相當于0.5 2克原生藥，濾過或離心； ⑤.將步驟④所得的上清液通過大孔吸附樹脂柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性；⑥.將步驟⑤所得的流出液通過聚酰胺柱，用純水沖洗樹脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反應呈陰性； ⑦.將步驟⑥所得的流出液70°C以下進行減壓濃縮、干燥，粉碎。
4.根據權利要求1所述的的制備方法，其特征在于:步驟③所述濾液濃縮至相對密度1.05 (60°C測)。
5.根據權利要求1所述的的制備方法，其特征在于:步驟⑤所述吸附樹脂柱為極性、弱極性和非極性大孔樹脂。
6.根據權利要求1所述的的制備方法，其特征在于:步驟⑥所述聚酰胺柱中聚酰胺的粒度為100 200目。
7.如權利要求1-6任意一項所述方法制備的美洲大蠊提取物。
8.美洲大蠊提取物在制備定向誘導間充質干細胞分化為表皮細胞的誘導液中的應用。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于:所述的美洲大蠊提取物為權利要求1-6任意一項所述方法制備的美洲大蠊提取物 。
全文摘要
本發明公開了一種美洲大蠊提取物及其制備方法和用途，采用丙酮回流，水提，濃縮，向濃縮液中加入乙醇；回收乙醇，得回收乙醇后的濾液；取回收乙醇后的濾液通過吸附樹脂柱，收集流出液至流出液茚三酮反應呈陰性；通過聚酰胺柱，收集流出液至流出液茚三酮反應呈陰性；濃縮、干燥。本發明還公開了美洲大蠊提取物的新用途。本發明美洲大蠊提取物的制備方法克服傳統制備方法的缺陷，具有較強的應用價值。
文檔編號A61P17/02GK103222988SQ20131001412
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者耿福能, 馬秀英, 吳桃清 申請人:四川好醫生攀西藥業有限責任公司