專利名稱：介導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞毒性的嵌合和人源化抗cd44抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷和治療癌性疾病,具體地,涉及介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性；和更具體地，涉及減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)，任選與一種或多種CDMAB/化療劑組合作為用于起始細(xì)胞毒性響應(yīng)的工具的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合測(cè)定。
背景技術(shù)：
癌癥中的CD44:針對(duì)人白細(xì)胞生成單克隆抗體導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)CD44抗原；一種在廣泛多樣的正常組織上和全部類型的造血細(xì)胞上表達(dá)的單鏈透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合糖蛋白。其最初與淋巴細(xì)胞活化和歸巢有關(guān)。當(dāng)前，其推定的生理學(xué)作用還包括活化炎性基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和發(fā)育、誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞遷移和細(xì)胞針對(duì)凋亡的存活/抗性。在人類中，⑶44的單基因拷貝位于染色體11的短臂，11ρ13上。該基因含有19個(gè)外顯子；最開始的5個(gè)是恒定的，之后的9個(gè)是變化的，再之后的3個(gè)是恒定的且最后2個(gè)是變化的。分化剪接可以導(dǎo)致超過(guò)1000種不同的同種型。然而，目前僅確定了數(shù)打天然存在的變體。⑶44標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白由N-末端胞外(包括20個(gè)a.a.引導(dǎo)序列，和膜近側(cè)區(qū)(85a.a.))結(jié)構(gòu)域(270a.a.)，跨膜區(qū)(21a.a.)和細(xì)胞質(zhì)尾部(72a.a.)組成。胞外區(qū)還包含位于N-末端的連接構(gòu)件。該區(qū)長(zhǎng)度為92a.a.，并顯示出與其他HA結(jié)合連接蛋白的同源性。在CD44的小鼠和人形式之間存在高度的同源性。該蛋白的變體形式插入到外顯子5的羧基末端并在表達(dá)時(shí)位于細(xì)胞外。⑶44的血清可溶性形式也天然存在并可以由終止密碼子(可變區(qū)內(nèi))或由蛋白水解活性產(chǎn)生。來(lái)自多種刺激包括TNF-α的細(xì)胞活化導(dǎo)致CD44受體的釋放。對(duì)于腫瘤細(xì)胞也觀察到該受體的釋放，并且其可以導(dǎo)致人血請(qǐng)⑶44濃度增高高達(dá)10倍。高⑶44血清濃度提示惡性腫瘤(卵巢癌是例外)。⑶44的標(biāo)準(zhǔn)形式以約37kD的分子量存在。翻譯后修飾使分子量增加到80_90kD。這些修飾包括位于天冬酰胺殘基處的氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域N-連接的糖基化，位于胞外結(jié)構(gòu)域的羧基末端的絲氨酸/蘇氨酸處的O-連接的糖基化和粘多糖添加。剪接變體可以在80-250kD的尺寸范圍內(nèi)變化。HA，位于哺乳動(dòng)物中的胞外基質(zhì)(ECM)上的多糖，被認(rèn)為是主要的⑶44配體。然而，還發(fā)現(xiàn)CD44結(jié)合這樣的蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等。HA結(jié)合和糖基化之間似乎存在相關(guān)性。失活的CD44 (不結(jié)合HA)具有最高水平的糖基化，活性CD44 (結(jié)合HA)具有最低的，而可誘導(dǎo)的CD44(不或 很弱地結(jié)合HA，除非受到細(xì)胞因子、單克隆抗體、生長(zhǎng)因子等的活化)具有活性和失活形式之間某處的糖基化水平。
⑶44可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)它的一些功能，這取決于細(xì)胞、刺激和環(huán)境的相互作用。這些途徑中的一些包括NF K B信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)(參與炎性反應(yīng))、Ras-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(涉及活性細(xì)胞周期和增殖)、蛋白質(zhì)Rho家族(涉及細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞遷移)和PI3-K-相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑(涉及細(xì)胞存活)。全部上述功能與腫瘤疾病的開始和進(jìn)展密切相關(guān)。⑶44還涉及在癌癥中通過(guò)多種另外的機(jī)制起作用。這些包括通過(guò)⑶44細(xì)胞表面上存在的細(xì)胞表面蛋白聚糖對(duì)參與惡性腫瘤的受體呈遞生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子。而且，在⑶44-HA復(fù)合物內(nèi)在化后由溶酶體透明質(zhì)酸酶引起的HA胞內(nèi)降解可以通過(guò)ECM潛在地增加腫瘤侵入和誘導(dǎo)血管發(fā)生的可能性。另外，顯示出存活或凋亡信號(hào)的傳輸通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)或可變⑶44受體發(fā)生。還提示⑶44參與細(xì)胞分化和遷移。這些機(jī)制中的許多，如果不是全部，是環(huán)境和細(xì)胞依賴性的，且若干引起可變的結(jié)果。因此，在可以得出任何結(jié)論之前需要更多的研究。為了驗(yàn)證⑶44在癌癥中的潛在功能作用，采取⑶44的表達(dá)研究以確定該受體的分化表達(dá)是否與疾病進(jìn)展相關(guān)。然而，在大部分腫瘤類型中觀察到不一致的結(jié)果，且這可能歸因于研究者之間的試劑、技術(shù)、病理學(xué)評(píng)分和細(xì)胞類型差異的組合。腎細(xì)胞癌和非霍奇金淋巴瘤似乎是另外，其中具有高CD44表達(dá)腫瘤的患者一致地具有比他們的低或非CD44表達(dá)的負(fù)體更短的存活時(shí)間。由于其與癌癥的聯(lián)系，⑶44已經(jīng)是抗癌治療發(fā) 展的靶標(biāo)。仍然存在一些爭(zhēng)論，如關(guān)于腫瘤進(jìn)展需要CD44的標(biāo)準(zhǔn)形式還是變體形式。存在支持這兩種觀點(diǎn)的體內(nèi)動(dòng)物數(shù)據(jù)，并且同樣地其可以是腫瘤類型和甚至細(xì)胞類型依賴性的。不同的治療方法已經(jīng)包括注射可溶性⑶44蛋白，乙酰透明質(zhì)酸合成酶cDNA，透明質(zhì)酸酶，使用⑶44反義和⑶44特異性抗體。每種方法引起了一定程度的成功，從而為抗CD44癌癥治療提供支持。已經(jīng)實(shí)驗(yàn)室生成了變體和標(biāo)準(zhǔn)⑶44特異性單克隆抗體，但是在很大程度上，這些抗體不具有固有的生物活性，相反地，它們特異性結(jié)合它們識(shí)別的CD44類型。然而，這些是在體外或體內(nèi)但通常不在兩處具有活性的一些。若干抗CD44抗體顯示出介導(dǎo)細(xì)胞事件。例如，鼠抗體A3D8，針對(duì)人紅細(xì)胞盧氏抗原⑶44標(biāo)準(zhǔn)形式，顯示出增強(qiáng)⑶2 (9-1)抗體和⑶3 (0KT3抗體)介導(dǎo)的T細(xì)胞活化；另一種抗⑶44抗體具有類似的作用。A3D8還誘導(dǎo)IL-1從單核細(xì)胞中釋放和IL-2由T淋巴細(xì)胞中釋放。有趣地，與藥物諸如柔紅霉素，米托蒽醌和依托泊苷聯(lián)合使用A3D8通過(guò)消除第二信使神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生抑制HL60和NB4AML細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)。J173抗體，其不具有固有活性且針對(duì)CD44的類似表位，不抑制藥物誘導(dǎo)的凋亡。而且，A3D8和另一種抗⑶44單克隆抗體H90，以及乙酰透明質(zhì)酸，誘導(dǎo)來(lái)自急性骨髓型白血病(AML)患者的白血病胚細(xì)胞的分化。然而，在相同的研究中，也結(jié)合CD44標(biāo)準(zhǔn)形式的J173抗體不誘導(dǎo)相同細(xì)胞的分化。有趣地，H90不結(jié)合來(lái)自其AML細(xì)胞與J173結(jié)合的患者子集的AML細(xì)胞，這說(shuō)明這些抗體識(shí)別不同的表位。在一項(xiàng)獨(dú)立的研究中，A3D8和H90均誘導(dǎo)若干AML-來(lái)源的細(xì)胞系的末期分化。NH44-1抗體，其針對(duì)⑶44的85_110kD和200kD形式，通過(guò)作者推測(cè)為交聯(lián)或聚集CD44的途徑，增加T細(xì)胞增殖。總之，不存在這樣的證據(jù)，即抗體諸如這些適合于用作癌癥治療法，因?yàn)樗鼈儾会槍?duì)癌癥(例如，活性淋巴細(xì)胞)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，或當(dāng)與細(xì)胞毒性試劑一起使用時(shí)抑制藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡。已經(jīng)描述了若干抗⑶44抗體，這證明了體內(nèi)抗腫瘤作用。抗體H90是通過(guò)用人紅細(xì)胞(RBCs)免疫小鼠產(chǎn)生的鼠單克隆抗體，且其據(jù)報(bào)告結(jié)合CD44的所有同種型。對(duì)用輻射處理的已接種人AML細(xì)胞的NOD-SCID小鼠施用該抗體，三次/周，4周，通過(guò)這些細(xì)胞阻斷種群恢復(fù)。另外，在由經(jīng)歷了使用H90抗體處理的動(dòng)物中獲得細(xì)胞時(shí)，來(lái)自這些動(dòng)物的AML細(xì)胞的連續(xù)傳代未能在接受者小鼠中種群恢復(fù)。該抗體的作用似乎是通過(guò)干擾白血病干細(xì)胞的分化和AML細(xì)胞與適當(dāng)生態(tài)位之間的相互作用來(lái)介導(dǎo)的。另外，受輻射的具有人臍帶血干細(xì)胞的NOD-SCID小鼠的種群恢復(fù)不受該處理的損傷，這說(shuō)明了該抗體的選擇性作用和還有AML和正常人造血干細(xì)胞之間的重要表現(xiàn)型差異。抗體1.1ASML,即針對(duì)⑶44的v6變體的小鼠IgGl，顯示出減少大鼠胰腺腺癌BSp73ASML的淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移。受處理的動(dòng)物的存活隨之增多。抗體只有在淋巴結(jié)建群之前施用時(shí)才有效，且假定其干擾淋巴結(jié)中的細(xì)胞增殖。體外不存在該抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞直接細(xì)胞毒性，且該抗體不增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或免疫效應(yīng)子細(xì)胞功能。沒(méi)有描述該抗體對(duì)人細(xì)胞的效用。Breyer等描述了可商購(gòu)的抗CD44抗體中斷同位移植大鼠成膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)展的應(yīng)用。大鼠成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系C6植入到額葉中，并在I周后，通過(guò)大腦內(nèi)注射給予大鼠3次該抗體的處理。受處理的大鼠證明了減少腫瘤生長(zhǎng)，和比緩沖液或同種型對(duì)照處理的大鼠更高的體重。該抗體能夠抑制細(xì)胞在體外與用胞外基質(zhì)成分覆蓋的蓋玻片粘連，但是不具有針對(duì)細(xì)胞的任何直接細(xì)胞毒性作用。該抗體沒(méi)有針對(duì)人細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。進(jìn)行了這樣的研究，其比較了抗⑶44抗體(頂-7.8.1)和抗⑶44vl0抗體(K926)的功效。將高度轉(zhuǎn)移的鼠黑素瘤品系B16F10，其表達(dá)這兩種⑶44同種型，靜脈內(nèi)植入小鼠。2天后，在研究的期間內(nèi)給藥抗體，每3天一次。這兩種抗體均導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移數(shù)量大于50%的顯著減少；這兩種抗體之間不存在功效的顯著差別。該抗體不影響體外增殖，且作者即Zawadzki等推測(cè)腫瘤生長(zhǎng)的抑制歸因于抗體阻斷⑶44與其配體的相互作用。在另一項(xiàng)使用M-7.8.1的研究中，Zahalka等證明了該抗體及其F(ab，)2片段能通過(guò)鼠T細(xì)胞淋巴瘤LB阻斷浸潤(rùn)淋巴結(jié)。這賦予小鼠顯著的存活益處。Wallach-Dayan等顯示用⑶44v4_vl0轉(zhuǎn)染不自發(fā)形成腫瘤的LB-TR鼠淋巴瘤賦予形成腫瘤的能力。與同種型對(duì)照抗體相比，IM-7.8.1的施用減少植入的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤尺寸。這些研究中沒(méi)有一個(gè)證明了關(guān)于該抗體的人類效用。`GKff.A3，即小鼠IgG2a，特異于人⑶44并阻止人黑素瘤異種移植物在SCID小鼠中的形成和轉(zhuǎn)移。將該抗體與轉(zhuǎn)移人細(xì)胞系SMMU-2混合，并然后進(jìn)行皮下注射。處理持續(xù)隨后3周。4周后，與來(lái)處理的動(dòng)物的100%相比，僅1/10小鼠在注射位點(diǎn)發(fā)育腫瘤。該抗體的F(ab’)2片段證明了相同的腫瘤形成抑制，這提示該作用機(jī)制不依賴于補(bǔ)體或抗體依賴性細(xì)胞毒性。如果腫瘤細(xì)胞在第一次抗體注射前一周注射，則80%的動(dòng)物在原發(fā)位點(diǎn)發(fā)育腫瘤。然而，注意到，存活時(shí)間仍然顯著延長(zhǎng)。盡管延遲的抗體施用對(duì)原發(fā)腫瘤形成沒(méi)有作用，但是其完全阻止在末處理動(dòng)物中存在的向肺、腎、腎上腺、肝和腹膜的轉(zhuǎn)移。該抗體既不具有在體外針對(duì)該細(xì)胞系的任何直接細(xì)胞毒性，也不干擾SMMU-2細(xì)胞的增殖，且似乎具有通過(guò)影響轉(zhuǎn)移或生長(zhǎng)具有其影響腫瘤形成的主要作用。該抗體的一個(gè)值得注意的特性是其識(shí)別CD44的所有同種型，這提示用于治療應(yīng)用的有限可能性。Strobel等描述小鼠異種移植模型中抗⑶44抗體(克隆515)抑制人卵巢癌細(xì)胞腹膜植入的應(yīng)用。將人卵巢細(xì)胞系36M2在存在抗CD44抗體或?qū)φ湛贵w的條件下腹膜內(nèi)植入小鼠中，并且然后在隨后的20天內(nèi)施用處理。5周后，在該抗體處理的組中在腹膜腔中存在顯著更少的結(jié)節(jié)。來(lái)自這兩種抗⑶44和對(duì)照處理的組的結(jié)節(jié)尺寸相同，這提示細(xì)胞一旦植入，則抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有作用。當(dāng)皮下植入細(xì)胞時(shí)，也不存在對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用，這說(shuō)明抗體本身不具有抗增殖或細(xì)胞毒性作用。另外，該抗體對(duì)體外細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有作用。VFF-18,也稱為BIWAl，是針對(duì)⑶44的v6變體的高親和性抗體，其特異于該多肽的360-370區(qū)。該抗體在12名患者的第一階段臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)被用作99m锝標(biāo)記的綴合物。測(cè)試了該抗體在患有頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌的患者中的安全性和靶向潛力。注射后40小時(shí)，14%的注射劑量被腫瘤吸收，在其他器官包括腎、脾和骨髓中具有最少的累積。高度選擇性腫瘤結(jié)合提示該抗體在放射免疫療法中的功能，盡管該抗體的異常高親和性阻止?jié)B透進(jìn)入腫瘤的較深層。應(yīng)用BIWAl的其他局限是鼠抗體的免疫原性(12名患者中的11名形成人抗小鼠抗體(HAMA))，遍及腫瘤的異源累積和抗體-可溶性CD44復(fù)合物的形式。WO02/094879公開了設(shè)計(jì)用于克服HAMA反應(yīng)的VFF-18的人源化形式，稱為BIWA4。發(fā)現(xiàn)BIWA4具有比母體VFF18抗體顯著更低的抗原結(jié)合親和性。令人驚訝地，較低親和性BIWA4抗體具有比較高親和性B1WA8人源化VFF-18抗體更好的腫瘤吸收特征。99m锝標(biāo)記的和186錸標(biāo)記的BIWA4抗體均在33名患者的第一階段臨床實(shí)驗(yàn)中評(píng)估，以確定186Re標(biāo)記的BIWA4的情形中的安全性、耐受能力、腫瘤累積和最大耐受劑量。似乎存在99mTc標(biāo)記的BIWA4腫瘤相關(guān)吸收。關(guān)于所有劑量186Re標(biāo)記的BIWA4沒(méi)有觀察到腫瘤反應(yīng)，盡管一些具有穩(wěn)定的疾病；劑量限制性毒性出現(xiàn)在60mCi/m2。存在50-65%的有害事件率，認(rèn)為33名患者中的12名具有嚴(yán)重的有害事件(血小板減少癥、白血球減少癥和發(fā)燒)且其中6名均受到186Re標(biāo)記的BIWA4處理的患者在處理過(guò)程中或后續(xù)由于疾病進(jìn)展而死亡。2名患者形成人抗人抗體(HAHA)。在20名患者中進(jìn)行186Re標(biāo)記的BIWA4的第一階段劑量逐步增加實(shí)驗(yàn)。觀察到口腔粘膜炎和劑量限制性血小板減少癥和白血球減少癥；一名患者形成HAHA反應(yīng)。在以最高劑量60 mCi/m2處理的5名患者中觀察到穩(wěn)定的疾病。盡管認(rèn)為對(duì)于獲得的功效而言安全性和耐性能力是可接受的，但是這些研究與臨床研究中的其他非放射性同位素綴合生物療法相比，具有更高的有害事件率。美國(guó)專利申請(qǐng)US 2003/0103985公開了與美登木素生物堿綴合的人源化VFF-18形式，稱為BIWI1，用于腫瘤治療中。發(fā)現(xiàn)人源化VFF18抗體，即BIWA4，在與毒素，即BIWIl綴合時(shí)，在人外陰表皮狀癌、咽鱗狀細(xì)胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有顯著的抗腫瘤作用。未綴合形式，即BIWA4，不具有抗腫瘤作用。在BIWIl的第一階段實(shí)驗(yàn)中，該實(shí)驗(yàn)針對(duì)受 不可治愈的頭頸癌影響的患者，由于實(shí)驗(yàn)的過(guò)早中斷，不可以確定最大耐受劑量，實(shí)驗(yàn)的過(guò)早中斷歸因于患者之一由大規(guī)模皮膚毒性引起的死亡。在平行的第二項(xiàng)BIWIl實(shí)驗(yàn)中，該實(shí)驗(yàn)也針對(duì)患有頭頸癌的患者，確定MTD且它是皮膚毒性的結(jié)果。在第三項(xiàng)關(guān)于BIWIl的實(shí)驗(yàn)中，該實(shí)驗(yàn)針對(duì)預(yù)先經(jīng)歷了化學(xué)療法的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，大多數(shù)常見(jiàn)毒性是輕微的和瞬間皮膚病癥。通過(guò)該方法，即使不存在功效的客觀測(cè)量，50%的受處理的患者顯示出不依賴劑量的穩(wěn)定疾病。關(guān)于所有實(shí)驗(yàn)的總負(fù)面風(fēng)險(xiǎn)對(duì)比功效評(píng)估，由于缺乏致命事件的可預(yù)言性，導(dǎo)致停止進(jìn)一步開發(fā)該藥物。Mab U36是通過(guò)UM_SCC_22B人下咽骨癌細(xì)胞免疫和關(guān)于癌癥和組織特異性的選擇產(chǎn)生的鼠單克隆IgGl抗體。通過(guò)cDNA克隆和序列分析獲得的抗原特征確定角化細(xì)胞-特異性⑶44剪接變體epican的v6結(jié)構(gòu)域?yàn)镸ab U36的靶標(biāo)。免疫組化研究顯示表位局限于細(xì)胞膜。此外，Mab U36強(qiáng)烈標(biāo)記94%的頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)，并且在這些腫瘤中存在均勻的細(xì)胞染色。10名患者99mTc標(biāo)記的Mab U36研究顯示抗體對(duì)HNSCC癌的選擇性累積(在2天時(shí)，20.4+/-12.4%注射的劑量/kg);沒(méi)有報(bào)告副作用，但2名患者形成HAMA。在放射性碘標(biāo)記的的鼠Mab U36的研究中，存在18名患者中的3個(gè)HAMA案例和HNSCC中的選擇性同源吸收。為了減小Mab U36的抗原性和減少HAMA率，構(gòu)建嵌合抗體。嵌合或原始鼠Mab U36均不具有ADCC活性。不存在關(guān)于Mab U36的天然功能活性的證據(jù)。使用186Re標(biāo)記的嵌合Mab U36確定Mab U36作為治療劑的效用。在該第一階段逐步增加劑量實(shí)驗(yàn)中，13名患者接受跟蹤劑量的99mTc標(biāo)記的嵌合Mab U36，隨后是186Re標(biāo)記的嵌合Mab U36。沒(méi)有報(bào)告急性有害事件，但是處理后，在3名患者中的2名中觀察到劑量限制性骨髓毒性(myelotoxcity) (1.5 GBq/m2),且在I名受最大耐受劑量(1.0 GBq/m2)處理的患者中觀察到血小板減少癥。盡管對(duì)腫瘤尺寸存在一些影響，但是這些影響達(dá)不到對(duì)處理的客觀反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于186Re標(biāo)記的嵌合Mab U36的進(jìn)一步研究使用利用粒細(xì)胞集落刺激因子刺激的全血再灌輸?shù)牟呗裕瑥亩鴮⒆畲竽褪芑钚约颖兜?.8 Gy0在該關(guān)于9名患有不同頭頸腫瘤的患者的研究中，3名由于與藥物有關(guān)的貧血而需要輸血。其他毒性包括3級(jí)骨髓毒性和2級(jí)粘膜炎。沒(méi)有報(bào)告客觀腫瘤反應(yīng)，盡管在5名患者中獲得穩(wěn)定疾病3-5個(gè)月。因此，可以看到，盡管Mab U36是高度特異性的抗體，但是需要放射性免疫綴合物還實(shí)現(xiàn)抗癌作用的缺點(diǎn)限制其有效性，因?yàn)楂@得與涉及臨床作用的治療有關(guān)的毒性。總而言之，CD44v6(l.1ASML)和CD44vlO (K926)單克隆抗體分別在注射了轉(zhuǎn)移型胰腺腺癌的大鼠或注射了惡性黑素瘤的小鼠中顯示出了降低的轉(zhuǎn)移活性。另一種抗CD44v6抗體(VFF-18及其衍生物)，只有在與美登木素生物堿或放射性同位素綴合時(shí)，顯示出具有抗腫瘤作用。抗標(biāo)準(zhǔn)CD44單克隆抗體也表現(xiàn)出抑制大鼠成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的大腦內(nèi)進(jìn)展(抗⑶44)，小鼠T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴結(jié)侵入(1M-7.8.1)以及抑制人卵巢癌細(xì)胞系植入裸鼠(克隆515)，小鼠黑素瘤細(xì)胞系的肺轉(zhuǎn)移(IM-7.8.1)和人黑素瘤細(xì)胞系在SCID小鼠中的轉(zhuǎn)移(GKW.A3)。放射性同位素綴合的Mab U36抗CD44v6抗體及其衍生物在臨床實(shí)驗(yàn)中具有抗腫瘤活性，其伴隨顯著的毒性。這些結(jié)果，盡管鼓勵(lì)和支持抗CD44單克隆抗體作為潛在的癌癥治療法的開發(fā)，但是證明了有限的效力、安全性、或?qū)θ祟惏┌Y的適用性。因此，如果分離 一種介導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞毒性的抗體組合物，其CD44在所述細(xì)胞上的細(xì)胞表面表達(dá)的功能作為其吸引力，則將實(shí)現(xiàn)有價(jià)值的診斷和治療方法。作為癌癥治療的單克隆抗體:患有癌癥的每個(gè)個(gè)體都是獨(dú)特的，并且患有與其它癌癥不同的癌癥，正如個(gè)人的身份一樣。除此之外，目前的治療法以相同的方法治療患有同種類型的癌癥、處于相同的階段的所有患者。這些患者中至少有30%將在一線治療中失敗，由此導(dǎo)致以后幾輪的治療和治療失敗、轉(zhuǎn)移、以及最終死亡的增加的可能性。較好的治療方法應(yīng)該是對(duì)于特定的個(gè)體量身定制的治療法。目前本身適于量身定制的唯一的治療法是手術(shù)。化療和放射治療不能對(duì)患者進(jìn)行量身定做，并且手術(shù)本身在大部分情形中不足以產(chǎn)生治愈。隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，由于每種抗體可以針對(duì)單個(gè)表位，則開發(fā)量身定制的治療法的方法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)。此外,產(chǎn)生針對(duì)獨(dú)特限定特定個(gè)體的腫瘤的表位群的抗體組合也是可能的。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到在癌癥細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著不同是在于癌癥細(xì)胞包含對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞特異的抗原，科學(xué)團(tuán)體長(zhǎng)期認(rèn)為單克隆抗體可以設(shè)計(jì)成通過(guò)特異性與這些癌癥抗原結(jié)合而特異性靶向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；因此產(chǎn)生這樣的信心:單克隆抗體可以作為“魔力子彈(Magic Bullets)”來(lái)消除癌細(xì)胞。然而，現(xiàn)在廣泛認(rèn)識(shí)到，沒(méi)有任何一種單個(gè)的單克隆抗體可以在所有癌癥情形中起作用，并且單克隆抗體可以被開發(fā)為一類作為靶向癌癥治療。已經(jīng)表明按照本文公開的發(fā)明的教導(dǎo)分離的單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病過(guò)程，例如通過(guò)減少腫瘤負(fù)荷的方式，并且在本文中應(yīng)該不同地稱為減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)或“抗癌”抗體。目前，癌癥患者通常具有很少的治療選擇。對(duì)癌癥治療法的管理方法已經(jīng)在全球存活和發(fā)病率中產(chǎn)生了改善。然而，對(duì)于特定的個(gè)體，這些改善的統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)有與他們個(gè)人情況的改善必然相關(guān)。因此，如果采用能夠使執(zhí)業(yè)者獨(dú)立于處于同一團(tuán)體中的其他患者而治療每種腫瘤的方法，這將允許產(chǎn)生僅使治療適合該名個(gè)體的獨(dú)特方法。這樣的治療療程將理想地增加治愈率，并且產(chǎn)生更好的結(jié)果，由此滿足長(zhǎng)期渴望的需要。歷史上，多克隆抗體已經(jīng)進(jìn)行了應(yīng)用，在治療人類癌癥中具有有限的成功。已經(jīng)使用人血漿治療淋巴瘤和白血病，但是存在很少延長(zhǎng)的好轉(zhuǎn)或反應(yīng)。此外，與化療相比，缺少再現(xiàn)性，并且沒(méi)有其它的益處。實(shí)體瘤諸如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌也已經(jīng)使用人血液、黑猩猩血清、人血漿和馬血清進(jìn)行治療，具有相對(duì)不可預(yù)知的和無(wú)效的結(jié)果。對(duì)于實(shí)體瘤，已經(jīng)存在單克隆抗體的許多臨床試驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代，對(duì)于人乳腺癌存在至少4種臨床試驗(yàn)，其使用針對(duì)特異抗原的抗體或基于組織選擇性，在至少47名患者中僅產(chǎn)生一名響應(yīng)者。直到1998年才出現(xiàn)使用人源化的抗Her2/neu抗體(Herceptin”e)與順鉬組合的成功的臨床試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中，評(píng)估37名患者的響應(yīng),其中約
四分之一具有部分響應(yīng)率，另外四分之一具有較小或穩(wěn)定的疾病發(fā)展。在所述響應(yīng)者中對(duì)發(fā)展的中值時(shí)間是8.4個(gè)月，中值響應(yīng)持續(xù)5.3個(gè)月。Herceptin 在1998年首次核準(zhǔn)與Taxof組合用于一線應(yīng)用。臨床研究結(jié)果顯示，與僅接受Taxol 的組(3.0個(gè)月)相比，對(duì)于接受抗體治療加Taxd 的那些的疾病發(fā)展的中值時(shí)間(6.9個(gè)月)增加。在中值存活中也存在稍微的增加；對(duì)于Herceptin_;il加Taxol 治療組相對(duì)于單獨(dú)的Taxdi^S療組為22個(gè)月相對(duì)于18個(gè)月。另外，與單獨(dú)的Taxol 相比較，在抗體加Taxof1組合組中，在完全(8%相對(duì)于2% )和部分響應(yīng)者(34%相對(duì)于15%)的數(shù)量中存在增加。然而，與單獨(dú)的了ax()i 治療相比較,用Herceptin 和Taxol 治療導(dǎo)致更高的心臟中毒的發(fā)生(分別為13%相對(duì)于1% )。此外，Herceptir^g療法只對(duì)過(guò)量表達(dá)(通過(guò)免疫組化(IHC)分析確定)人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her2/neu)的患者，患有轉(zhuǎn)移乳腺癌的患者的大約25%中有效；所述人表皮生長(zhǎng)因子受體2是一種受體，其目前具有未知的功能或生物學(xué)重要的配體。因此，對(duì)于患有乳腺癌的患者仍然存在大量未滿足的需求。即使可以受益于Herceptin 治療的那些仍然需要化療，并且因此仍然必須處理，至少在某種程度上，處理這種治療的副作用。研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)包括針對(duì)糖蛋白和糖脂靶點(diǎn)的抗體。抗體如17-1A，其對(duì)于腺癌具有某種特異性，已經(jīng)在六十多名患者中進(jìn)行了 2期臨床試驗(yàn)，僅有I名患者具有部分響應(yīng)。在其它試驗(yàn)中，在使用額外的環(huán) 磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中僅產(chǎn)生I例完全響應(yīng)和2例較小的響應(yīng)。迄今為止，17-1A的III期臨床試驗(yàn)尚未表現(xiàn)出作為III期結(jié)腸癌的輔助治療的提高的功效。最初核準(zhǔn)用于成像的人源化鼠單克隆抗體的應(yīng)用也沒(méi)有產(chǎn)生腫瘤衰減。僅在最近，使用單克隆抗體的結(jié)腸直腸癌臨床研究產(chǎn)生了一些積極的結(jié)果。在2004年，ERBITUX 核準(zhǔn)用于患有表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌的患者的二線治療，所述患者對(duì)基于伊立替康的化療不起反應(yīng)(refractory)。來(lái)自兩組(two-arm) II期臨床研究和單組研究的結(jié)果表明，ERBITUX 與伊立替康組合分別具有23%和15%的響應(yīng)率，疾病發(fā)展的中值時(shí)間分別為4.1個(gè)月和6.5個(gè)月。來(lái)自同一兩組II期臨床研究和另一單組研究的結(jié)果表明，僅用ERBIIUX 治療分別導(dǎo)致11%和9%的響應(yīng)率，疾病發(fā)展的中值時(shí)間分別為1.5個(gè)月和4.2個(gè)月。因此，在瑞士和美國(guó)，ERBITUX 與伊立替康組合治療，并且在美國(guó)，單獨(dú)的ERB1TIJX 治療，已經(jīng)被核準(zhǔn)作為在一線伊立替康治療中失敗的結(jié)腸癌患者的二線治療。因此，如同Herceptin ，在瑞士只核準(zhǔn)治療作為單克隆抗體和化療的組合。另外，在瑞士和美國(guó)只核準(zhǔn)治療作為二線治療用于患者。此外，在2004年，AVASTIN 被核準(zhǔn)與靜脈內(nèi)基于5-氟尿嘧啶的化療組合用作轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結(jié)果表現(xiàn)出與僅用5-氟尿嘧啶治療的患者相比，用AVASTIN 加5-氟尿嘧啶治療的患者的中值存活延長(zhǎng)(分別為20個(gè)月相對(duì)于16個(gè)月)。然而，同樣如同Herceptin 和ERBITUX ，治療僅被核準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療的組合。對(duì)于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌還繼續(xù)存在極差的結(jié)果。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的最有希望的最近的結(jié)果來(lái)自II期臨床試驗(yàn)，其中治療包括與殺細(xì)胞藥多柔比星綴合的單克隆抗體(SGN-15 ；dox-BR96,抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其與化療藥
TAXOTEREB組合。TAXOTER￡K是唯--種FDA核準(zhǔn)的化療藥，用于肺癌的二線治
療。原始數(shù)據(jù)顯示與單獨(dú)的TA X OT E R E *相比提高的整體存活時(shí)間。在本研究征募的62名患者中，三分之二接 受SGN-15與TAXOTERE18'組合，而其余三分之一接受單獨(dú)的TAXOTERE'對(duì)于接受SGN-15與TAXOTERE 姐合的患者，中值整體存活時(shí)間是7.3個(gè)月，而與之比較的接受單獨(dú)的TAXOTERE 的患者是5.9個(gè)月。對(duì)于接受SNG-15加TAXOTERE 的患者的整體存活時(shí)間為I年和18個(gè)月的分別為29%和18%，而與之比較的對(duì)于接受單獨(dú)的TAXOTERE 的患者分別為24 %和8 %。計(jì)劃了進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。臨床前，對(duì)于黑素瘤使用單克隆抗體已經(jīng)存在一些有限的成功。這些抗體中很少已經(jīng)達(dá)到臨床試驗(yàn)階段，并且迄今為止沒(méi)有一種已經(jīng)被核準(zhǔn)或在III期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出有利的結(jié)果。治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)受到在30，000種已知的基因產(chǎn)物中缺少相關(guān)靶點(diǎn)的鑒定的阻礙，所述30，000種已知的基因可能有助于疾病的發(fā)病機(jī)理。在腫瘤學(xué)研究中，潛在的藥物靶點(diǎn)通常由于它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的事實(shí)來(lái)簡(jiǎn)單地選擇。然后篩選這樣鑒定的靶點(diǎn)與多種化合物的相互作用。在潛在的抗體治療的情形中，這些候選化合物通常衍生于根據(jù) Kohler 和 Milstein 所述的基本原理(1975,自然(Nature), 256,495-497, Kohler 和Milstein)的單克隆抗體產(chǎn)生的常規(guī)方法。從用抗原(例如，全細(xì)胞，細(xì)胞級(jí)分，純化的抗原)免疫的小鼠收集脾細(xì)胞，并且與無(wú)限增殖的雜交瘤配偶體融合。篩選所得到的雜交瘤，并且針對(duì)最親和性地與所述靶點(diǎn)結(jié)合的抗體的分泌進(jìn)行選擇。針對(duì)癌細(xì)胞的許多治療和診斷抗體，包括Herceptin 和RITUXIMAB，已經(jīng)使用這些方法產(chǎn)生，并且基于它們的親和性進(jìn)
行選擇。這種方法中的缺點(diǎn)是兩方面的。首先，對(duì)治療或診斷抗體結(jié)合選擇適當(dāng)?shù)陌悬c(diǎn)受到關(guān)于組織特異性致癌過(guò)程的極少的知識(shí)以及用于鑒定這些靶點(diǎn)的所得到的過(guò)于單純化的方法的限制，所述過(guò)于單純化的方法如通過(guò)過(guò)量表達(dá)進(jìn)行選擇。第二，與受體以最大的親和力結(jié)合的藥物分子通常具有起始或抑制信號(hào)的最大可能性的假設(shè)可能不總是這種情形。除了對(duì)于乳腺癌和結(jié)腸癌的治療的一些進(jìn)展之外，作為單一藥劑或共同治療的有效抗體治療的鑒定和開發(fā)對(duì)于所有類型的癌癥尚是不充足的。現(xiàn)有專利:美國(guó)專利號(hào)5，750，102公開這樣一種方法，其中來(lái)自患者腫癌的細(xì)胞用MHC基因轉(zhuǎn)染，所述MHC基因可克隆自來(lái)自該患者的細(xì)胞或組織。然后，使用這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免疫該患者。美國(guó)專利號(hào)4，861，581公開這樣一種方法，所述方法包括下列步驟:獲得單克隆抗體，所述單克隆抗體對(duì)哺乳動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞成分是特異性的，但是對(duì)外部成分不是特異性的；標(biāo)記所述單克隆抗體，使所標(biāo)記的抗體與已經(jīng)接受治療的哺乳動(dòng)物組織接觸以殺死腫瘤細(xì)胞；并且通過(guò)測(cè)量所標(biāo)記的抗體與退化的腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞成分的結(jié)合而確定治療的功效。在制備針對(duì)人細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體時(shí)，專利權(quán)所有人認(rèn)為惡性細(xì)胞代表這樣的抗原的便利的來(lái)源。美國(guó)專利號(hào)5，171，665提供一種新型抗體以及其生產(chǎn)方法。具體地，該專利教導(dǎo)形成這樣的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有與人腫瘤例如結(jié)腸腫瘤和肺腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)抗原的那些強(qiáng)結(jié)合而與正常細(xì)胞以 弱得多的程度結(jié)合的性質(zhì)。美國(guó)專利號(hào)5，484，596提供一種癌癥治療方法，所述方法包括從人癌癥患者手術(shù)取出腫瘤組織，處理所述腫瘤組織以獲得腫瘤細(xì)胞，輻射所述腫瘤細(xì)胞以成為存活的但非腫瘤發(fā)生性的，并且使用這些細(xì)胞制備用于患者的疫苗，所述疫苗能夠抑制原發(fā)瘤的復(fù)發(fā)而且同時(shí)抑制轉(zhuǎn)移。該專利教導(dǎo)開發(fā)與腫瘤細(xì)胞的表面抗原反應(yīng)的單克隆抗體。如在第4欄45行等描述的，專利權(quán)所有人在開發(fā)用于人腫瘤形成的表達(dá)單克隆抗體的活性特異性免疫治療中使用自生的腫瘤細(xì)胞。美國(guó)專利號(hào)5，693，763教導(dǎo)一種糖蛋白抗原，其是人癌癥特有的，并且不依賴于起源的上皮組織。美國(guó)專利號(hào)5，783，186涉及在表達(dá)Her2的細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗_Her2抗體，產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞系，使用所述抗體治療癌癥的方法和包括所述抗體的藥物組合物。美國(guó)專利號(hào)5，849，876描述了用于產(chǎn)生針對(duì)黏蛋白抗原的單克隆抗體的新雜交瘤細(xì)胞系，所述黏蛋白抗原由腫瘤和非腫瘤組織來(lái)源純化。美國(guó)專利號(hào)5，869，268涉及產(chǎn)生人淋巴細(xì)胞的方法，所述人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)目的抗原特異性的抗體，產(chǎn)生單克隆抗體的方法，以及由所述方法產(chǎn)生的單克隆抗體。該專利特別涉及有效用于癌癥診斷和治療的抗-HD人單克隆抗體的生產(chǎn)。美國(guó)專利號(hào)5，869，045涉及與人癌癥細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體綴合物和單鏈免疫毒素。這些抗體作用的機(jī)制是兩面性的，原因在于分子與在人癌癥表面上存在的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，并且此外，原因在于所述抗體具有在癌癥細(xì)胞內(nèi)部?jī)?nèi)在化的能力，隨后結(jié)合，使它們特別有效用于形成抗體-藥物和抗體-毒素綴合物。在它們的未修飾形式中，所述抗體還在特定的濃度表現(xiàn)出細(xì)胞毒性特征。美國(guó)專利號(hào)5，780，033公開自體抗體用于腫瘤治療和預(yù)防的應(yīng)用。然而，這種抗體是來(lái)自年老的哺乳動(dòng)物的抗核自體抗體。在這種情形中，認(rèn)為該自體抗體是在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種自然抗體類型。因?yàn)樵撟泽w抗體來(lái)自“年老的哺乳動(dòng)物”，不存在所述自體抗體實(shí)際來(lái)自被治療的患者的要求。另外，該專利公開了來(lái)自年老的哺乳動(dòng)物的天然和單克隆抗核自體抗體，和產(chǎn)生單克隆抗核自體抗體的雜交瘤細(xì)胞系。美國(guó)專利號(hào)5，916，561公開抗⑶44基因的變體外顯子v6的特異性抗體，VFF-18，及其變體。該抗體是超越比較物抗體的改進(jìn)，因?yàn)槠渥R(shí)別人CD44v6變體而非大鼠CD44v6變體。另外，該抗體公開了用于CD44v6表達(dá)的診斷測(cè)定。關(guān)于該抗體沒(méi)有公開體外或體內(nèi)功能。
美國(guó)專利號(hào)5，616，468公開針對(duì)含有由人⑶44基因外顯子6A編碼的序列的合成肽產(chǎn)生的單克隆抗體，Var3.1。具體地,該抗體不結(jié)合人0)44的90kD形式且與Hermes-3抗體不同。提供用于檢測(cè)CD44的v6變體的方法，以及用于基于該抗原來(lái)篩選和測(cè)定惡性轉(zhuǎn)化的方法。還提供了用于基于在血清中檢測(cè)該抗原來(lái)篩選炎癥的方法。美國(guó)專利號(hào)5，879，898公開結(jié)合人⑶44變體6的129bp外顯子的特異性抗體，其生成43個(gè)氨基酸的肽。單克隆抗體通過(guò)許多雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生:MAK〈⑶44>M-1.1.12，MAK〈⑶44>M-2.42.3，MAK〈⑶44>M_4.3.16。該抗體由融合蛋白產(chǎn)生，所述融合蛋白包含新CD44v6氨基酸序列的至少六肽。此外，存在關(guān)于檢測(cè)可以用作癌癥診斷的外顯子6變體的免疫測(cè)定的內(nèi)容。顯著地，沒(méi)有公開該抗體的體外或體內(nèi)功能。美國(guó)專利號(hào)5，942，417公開編碼⑶44樣多肽的多核苷酸，和利用該多核苷酸及其變體制備重組蛋白的方法。要求保護(hù)了針對(duì)這些多肽的抗體，然而，不存在具體的實(shí)施例且沒(méi)有保藏分泌所述抗體的克隆。Northern印跡證明該多核苷酸出現(xiàn)在若干組織類型中，但是沒(méi)有伴隨證據(jù)顯示存在該多核苷酸的翻譯和表達(dá)。因此，沒(méi)有這樣的證據(jù)，即存在針對(duì)該多核苷酸的基因產(chǎn)物制備的抗體，這些抗體應(yīng)該具有體外或體內(nèi)功能，和它們是否與人癌性疾病相關(guān)。美國(guó)專利號(hào)5，885，575公開與⑶44的變體表位反應(yīng)的抗體和通過(guò)使用該抗體識(shí)別該變體的方法。編碼該變體的分離的多核苷酸從大鼠細(xì)胞分離，且針對(duì)該變體的抗體，mAbl.1ASML，識(shí)別分子量為120kD，150kD, 180kD，和200kD的蛋白。單克隆抗體1.1ASML的施用延遲大鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。顯著地，1.1ASML不識(shí)別人腫瘤，如其缺乏與LCLC97人大細(xì)胞肺癌的反應(yīng)性所證明地。從LCLC97分離人類同源物，但是沒(méi)有生成識(shí)別該同源物的等價(jià)抗體。因此，盡管生成了特異于大鼠CD44的變體的抗體，并顯示出影響大鼠腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，但是不存在關(guān)于該抗體針對(duì)人腫瘤的作用的證據(jù)。更明確地，該發(fā)明人指出該抗體不識(shí)別人類癌癥。發(fā)明概述本申請(qǐng)利用在U.S.6，180，357專利中教導(dǎo)的生產(chǎn)患者特異的抗癌抗體的方法分離雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系編碼減輕癌性疾病的單克隆抗體。這些抗體可以針對(duì)一種腫瘤特異性制備，并且因此使得癌癥治療的量身定制成為可能。在本申請(qǐng)的情形中，具有殺傷細(xì)胞(細(xì)胞毒性)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(抑制細(xì)胞)特性的抗癌抗體在下文中稱為細(xì)胞毒性的。這些抗體可以用于輔助癌癥的分階段和診斷，并且可以用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。這些抗體還可以用于通過(guò)預(yù)防治療的方式用于預(yù)防癌癥。與根據(jù)傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)樣本(paradigm)產(chǎn)生的抗體不同，以這種方式產(chǎn)生的抗體可以靶向這樣的分子和途徑，所述分子和途徑先前沒(méi)有顯示出對(duì)于惡性組織的生長(zhǎng)和/或存活是必需的。此外，這些抗體的結(jié)合親和力適合起始可能不易受更強(qiáng)的親和性相互作用影響的細(xì)胞毒性事件的需要。此外，將標(biāo)準(zhǔn)化療形式如放射性核素與本發(fā)明的CDMAB綴合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，由此集中在所述化療劑的應(yīng)用。所述CDMAB也可以與毒素、細(xì)胞毒性部分、酶例如生物素綴合的酶、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分或造血細(xì)胞綴合，由此形成抗體綴合物。所述CDMAB可以單獨(dú)或與一種或多種CDMAB/化療劑組合使用。個(gè)體化的抗癌治療的前景將在患者的管理方式中引起改變。可能的臨床方案(scenario)是在出現(xiàn)時(shí)獲得腫瘤樣品，并且儲(chǔ)存。從該樣品，腫瘤可以用一組預(yù)先存在的減輕癌性疾病的抗體而確定類型。將患者進(jìn)行常規(guī)分階段，但是可用的抗體可以用于將患者進(jìn)一步分階段。患者可以立即用現(xiàn)有的抗體進(jìn)行治療，并且使用本發(fā)明描述的方法或通過(guò)利用噬菌體展示文庫(kù)與本發(fā)明公開的篩選方法聯(lián)合，可以產(chǎn)生一組對(duì)腫瘤特異性的抗體。由于其它腫瘤可能攜帶一些與被治療的腫瘤相同的表位，故將產(chǎn)生的所有抗體加入到抗癌抗體文庫(kù)中。按照該方法產(chǎn)生的抗體可以有效用于治療許多患有與這些抗體結(jié)合的癌癥的患者中的癌性疾病。除了抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的治療作為多形式治療方案的一部分。通過(guò)本方法分離的抗體對(duì)非癌癥細(xì)胞是相對(duì)無(wú)毒的事實(shí)允許以高劑量使用抗體組合，單獨(dú)的，或與常規(guī)治療組合。高治療指數(shù)還允許在短時(shí)間范圍內(nèi)再次治療，這應(yīng)該降低耐受治療的細(xì)胞出現(xiàn)的可能性。 如果患者對(duì)初始的治療療程沒(méi)有反應(yīng)或發(fā)展了轉(zhuǎn)移，則可以重二復(fù)產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的特異性抗體的方法，進(jìn)行再次治療。此外，所述抗癌抗體可以與從該患者獲得的紅細(xì)胞綴合，并且重新輸注用于治療轉(zhuǎn)移。對(duì)于轉(zhuǎn)移癌存在很少有效的治療，并且轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)致死亡的最壞結(jié)果。然而，轉(zhuǎn)移癌通常充分地血管化，通過(guò)紅細(xì)胞遞送抗癌抗體可以具有將所述抗體集中在腫瘤部位的作用。甚至在轉(zhuǎn)移之前，大部分癌癥細(xì)胞依賴于宿主的血液供應(yīng)它們的生存，并且與紅細(xì)胞綴合的抗癌抗體還可以有效針對(duì)原位腫瘤。備選地，所述抗體可以與其它造血細(xì)胞綴合，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞等。存在5類抗體，并且每類與由其重鏈賦予的功能相關(guān)。通常認(rèn)為由裸抗體殺傷癌癥細(xì)胞通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)進(jìn)行介導(dǎo)。例如，鼠IgM和IgG2a抗體可以通過(guò)結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)的C-1成分而激活人補(bǔ)體，由此激活可以導(dǎo)致腫瘤消退的補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑。對(duì)于人抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體通常是IgM和IgGl。IgG2a和IgG3同種型的鼠抗體有效募集具有Fe受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞，其將導(dǎo)致由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞殺傷。IgGl和IgG3同種型的人抗體介導(dǎo)ADCC。通過(guò)Fe區(qū)域介導(dǎo)的細(xì)胞毒性需要存在效應(yīng)細(xì)胞、其相應(yīng)受體、或蛋白質(zhì)，例如NK細(xì)胞、T-細(xì)胞和補(bǔ)體。在缺乏這些效應(yīng)子機(jī)制的條件下，抗體的Fe部分是無(wú)活性的。抗體的Fe部分可以賦予這樣的特性，即影響抗體體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)，但在體外其是無(wú)效的。
抗體介導(dǎo)的癌癥殺傷的另一種可能的機(jī)制可以通過(guò)使用催化細(xì)胞膜中的不同化學(xué)鍵的水解的抗體以及其相關(guān)的糖蛋白或糖脂，即所謂的催化抗體進(jìn)行。存在3種抗體-介導(dǎo)的癌癥細(xì)胞殺傷的其它機(jī)制。第一種是使用抗體作為疫苗來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)存在于癌癥細(xì)胞上的推定的抗原的免疫反應(yīng)。第二種是使用這樣的抗體，所述抗體靶向生長(zhǎng)受體，并且干擾它們的功能，或下調(diào)所述受體，以致有效地喪失其功能。第三種是所述抗體對(duì)細(xì)胞表面部分的直接連接的作用，所述細(xì)胞表面部分的直接連接可能導(dǎo)致直接的細(xì)胞死亡，諸如死亡受體如TRAIL Rl或TRAIL R2的連接，或整聯(lián)蛋白分子如α νβ3的連接等。癌癥藥物的臨床應(yīng)用基于所述藥物在對(duì)患者的可接受的危險(xiǎn)模式下的益處。在癌癥治療中，通常是在益處之后最追求生存，然而，除了延長(zhǎng)生命之外，還存在許多其它公認(rèn)的益處。這些其它的益處，其中治療沒(méi)有不利地影響生存，包括癥狀減輕，針對(duì)不利事件的保護(hù)，復(fù)發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)或沒(méi)有疾病的生存，并且延長(zhǎng)發(fā)展的時(shí)間。這些標(biāo)準(zhǔn)通常被接受，并且管理團(tuán)體如美國(guó)食品及藥品管理局(F.D.A.)核準(zhǔn)產(chǎn)生這些益處的藥物(Hirschfeld等.腫瘤學(xué) / 血液學(xué)的重要綜述(Critical Reviews in Oncology/Hematolgy) 42:137-143 2002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)之外，公認(rèn)還存在其它的可以預(yù)示這些類型的益處的終點(diǎn)(endpoint)。部分地，由美國(guó)F.D.A.授予的加速的核準(zhǔn)流程承認(rèn)存在可能預(yù)測(cè)患者益處的替代品。到2003年年末，在這種流程下已經(jīng)核準(zhǔn)了 16種藥物，并且這些中有4種已經(jīng)繼續(xù)獲得了完全的核準(zhǔn)，即，隨后的研究已經(jīng)表明由替代品終點(diǎn)預(yù)測(cè)的直接的患者益處。確定藥物在實(shí)體瘤中的作用的一個(gè)重要的終點(diǎn)是通過(guò)測(cè)量針對(duì)治療的響應(yīng)而評(píng)估腫瘤負(fù)荷(Therrasse等國(guó)家癌癥研究所雜志(Journal of the National CancerInstitute) 92 (3):205-2162000)。關(guān)于所述評(píng)估的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))已由癌癥國(guó)際專家組實(shí)體瘤工作組的響應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)公布。與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比較，對(duì)腫瘤負(fù)荷具有證明的作用的藥物，如由RECIST標(biāo)準(zhǔn)所述的目標(biāo)響應(yīng)所示,最終傾向于產(chǎn)生直接的患者益處。在臨床前設(shè)定中，腫瘤負(fù)荷通常更直接進(jìn)行評(píng)估和記錄。因?yàn)榕R床前研究可以轉(zhuǎn)換成臨床設(shè)定，在臨床前模型中產(chǎn)生延長(zhǎng)的生存的藥物具有最大的預(yù)測(cè)臨床用途。與產(chǎn)生針對(duì)臨床治療的積極響應(yīng)類似，在臨床前設(shè)定中減少腫瘤負(fù)荷的藥物還可能對(duì)疾病具有顯著的直接影響。盡管延長(zhǎng)生存是在癌癥藥物治療的臨床結(jié)果后最追求的，但是存在其它的益處，其具有臨床應(yīng)用，并且清楚 地，可能與疾病發(fā)展的延遲、延長(zhǎng)的生存或二者相關(guān)的腫瘤負(fù)荷減少還可以導(dǎo)致直接的益處和具有臨床影響(Eckhardt等.發(fā)展的治療學(xué):目標(biāo)化合物的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的成功與失敗(Developmental Therapeutics !Successes and Failures ofClinical Trial Designs of Targeted Compounds) ;ASC0 教育書，第 39 次年會(huì),2003,第209-219 頁(yè))。充分利用U.S.6，180，357的方法，在用來(lái)自患者肺腫瘤活檢組織的細(xì)胞和NC1-H460肺癌細(xì)胞系免疫小鼠后，獲得小鼠單克隆抗體，H460-16-2。H460-16-2抗原在來(lái)自不同組織來(lái)源的廣泛范圍的人細(xì)胞系的細(xì)胞表面上表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和皮膚癌細(xì)胞系A(chǔ)2058在體外易受H460-16-2的細(xì)胞毒性作用的影響。H460-16-2在培養(yǎng)物中針對(duì)MDA_MB_231細(xì)胞的細(xì)胞毒性的結(jié)果通過(guò)其在植入小鼠時(shí)針對(duì)這些癌細(xì)胞的抗腫瘤活性得到進(jìn)一步擴(kuò)展(如S.N.10/603, 000中公開地)。臨床前異種移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療功效的有效預(yù)測(cè)因子。
在人乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，H460-16-2處理比同種型對(duì)照抗體顯著(p
<0.0001)更有效地抑制處理過(guò)程中的腫瘤生長(zhǎng)。在處理期結(jié)束時(shí)，給藥H460-16-2的小鼠具有僅生長(zhǎng)到對(duì)照組的1.3%的腫瘤。在處理后的后續(xù)時(shí)期內(nèi)，H460-16-2的處理作用持續(xù)并且處理組中的平均腫瘤體積繼續(xù)顯著小于對(duì)照，直到測(cè)量期結(jié)束。利用存活率作為抗體功效的測(cè)量，評(píng)估了 H460-16-2處理組中的死亡風(fēng)險(xiǎn)在處理后70天時(shí)，為抗體緩沖液對(duì)照組的約71% (P = 0.028)。這些數(shù)據(jù)證明H460-16-2處理與對(duì)照處理組織相比，賦予存活益處。H460-16-2處理似乎是安全的，因?yàn)槠洳徽T導(dǎo)任何毒性跡象，包括減少的體重和臨床不適。因此，H460-16-2處理是有效的，因?yàn)槠湓诔浞执_定的人乳腺癌模型中，與對(duì)照處理組相比，延遲腫瘤生長(zhǎng)并提高存活率。另外，H460-16-2在確定的體內(nèi)腫瘤模型中證明了針對(duì)MDA_MB_231細(xì)胞的抗腫瘤活性(如S.N.10/603, 000公開地)。用H460-16-2的處理與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療藥物順鉬進(jìn)行相比較，且顯示出順鉬和H460-16-2處理組與用抗體稀釋緩沖液或同種型對(duì)照抗體處理的組相比,具有顯著(P < 0.001)更小的平均腫瘤體積。H460-16-2處理介導(dǎo)是順鉬化學(xué)療法的約2/3的腫瘤抑制，但是無(wú)顯著的(19.2% )體重減少(P < 0.003)和臨床不適，包括關(guān)于順鉬處理觀察到的2件與處理有關(guān)的死亡。H460-16-2的抗腫瘤活性及其最小毒性使其成為引人注目的抗癌治療劑。另外，在處理后的期間，H460-16-2顯示出顯著的存活益處(P <0.02)，因?yàn)樵谔幚砗?gt; 70天時(shí)，H460-16-2組中的死亡風(fēng)險(xiǎn)是同種型對(duì)照抗體組中的死亡風(fēng)險(xiǎn)的約一半。觀察到的存活益處在處理后持續(xù)超過(guò)120天，在那時(shí)，與H460-16-2處理組的67%相t匕，100%的同種型對(duì)照和順鉬處理的小鼠已經(jīng)死亡。H460-16-2通過(guò)與同種型對(duì)照抗體組相比延遲腫瘤生長(zhǎng)26%，來(lái)維持腫瘤抑制。在處理后31天時(shí)，H460-16-2通過(guò)與同種型對(duì)照組相比減少腫瘤生長(zhǎng)48%，來(lái)限制腫瘤尺寸，這與在處理結(jié)束時(shí)觀察到的49%的減少相當(dāng)。在確定的乳腺癌腫瘤模型中，這些結(jié)果說(shuō)明了 H460-16-2超過(guò)處理期維持腫瘤抑制的潛力，并證明了該抗體在哺乳動(dòng)物中減少腫瘤負(fù)擔(dān)和提高存活率的能力。除在確定的乳腺癌體內(nèi)腫瘤模型中的有益`作用外，H460-16-2處理與化學(xué)療法藥物(順鉬)的組合在確定的體內(nèi)前列腺癌模型中具有針對(duì)PC-3細(xì)胞的抗腫瘤活性(如S.N.10/810, 165中公開地)。利用配對(duì)t_檢驗(yàn)，H460-16-2加順鉬處理在處理期后立即比緩沖液對(duì)照(P < 0.0001)、單獨(dú)的順鉬處理(P = 0.004)或單獨(dú)的H460-16-2處理(p
<0.0001)顯著更有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。在處理期結(jié)束時(shí)，給藥H460-16-2加順鉬的小鼠具有僅生長(zhǎng)至緩沖液對(duì)照組的28.5%的腫瘤。對(duì)于PC-3SCID異種移植模型，體重可以用作疾病進(jìn)展的替代指示物。所有組中的小鼠都經(jīng)歷了嚴(yán)重體重減輕。在該研究中，所有組中的小鼠在處理期結(jié)束時(shí)都顯示出約23-35%的體重減輕。用H460-16-2處理的組表現(xiàn)出最小程度的體重減輕(21.7% )0處理后，第48天，與緩沖液對(duì)照相比，不存在與H460-16-2和順鉬處理有關(guān)的體重減輕的顯著增加(P = 0.5042)。因此，在充分確定的人前列腺癌模型中，H460-16-2加順鉬處理是有效的，因?yàn)槠渑c同種型對(duì)照處理組相比延遲了腫瘤生長(zhǎng)。
為了確認(rèn)H460-16-2表位作為藥物靶標(biāo)，先前確定了 Η460_16_2抗原在正常人組織中的表達(dá)(S.N.10/603, 000) 0該工作通過(guò)比較抗CD44抗體；克隆L178(在S.N.10/647，818，現(xiàn)在的美國(guó)專利7，189，397中公開)和克隆BU75 (在S.N.10/810，165中公開)得到擴(kuò)展。通過(guò)用H460-16-2染色I(xiàn)HC，大部分組織未能表達(dá)H460-16-2抗原，包括生命器官諸如肝、腎(除管狀上皮細(xì)胞的邊緣染色外)、心臟、和肺的細(xì)胞。來(lái)自組織染色的結(jié)果說(shuō)明H460-16-2顯示出與多種細(xì)胞類型的有限結(jié)合，但是具有與浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、和成纖維細(xì)胞的結(jié)合。BU75抗體顯示出類似的染色模型。然而，存在至少一種值得注意的差別；與H460-16-2相比，BU75染色淋巴細(xì)胞更強(qiáng)烈。定位H460-16-2抗原和確定其在人群中，諸如乳腺癌患者中的普遍性，對(duì)于評(píng)估H460-16-2的治療應(yīng)用和設(shè)計(jì)有效的臨床實(shí)驗(yàn)非常重要。為了解決H460-16-2抗原在來(lái)自癌癥患者的乳腺腫瘤中的表達(dá)，先前對(duì)來(lái)自50名個(gè)體乳腺癌患者的腫瘤組織樣品進(jìn)行篩選H460-16-2抗原的表達(dá)(S.N.10/603, 000)并與L178(S.N.10/647，818，現(xiàn)在的美國(guó)專利7，189，397)，BU75 (S.N.10/810，165)和抗 Her2 抗體 c-erbB-2 (S.N.10/810，165)比較。這些研究的結(jié)果是類似的且顯示出62%組織樣品關(guān)于H460-16-2抗原陽(yáng)性染色，而73%的乳腺腫瘤組織關(guān)于BU75表位是陽(yáng)性。H460-16-2在患者樣品內(nèi)的表達(dá)似乎特異于癌癥細(xì)胞，因?yàn)槿旧窒抻趷盒阅[瘤細(xì)胞。H460-16-2染色來(lái)自乳腺癌患者的10份正常組織樣品中4份，而BU75染色8份。H460-16-2和BU75抗原的乳腺腫瘤表達(dá)似乎主要位于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，這使得⑶44成為引人注目的治療靶標(biāo)。H460-16-2表達(dá)進(jìn)一步基于激素雌激素和孕酮受體的乳腺腫瘤表達(dá)來(lái)評(píng)估，其在乳腺腫瘤的發(fā)育、治療和預(yù)后中扮演重要角色。在H460-16-2抗原表達(dá)和雌激素或孕酮受體表達(dá)之間相關(guān)性不明顯。當(dāng)基于其階段或癌癥進(jìn)展的程度分析腫瘤時(shí)，H460-16-2抗原表達(dá)和腫瘤期之間同樣不存在明顯的相關(guān)性。關(guān)于BU75獲得類似的結(jié)果。在與c-erbB-2的比較中，H460-16-2表現(xiàn)出完全不同的染色特征，其中52%的關(guān)于H460-16-2抗原陽(yáng)性的乳腺腫瘤組織樣品關(guān)于Her2表達(dá)是陰性的，這說(shuō)明尚未滿足關(guān)于乳腺癌患者的靶向治療需要。關(guān)于H460-16-2和Her2 二者都是陽(yáng)性的乳腺腫瘤組織切片之間也存在染色強(qiáng)度的差別。c-erbB-2抗體也陽(yáng)性染色正常乳腺組織切片之一。進(jìn)一步定位H460-16-2抗原和確定其在人群中，諸如前列腺癌患者中的普遍性，公開在S.N.11/364，013中。抗體與53份人前列腺腫瘤和3份正常前列腺組織的結(jié)合利用人前列腺正常和腫瘤組織微陣列(Imgenex，圣地亞哥，CA)進(jìn)行。如S.N.11/364,013中公開地，19/53(36% )的接受 測(cè)試腫瘤關(guān)于H460-16-2是陽(yáng)性的。H460-16-2特異于腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞。細(xì)胞定位主要在膜和細(xì)胞質(zhì)膜，具有或不具有內(nèi)腔定位。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比在< 10% - > 50%范圍內(nèi)，這說(shuō)明該抗體與腫瘤細(xì)胞的異源結(jié)合。不能適當(dāng)?shù)卦u(píng)估抗體結(jié)合與腫瘤期的關(guān)系，這歸因于不同腫瘤期中腫瘤數(shù)量的差異，即腫瘤I，II，III和 IV 期分別為 1/1(100% ),4/12(33% ),0/2(0% )和 11/33(33% )。對(duì) Gleason 分?jǐn)?shù)G3-G4(36%)存在比對(duì)Gl-G2(25%)更高度的結(jié)合。全部3份正常前列腺組織切片對(duì)該抗體是陽(yáng)性的。然而，組織特異性是關(guān)于肌上皮和基質(zhì)成纖維細(xì)胞的并且提供(spared)給腺上皮。存在H460-16-2與測(cè)試前列腺腫瘤結(jié)合的不均勻性:10/53，6/53，3/53陽(yáng)性腫瘤分別在< 10-10%，< 50-50%和>50%分類中。作為其與前列腺癌細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果，H460-16-2的治療益處可以潛在地?cái)U(kuò)展到治療前列腺癌。進(jìn)一步定位H460-16-2抗原和確定其在人群，諸如肝癌患者中的普遍性，公開在S.N.11/364，013 中。H460-16-2 抗體顯示出與 21/49 (43 % )的測(cè)試肝癌，包括 11/37 (30 % )原發(fā)性，7/8 (88% )轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌，1/2(50% )原發(fā)性和2/2(100% )轉(zhuǎn)移性膽管癌的結(jié)合。該抗體表現(xiàn)出與早期I和II期相比更顯著高度結(jié)合于晚期腫瘤III和IV期(P =0.03) [I 期，0/2 (O % ) ；II 期，2/17 (12 % ) ；III 期，8/16 (50 % )和 IV 期，6/8 (75 % )] H460-16-2特異于腫瘤細(xì)胞和浸潤(rùn)炎性細(xì)胞。細(xì)胞定位主要在膜。一些腫瘤還展現(xiàn)出擴(kuò)散性細(xì)胞質(zhì)染色模式。該抗體結(jié)合9/9的非腫瘤肝組織。然而，結(jié)合局限于竇狀細(xì)胞和浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。H460-16-2抗原似乎特異性表達(dá)在晚期肝腫瘤組織上。H460-16-2因此具有作為肝癌治療中的治療藥物的潛力。為了進(jìn)一步擴(kuò)展H460-16-2的潛在治療益處，先前還確定了該抗原在多種人癌組織中的頻率和定位(S.N.10/603，000)并與克隆L178相比較(S.N.10/647，818，現(xiàn)在的美國(guó)專利7，189，397)。這些腫瘤類型中的大部分關(guān)于L178抗原也是陽(yáng)性的。如關(guān)于人乳腺腫瘤組織，H460-16-2和L178定位發(fā)生在腫瘤細(xì)胞的膜上。然而，與H460-16-2抗體相比，關(guān)于L178存在充分更多的膜定位。而且，在用H460-16-2和L178 二者染色的腫瘤類型中，43%的組織顯示出關(guān)于L178抗體的更高強(qiáng)度的染色。基于與來(lái)自文獻(xiàn)中的IHC數(shù)據(jù)相比較，似乎不存在嚴(yán)格匹配本文中存在的IHC數(shù)據(jù)的⑶44形式。⑶44的標(biāo)準(zhǔn)形式通常表達(dá)在人腦內(nèi)；H460-16-2抗原卻不然。針對(duì)pan-CD44同種型的抗體不染色肝(包括Kuppfer細(xì)胞)并在生殖周期的所有階段陽(yáng)性染色子宮內(nèi)膜腺體。H460-16-2抗原清楚地存在于Kuppfer細(xì)胞上并僅存在于生殖周期的分泌性子宮內(nèi)膜腺體上。H460-16-2抗原清楚地存在于組織巨噬細(xì)胞上且只有變體形式V4/5和V8/9顯示出偶然的巨噬細(xì)胞染色。與抗⑶44L178和現(xiàn)在的BU75相比，對(duì)H460-16-2觀察到的類似但不同的結(jié)合模式說(shuō)明H460-16-2抗原是CD44的獨(dú)特表位。如先前公開地(S.N.10/647，818，現(xiàn)在的美國(guó)專利7，189，397)，另外的生物化學(xué)數(shù)據(jù)還說(shuō)明由H460-16-2識(shí)別的抗原是一種形式的⑶44。這得到這樣的研究的支持，所述研究顯示針對(duì)⑶44反應(yīng)的單克隆抗體(L178)通過(guò)免疫沉淀識(shí)別與H460-16-2結(jié)合的蛋白。Western印跡研究還提示由H460-16-2識(shí)別的⑶44表位不存在于v6或vlO上。H460-16-2表位還以碳水化合物和構(gòu)象依賴性作為特征，而許多抗CD44抗體針對(duì)CD44的肽部分。這些IHC和生物化學(xué)結(jié)果證明H460-16-2結(jié)合⑶44抗原的變體。因此，占優(yōu)勢(shì)的證據(jù)顯示H460-16-2通過(guò)連接⑶44變體上存在的獨(dú)特碳水化合物依賴性構(gòu)象表位而介導(dǎo)抗癌作用。為了本發(fā)明的目的，所述表位定義為“CD44的抗原性部分”，其特征在于其結(jié)合由雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2編碼的單克降抗體，其抗原性結(jié)合片段，其抗原性結(jié)合配體或其抗體綴合物的能力。為了進(jìn)一步說(shuō)明H460-16- 2抗癌作用背后的機(jī)制，進(jìn)行了透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合測(cè)定(如S.N.10/810, 165中所公開地)。確定了以50%抑制MDA-MB-231細(xì)胞與HA附著需要平均濃度為1.87(+/-1.01)微克/ml的H460-16-2。這些結(jié)果說(shuō)明H460-16-2與，至少部分地，⑶44上負(fù)責(zé)結(jié)合HA的區(qū)域相互作用并因此可以通過(guò)下調(diào)血管發(fā)生或腫瘤侵入ECM而介導(dǎo)其抗癌作用。除HA結(jié)合測(cè)定外，進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，以確定H460-16-2的體外和體內(nèi)抗癌作用是否歸因于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)(如S.N.10/810, 165中公開地)。24小時(shí)和使用20微克/mLH460-16-2后，與同種型對(duì)照相比，MDA-MB-231凋亡細(xì)胞的數(shù)量增多。該作用還似乎是劑量依賴性的。因此，H460-16-2的功效還可以歸因于，全部或部分地，其凋亡誘導(dǎo)能力。為了進(jìn)一步說(shuō)明H460-16-2作用的機(jī)制，當(dāng)乳腺癌異種移植模型中體內(nèi)生長(zhǎng)的MDA-MB-231 腫瘤凋亡時(shí)，進(jìn)行 H460-16-2 處理(如 S.N.11/364，013 中公開地)。ApoTag染色的腫瘤的連續(xù)切片隨后進(jìn)行H & E染色并且利用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)諸如單細(xì)胞缺失、細(xì)胞收縮和染色質(zhì)壓縮為密質(zhì)(dense mass)來(lái)檢測(cè)這些的凋亡細(xì)胞。如以上部分所述進(jìn)行達(dá)到這些標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞的計(jì)數(shù)，以提供處理組的平均計(jì)數(shù)。緩沖液對(duì)照組產(chǎn)生平均總分17個(gè)細(xì)胞(±5.29);而H460-16-2處理組產(chǎn)生平均總分22.5個(gè)細(xì)胞(±4.201)。因此，如利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)所確定地，存在使用H460-16-2處理增加凋亡的趨勢(shì)。為了促進(jìn)抗體嵌合物的產(chǎn)生，分別克隆和測(cè)序編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因(如S.N.11/364，013中公開地)。然后構(gòu)建和表達(dá)人IgGl和IgG2同種型的H460-16-2嵌合輕鏈和重鏈(如S.N.11/364，013中公開地)。為了確定嵌合對(duì)比鼠抗體的相對(duì)功效，進(jìn)行人乳腺癌的體內(nèi)模型(如
S.N.11/364，013 中公開地)。鼠 H460-16-2 和(ch) ARH460-16-2_IgGl 在確立的(established)人乳腺癌MDA_MB_231體內(nèi)模型中減少腫瘤生長(zhǎng)。在第62天，即施用最后的劑量后5天時(shí)，使用H460-16-2處理導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制39% (平均T/C = 57% )。該腫瘤生長(zhǎng)的減少顯著區(qū)別于對(duì)照(P = 0.0037)。嵌合抗體(ch)ARH460-16-2-1gGl導(dǎo)致增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)抑制64% (平均T/C = 26.9% ;p < 0.0001)。相反，嵌合抗體的IgG2形式，(ch)ARH460-16-2-1gG2與緩沖液對(duì)照相比，沒(méi)有顯示出腫瘤生長(zhǎng)抑制(腫瘤生長(zhǎng)抑制=0%;平均T/C = 122% ；p = 0.7264)。貫 穿研究過(guò)程不存在毒性臨床跡象。總之，在MDA-MB-231乳腺癌模型中，(ch)ARH460-16-2-1gGl證明了與鼠抗體相比相同或更高的功效。先前進(jìn)行了膜聯(lián)蛋白-V染色(如S.N.11/364，013中公開地)，以確定H460-16-2的嵌合形式是否能夠以與MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系上的鼠負(fù)體相同的方式誘導(dǎo)凋亡。所有3種抗體顯示出壞死和壞死/凋亡總數(shù)對(duì)比其預(yù)期同種型對(duì)照百分比的劑量依賴性增力口。關(guān)于(ch)ARH460-16-2-1gG2，然后(ch) ARH460-16-2_IgGl 和然后 H460-16-2 觀察到壞死和壞死/凋亡總數(shù)百分比的最大增加。總之，該數(shù)據(jù)證明H460-16-2抗原是癌癥相關(guān)的抗原并表達(dá)在人中，且是病理學(xué)相關(guān)癌癥靶標(biāo)。此外，該數(shù)據(jù)還證明H460-16-2抗體與人癌癥組織的結(jié)合，并且可以合適地用于診斷、療法預(yù)測(cè)、或預(yù)后測(cè)定。另外，該抗原的細(xì)胞膜定位是細(xì)胞癌癥狀態(tài)的指示，這是因?yàn)榇蟛糠址菒盒阅[瘤細(xì)胞中缺乏抗原的表達(dá)，且該觀察結(jié)果允許該抗原，其基因或衍生物，其蛋白質(zhì)或其變體用于可以是診斷、療法預(yù)測(cè)、或預(yù)后測(cè)定的應(yīng)用。其他研究，包括抗⑶44抗體的應(yīng)用，具有不是由H460-16-2表現(xiàn)出的治療潛力的局限性。H460-16-2證明了體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。先前描述的抗體諸如MAK〈CD44>M-1.1.12，MAK〈CD44>M_2 .423 和 MAK〈CD44>M_4.3.16 不具有歸于它們的體外或體內(nèi)細(xì)胞毒性，且VFF-18和Mab U36不顯示固有的腫瘤細(xì)胞毒性。另外，其他表現(xiàn)出了體內(nèi)腫瘤作用的抗⑶44抗體也具有某些對(duì)于H460-16-2不明顯的局限性。例如，ASML1.1，K926，抗CD44和頂_78.1顯示出針對(duì)分別在異種移植模型中生長(zhǎng)的大鼠、鼠科、大鼠和鼠科腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤活性。H460-16-2在人癌癥模型中證明了抗腫瘤活性。H460-16-2還針對(duì)人⑶44，而抗體諸如ASML1.1僅識(shí)別大鼠⑶44。克隆515抗⑶44抗體的確抑制人卵巢細(xì)胞系的腹膜腫瘤植入但不阻止或抑制腫瘤生長(zhǎng)。H460-16-2能夠在SCID小鼠異種移植模型中抑制人乳腺腫瘤生長(zhǎng)。GKW.A3是抗人CD44單克隆抗體，其能夠抑制在小鼠中生長(zhǎng)的人轉(zhuǎn)移性黑素瘤在預(yù)防性而非確立的模型中的腫瘤生長(zhǎng)。H460-16-2證明了在人乳腺癌的預(yù)防性和確立的鼠異種移植模型中的顯著抗腫瘤活性。因此，非常明顯地，與先前描述的抗⑶44抗體相比，H460-16-2具有較高的抗腫瘤特性。證明了在SCID小鼠中對(duì)人乳腺腫瘤的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性和針對(duì)人CD44。還顯示了在人乳腺癌的預(yù)防性和確立的(更臨床相關(guān)的)模型中的活性且顯示了在人前列腺癌的確立的模型中使用順鉬的活性。本發(fā)明描述H460-16-2，其相應(yīng)的嵌合抗體，(ch)ARH460-16-2_IgGl和(ch)ARH460-16-2 (VKOVHO)，其相應(yīng)的人源化抗體變體(hu) ARH460-16-2的開發(fā)和應(yīng)用。H460-16-2通過(guò)其在患有癌性疾病的哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞毒性測(cè)定，腫瘤生長(zhǎng)模型和在延長(zhǎng)存活時(shí)間中的作用確定。本發(fā)明描述癌癥治療領(lǐng)域中的進(jìn)步，其中首次描述了特異性結(jié)合靶分子，CD44上存在的表位的試劑，所述試劑且還作為裸抗體，具有針對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性特性，且還作為裸抗體，在人癌癥體內(nèi)模型中直接介導(dǎo)抑制腫瘤生長(zhǎng)和存活延長(zhǎng)。這與任何其他先前所述的抗CD44抗體相比是一個(gè)進(jìn)步，因?yàn)樯袥](méi)有一個(gè)顯示出具有類似的特性。其還在該領(lǐng)域中提供進(jìn)步，因?yàn)槠淝宄厥状巫C明了 CD44直接參與與某些類型腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)的事件。還代表了癌癥治療中的進(jìn)步，因?yàn)槠渚哂性谌嘶颊咧姓宫F(xiàn)類似抗癌特性的潛力。另外的進(jìn)步是將這些抗體包括在抗癌抗體文庫(kù)中應(yīng)該通過(guò)確定不同抗癌抗體的適當(dāng)組合提高靶向表達(dá)不同抗原標(biāo)記的腫瘤的可能性，從而發(fā)現(xiàn)最有效地靶向和抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)育。總之，本發(fā)明教導(dǎo)了 H460-16-2抗原作為治療劑靶標(biāo)的應(yīng)用，即在施用時(shí)，可以減小哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，且還可以導(dǎo)致受處理的哺乳動(dòng)物延長(zhǎng)的存活。本發(fā)明還教導(dǎo) CDMABs (H460-16-2，(ch) ARH460-16-2_IgGl，(ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)和變體(hu)ARH460-16-2)，以及它們的衍生物、及其抗原結(jié)合片段、和其誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的配體的應(yīng)用，其靶向它們的抗原，以減少在哺乳動(dòng)物中表達(dá)所述抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷并導(dǎo)致受治療哺乳動(dòng)物延長(zhǎng)的存活。此外，本發(fā)明還教導(dǎo)在癌性細(xì)胞中檢測(cè)H460-16-2抗原的應(yīng)用，所述應(yīng)用可以有效用于攜帶表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的診斷、治療預(yù)測(cè)、和預(yù)后。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是利用制備針對(duì)來(lái)源于特定個(gè)體的癌性細(xì)胞或一種或多種特定的癌癥細(xì)胞系產(chǎn) 生的減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)的方法，以分離雜交瘤細(xì)胞系，和所述雜交瘤細(xì)胞系編碼的相對(duì)應(yīng)的分離的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，所述CDMAB對(duì)于癌癥細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，但是同時(shí)對(duì)于非癌性細(xì)胞相對(duì)是無(wú)毒的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是教導(dǎo)減輕癌性疾病的抗體，其配體和抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒作用介導(dǎo)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性通過(guò)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用介導(dǎo)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性是它們催化細(xì)胞的化學(xué)鍵水解的能力的函數(shù)(function)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，所述抗體有效用于癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的結(jié)合測(cè)定。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)下述描述變得清楚，其中通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)施例的方式描述本發(fā)明的某些實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)述
本專利或申請(qǐng)文件包含至少一幅彩色繪制的附圖。本專利或?qū)＠暾?qǐng)出版物帶有彩色附圖的復(fù)印件將根據(jù)要求和繳付必要的費(fèi)用由官方提供。

圖1證明在確立的人乳腺M(fèi)DA-MB-468癌模型中Η460_16_2對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。垂直虛線表示腹膜內(nèi)施用抗體的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/-SEM。圖2證明在確立的MDA-MB-468乳腺癌模型中Η460-16-2對(duì)小鼠體重的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/-SEM。圖3證明在確立的人PC-3前列腺癌模型中Η460-16-2對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。垂直虛線表示腹膜內(nèi)施用抗體的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/-SEM。圖4證明在確立的PC-3前列腺癌模型中Η460-16-2對(duì)小鼠體重的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/-SEM。圖5證明在確立的人乳腺(MDA-MB-231)癌模型中(ch) ARH460-16-2_IgGl以劑量依賴性方式對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。垂直虛線表示腹膜內(nèi)施用抗體的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/-SEM。圖6證明在確立的MDA-MB-231乳腺癌模型中(ch) ARH460-16-2_IgGl對(duì)小鼠體重的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/-SEM。

圖7是H460-16-2結(jié)合人結(jié)腸腫瘤組織微陣列的概述。圖8.使用H460-16-2 (A)或同種型對(duì)照抗體(B)獲得的結(jié)腸腫瘤組織上的結(jié)合模式的代表性顯微圖。放大倍數(shù)是200倍。圖9是(ch)ARH460-16-2-1gGl結(jié)合人和獼猴組織微陣列的概述，其中
圖例:PNJN:多形核細(xì)胞；Lym:淋巴細(xì)胞；Mono:單核細(xì)胞；ND:未確定- My: rnLi^Ltes;此9: 民嗤細(xì)胞；Mee:巨核細(xì)胞；Ery:紅細(xì)胞；N:祌經(jīng)元； nuc: 胞核二龍:日質(zhì)；Ep1:上皮；Gan nuc:祌蘊(yùn)節(jié)nuc:神經(jīng)令細(xì)胞核.! ΚΙΗΙ有色上皮；5C1:遠(yuǎn)回P管；服:近回旋核；Glom nuc:
Resp: p吸；Oo:卵母卻辦；Cytos細(xì)胞質(zhì)；Ecc:外分泌汗腺；
Seb:皮Ife膽；Endo:內(nèi)皮:Spermato:輪感細(xì)胞。圖10.在人脾(白髓)(A)和獼猴脾(白髓)(B)上使用(ch)ARH460-16-2-1gGl的結(jié)合模式的代表性顯微圖。觀察關(guān)于這兩種物種的染色。放大倍數(shù)是40倍。圖11.用不同初級(jí)抗體溶液探測(cè)的500微克MDA-MB-231膜蛋白的Western印跡。泳道1-5使用分別與2微克/mL，10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化H460-16-2混合的生物素化H460-16-2探測(cè)。泳道6_10使用分別與2微克/mL, 10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化AR37A335.8混合的生物素化H460-16-2探測(cè)。泳道11-15使用分別與2微克/mL, 10微克/mL, 100微克/mL, 500微克/mL或1000微克/mL非生物素化1B7.11混合的生物素化H460-16-2探測(cè)。圖12.用不同初級(jí)抗體溶液探測(cè)的500微克MDA-MB-231膜蛋白的Western印跡。泳道1-5使用分別與2微克/mL，10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化H460-16-2混合的生物素化AR37A335.8探測(cè)。泳道6_10使用分別與2微克/mL, 10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化AR37A335.8混合的生物素化AR37A335.8探測(cè)。泳道11-15使用分別與2微克/mL, 10微克/mL, 100微克/mL, 500微克/mL或1000微克/mL非生物素化8B1B.1混合的生物素化AR37A335.8探測(cè)。
圖13.AR37A335.8的結(jié)合親和性。通過(guò)表面等離振子共振評(píng)估該抗體與純化的重組人⑶44的結(jié)合的解離常數(shù)。圖14.RTK列表，所述RTK的磷酸化受到用(ch) ARH460-16-2_IgGl處理MDA-MB-231細(xì)胞以及隨后進(jìn)行血清和增補(bǔ)劑刺激的影響。圖15.輕鏈PCR擴(kuò)增中使用的引物(按出現(xiàn)的順序分別為SEQ ID NOS:10-28)。圖16.重鏈PCR擴(kuò)增中使用的引物(按出現(xiàn)的順序分別為SEQ ID NOS:29-44)。圖17.小鼠 H460-16-2VH 序列(SEQ ID NO:45)。圖18.小鼠 H460-16-2 VL 序列(SEQ ID NO:46)。圖19.用于產(chǎn)生嵌合的和變體人源化H460-16-2 VH序列的寡核苷酸(按出現(xiàn)的順序分別為 SEQ ID NOS :47-58)。圖20.用于產(chǎn)生嵌合的和變體人源化H460-16-2 VL序列的寡核苷酸(按出現(xiàn)的順序分別為 SEQ ID NOS:59-68)。圖21.ρΑΝΤ18 表達(dá)載體。圖22.人源化H460-16-2VH變體(按出現(xiàn)的順序分別為SEQ ID NOS:7和9)。在CDRs下劃線。圖23.人源化 H460-16-2VL 變體(SEQ ID NO:8)。在 CDRs 下劃線。圖24.關(guān)于H460-16-2的嵌合和人源化變體的結(jié)合數(shù)據(jù)。圖25.鼠 H460-16-2，及其人源化變體，(hu) ARH460-16-2 變體 HV1/KV1 和(hu)ARH460-16-2變體HV2/KV1的結(jié)合親和性。通過(guò)表面等離振子共振評(píng)估該抗體與純化的重組人⑶44的結(jié)合的解離常數(shù)。發(fā)明詳述一般地，當(dāng)用于概述、描述、實(shí)施例和權(quán)利要求中時(shí)，下述詞語(yǔ)或短語(yǔ)具有所示的定義。術(shù)語(yǔ)“抗體”以最寬泛的意義使用，并且特別涵蓋，例如，單一的單克隆抗體(包括激動(dòng)劑、拮抗劑、和中和抗體、去免疫的(de-1mmunized)、鼠、嵌合的或人源化的抗體)，具有多表位特異性的抗體組合物，單鏈抗體，雙抗體，三鏈抗體，免疫綴合物和抗體片段(見(jiàn)下文)。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)“單克降抗體”是指從一群基本上均一的抗體獲得的抗體，即，除了可能以較少量存在的天然存在的突變之外，構(gòu)成(comprising)所述群體的個(gè)體抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一的抗原性位點(diǎn)。此外，多克隆抗體制劑包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體，與所述多克隆抗體制劑相反，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性，因?yàn)閱慰寺】贵w可以不被其它抗體污染地合成，所以單克隆抗體是有利的。修飾詞“單克隆”表示該抗體的特征是從基本上均一的抗體群體獲得，并且不被解釋為抗體的生產(chǎn)需要通過(guò)任何特定的方法。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)由Kohler等，自然(Nature), 256:495(1975)首先描述的雜交瘤(鼠或人)方法制備，或可以通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4，816，567)制備。“單克隆抗體”還可以從曬菌體抗體文庫(kù)分離，例如，使用Clackson等，自然(Nature), 352:624-628(1991)和 Marks 等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，222:581-597 (1991)中所述的技術(shù)。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地包括其抗原-結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括小于全長(zhǎng)的抗體，F(xiàn)ab, Fab’，F(xiàn)(ab’)2，和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。“完整的”抗體是一種包括抗原-結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CJ和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域Ch1、Ch2和Cg3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。取決于它們的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體可以指定為不同的“種類”。存在5種主要類別的完整抗體:IgA，IgD, IgE, IgGjP IgM，并且它們中的一些可以進(jìn)一步分成“亞類”(同種型)，例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA,IgA2。與不同種類的抗體相對(duì)應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別叫作α，δ，ε，Υ，和μ。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。抗體“效應(yīng)子功能”是指歸因于抗體的Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))的那些生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fe受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)，等。“抗體依賴性細(xì)胞 介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fe受體(FcRs)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷(NK)細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識(shí)別在靶細(xì)胞上的結(jié)合的抗體，并且隨后引起該靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，即NK細(xì)胞，僅表達(dá)Fe Y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fe Y RI，F(xiàn)e Y RII和Fe Y RIII。FcR在造血細(xì)胞上的表達(dá)總結(jié)在Ravetch和Kinet,免疫學(xué)年度綜述(Annu.Rev.1mmunol) 9:457-92(1991)的第464頁(yè)表3中。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測(cè)定，諸如在美國(guó)專利號(hào)5，500，362或5，821，337中所述的測(cè)定。對(duì)于所述測(cè)定有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)進(jìn)行評(píng)估，例如，在動(dòng)物模型中，諸如在Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型中。“效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcRs并且執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞至少表達(dá)Fe Y RIII并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)，天然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；其中PBMCs和NK細(xì)胞是優(yōu)選的。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來(lái)源分離，例如，從血液或PBMCs分離，如本發(fā)明所述。術(shù)語(yǔ)“Fe受體”或“FcR”用來(lái)描述結(jié)合抗體的Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然人FcR序列。此外，優(yōu)選的FcR是一種結(jié)合IgG抗體的FcR (Y受體)，并且包括Fe Y RI，F(xiàn)e YRII，和FcyRIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的可變剪接形式。FcyRII受體包括Fe Y RIIA ( “激活受體”)Fe y RIIB ( “抑制受體”)，它們具有主要在它們的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同的相似的氨基酸序列。激活受體Fe Y RIIA在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見(jiàn)在Μ.[) οη，免疫學(xué)年度綜述(Annu.Rev.1mmunol) 15:203-234 (1997)中的綜述)。FcRs 在 Ravetch和 Kinet,免疫學(xué)年度綜述(Annu.Rev.Tmmunol)9:457-92 (1991) ；Capel 等，免疫學(xué)方法(Immunomethods)4:25-34(1994)；和de Haas等，實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志(J.Lab Clin.Med.) 126:330-41 (1995)中綜述。其它FcRs，包括將在將來(lái)鑒定的那些，包含在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“FcR”中。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn,其負(fù)責(zé)將母親的IgGs轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒(Guyer等,免疫學(xué)雜志(J.1mmunol.) 117:587 (1976)和 Kim 等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.1mmunol.) 24:2429 (1994))。“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”是指在存在補(bǔ)體的條件下分子裂解靶點(diǎn)的能力。補(bǔ)體激活途徑通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)同與同源抗原復(fù)合的分子(例如，抗體)的結(jié)合而起始。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行⑶C測(cè)定,例如,如在Gazzano-Santoro等,免疫學(xué)方法雜志(J.1mmunol.Methods) 202:163(1996)中所述。術(shù)語(yǔ)“可變”是指這樣的事實(shí)，S卩，在抗體之間，某些可變結(jié)構(gòu)域的部分在序列上大量不同，并且其用于每種特定的抗體對(duì)于其特定的抗原的結(jié)合和特異性。然而，在抗體的整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中可變性不是均勻分布的。它集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)稱為高變區(qū)的三個(gè)片段中。可變結(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FRs)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域分別包括4個(gè)FRs，其主要采取β -折疊構(gòu)型，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)連接，其形成環(huán)連接，并且在某些情形中形成β_折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FRs緊密相鄰保持在一起，并且與另一條鏈的高變區(qū)一起有助于形成抗體的抗原-結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)Kabat等，免疫學(xué)興趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5 版.公共衛(wèi)生服務(wù)(Public Health Service),全國(guó)衛(wèi)生研究所(National Institutesof Health), Bethesda, Md.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合,但是表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，諸如在抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)中的抗體參與。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指抗體負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包括來(lái)自“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基(例如，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34 (LI)，50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35 (Hl)，50-65 (H2)和 95-102 (H3) ;Kabat 等，免疫學(xué)興趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第 5版.公共衛(wèi)生服務(wù)(Public Health Service),全國(guó)衛(wèi)生研究所(National Instit utes of Health), Bethesda, Md.(1991))和 / 或來(lái)自“高變環(huán)”的那些殘基(例如，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32 (LI)，50-52 (L2)和91-96 (L3)和在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32 (HI), 53-55 (H2)和96-101 (H3) ;Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.) 196:901-917(1987))。“構(gòu)架區(qū)”或“FR”殘基是除了如本文所定義的所述高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩種相同的抗原-結(jié)合片段，其稱為“Fab”片段，每個(gè)具有單個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)，和剩余的“Fe”片段，它的名稱反應(yīng)了它容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab’)2片段，其具有兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)，并且仍然能夠交聯(lián)抗原。“Fv”是包含完整的抗原-識(shí)別和抗原-結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價(jià)締合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)型中每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用，以限定在乂^'二聚體表面上的抗原-結(jié)合位點(diǎn)。籠統(tǒng)地，6個(gè)高變區(qū)賦予抗體的抗原-結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包括對(duì)抗原特異的3個(gè)高變區(qū)的Fv的一半)具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管是以比完整的結(jié)合位點(diǎn)低的親和力結(jié)合。Fab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHI)。Fab’片段不同于Fab片段，其通過(guò)在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端添加幾個(gè)殘基而不同，所述添加的殘基包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH在本發(fā)明中是Fab’的名稱，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離的巰基(thiol)基團(tuán)。？(&13’)2抗體片段最初作為一對(duì)Fab’片段產(chǎn)生，其在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。基于它們的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的“輕鏈”可以被指定為兩種明顯不同的類型中的一種，所述兩種明顯不同的類型稱為Kappa(K)和lambda (λ)。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的V1^Pt結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一的多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包括在V1^P'結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，其使得scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的理想結(jié)構(gòu)。對(duì)于scFv的綜述,參見(jiàn)Pliickthun,在單克隆抗體的藥理學(xué)(The Pharmacology of Monoclonal 抗體)中，卷 113, Rosenburg 和 Moore 編，SpringerVerlag,紐約，第 269-315 頁(yè)(1994)。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”是指具有兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段包括與在同一多肽鏈(Vh-VJ中的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域連接的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(Vh)。通過(guò)使用太短而不允許在同一條鏈中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間成對(duì)的連接體，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域成對(duì)，并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)。例如，在EP404，097 ；W093/11161 ;和Hollinger 等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA),90:6444-6448(1993)中更充分地描述了雙抗體。術(shù)語(yǔ)“三鏈抗體”或“三價(jià)三聚體”指三個(gè)單鏈抗體的組合。用 '或Vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸末端，即不具有任何連接體序列，構(gòu)建三鏈抗體。三鏈抗體具有三個(gè)Fv頭部，所述Fv頭部具有以頭-尾的方式環(huán)形排列的多肽。所述三鏈抗體可能的構(gòu)象是具有三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的平面，所述結(jié)合位點(diǎn)位于彼此相差120度角的平面上。三鏈抗體可以是單特異性、雙特異性或三特異性的。 “分離的”抗體是一種已經(jīng)被鑒定并且與其天然環(huán)境的成分分離和/或從中回收的抗體。它的天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。因?yàn)閷⒉淮嬖诳贵w天然環(huán)境的至少一種成分，分離的抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)原位的抗體。然而，一般地，分離的抗體應(yīng)該通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。與目的抗原，例如CD44抗原“結(jié)合”的抗體是一種能夠以充足的親和力結(jié)合所述抗原的抗體，以便所述抗體通過(guò)靶向表達(dá)所述抗原的細(xì)胞而有效用作治療或診斷劑。在所述抗體是一種結(jié)合CD44的抗體的情形中，與其它受體相反，它通常優(yōu)先結(jié)合CD44，并且不包括偶然發(fā)生的結(jié)合，如非特異性Fe接觸，或不包括與其它抗原所常見(jiàn)的翻譯后修飾結(jié)合，并且可以是一種不與其它蛋白顯著交叉反應(yīng)的抗體。用于檢測(cè)與目的抗原結(jié)合的抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以包括，但不限于，如FACS、細(xì)胞ELISA和蛋白質(zhì)印跡的測(cè)定。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以互換地使用，并且所有這樣的名稱包括后代。還應(yīng)該理解，由于故意的或偶然的突變，所有的后代在DNA內(nèi)容物上可能不是精確相同的。包括在初始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變的后代。這將通過(guò)使用不同名稱的上下文變得清楚。
“治療或處理”是指治療性治療和預(yù)防或預(yù)防性措施，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)目的病理癥狀或病癥。需要治療的那些包括已經(jīng)患有病癥的那些，以及傾向于患有病癥的那些，或要預(yù)防病癥的那些。因此，在本發(fā)明中待治療的哺乳動(dòng)物可以已經(jīng)診斷患有病癥或可以是傾向于或易受病癥影響的。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性的”是指或描述哺乳動(dòng)物中的生理狀況，所述生理狀況的典型特征在于失控的細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡。癌癥的實(shí)例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚細(xì)胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴惡性病。所述癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌癥，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
“化療劑”是有效用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的實(shí)例包括烷基化試劑，如塞替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸酯如白消安，英丙舒凡，和哌泊舒凡；吖丙啶類如苯佐替派(benzodopa),卡波醌，美妥替哌(meturedopa),和烏瑞替哌(uredopa)；ethylenimines和methylamelamines,包括六甲蜜胺，曲他胺，三亞乙基磷酰胺，塞替哌(triethyIenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethy11meIamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlornaphazine)，cholophosphamide，雌莫司汀，異環(huán)磷酰胺，氮芥(mechlorethamine),鹽酸氧氮芥,美法侖，新氮芥，苯芥膽甾醇，潑尼莫司汀，曲磷胺，烏拉莫司汀；亞硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins),放線菌素，authramycin,偶氮絲氨酸，博來(lái)霉素，放線菌素 C, calicheamicin, carabicin, carnomycin,嗜癌霉素，色霉素，放線菌素D，柔紅霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸,多柔比星，表柔比星，依素比星，伊達(dá)比星，馬塞羅霉素，絲裂霉素，麥考酚酸，諾拉霉素，橄欖霉素，培洛霉素，potfiromycin,嘌羅霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑霉素，鏈佐星，殺結(jié)核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物如denopterin,甲氨喋呤，喋羅呤,三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱，6-巰嘌呤，thiamiprine，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷，5-FU，雄激素諸如卡普睪酮，屈他雄酮丙酸鹽，環(huán)硫雄醇，美雄燒，睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥(ant1-adrenals)如氨魯米特,米托坦，曲洛司坦；葉酸補(bǔ)償物如frolinic acid ;醋葡醒內(nèi)酯；輕醒磷酰胺配糖(aldophosphamideglycoside) ;5_ 氨基酮戍酸；安 Π丫唳；bestrabucil ;比生群；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine ;秋水仙胺；地B丫醌；elformithine ;依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；輕基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他丁 ；異丙嗪(phenamet);卩比柔比星；鬼臼酸；2_乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼；PSK: ;雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴燒；gacytosine ；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉烷類，例如，紫杉醇(TAXOL ,Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,新澤西)和多西他賽(IAX.0Ttl.RE ，Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony,法國(guó));苯丁酸氮芥；吉西他濱；6_硫鳥喋呤；巰嘌呤；甲氨喋呤；鉬類似物如順鉬和卡鉬；長(zhǎng)春堿；鉬；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C ;米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞濱；諾維本；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；適羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11 ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；esperamicins ;卡培他濱；以及任何上述物質(zhì)的藥用鹽、酸或衍生物。下列物質(zhì)也包含在本定義中，它們是:作用調(diào)控或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素藥劑，諸如抗雌激素藥，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制4 (5)-咪唑的芳香酶，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene, LY117018,奧那司酮,和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素藥諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物質(zhì)的藥用鹽、酸或者衍生物。用于治療目的的“哺乳動(dòng)物”是指分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人，小鼠，S CID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如綿羊、狗、馬、貓、牛、等等。在本發(fā)明中優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。“寡核苷酸”是長(zhǎng)度短的、單鏈或雙鏈的多聚脫氧核苷酸，其通過(guò)已知方法化學(xué)合成(如磷酸三酯、亞磷酸酯、或亞磷酰胺化學(xué)，使用固相技術(shù)，如在1988年5月4日公布的EP266, 032中所述的，或通過(guò)脫氧核苷H-磷酸酯中間物,如Froehler等,核酸研究(Nucl。Acids Res.)，14:5399-5407,1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝膠上純化它們。按照本發(fā)明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的“人源化的”和/或“嵌合的”形式是指這樣的抗體，所述抗體包含特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2或抗體的其它抗原-結(jié)合亞序列)，與原始抗體相比較，其導(dǎo)致人抗_小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)或人抗-人抗體(HAHA)反應(yīng)的減少，并且所述抗體包含來(lái)源于所述非人免疫球蛋白的、對(duì)再現(xiàn)所需要的作用是必需的必需部分(例如，一個(gè)或多個(gè)CDR(S)、抗原結(jié)合區(qū)、可變結(jié)構(gòu)域等)，同時(shí)保留與所述非人免疫球蛋白相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特征。對(duì)于大部分，人源化的抗體是這樣的人免 疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自該受體抗體互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)的殘基被來(lái)自非人物種(供體抗體)CDRs的、具有需要的特異性、親和性和能力的殘基取代，所述非人物種如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相對(duì)應(yīng)的非人FR殘基取代。此外，所述人源化的抗體可以包括在受體抗體和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步限定和最優(yōu)化抗體性能。通常，所述人源化的抗體應(yīng)該包括基本上不少于至少一個(gè)、和典型地兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的那些相對(duì)應(yīng)，并且所有或基本上所有的FR殘基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗體優(yōu)化地還應(yīng)該包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。“去免疫的(De-1mmunized) ”抗體是對(duì)于給定的物種是無(wú)免疫原性的或較少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通過(guò)抗體的結(jié)構(gòu)改變實(shí)現(xiàn)。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何去免疫技術(shù)。例如，用于使抗體去免疫性的一種適宜的技術(shù)記述在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中。 誘導(dǎo)“程序性細(xì)胞死亡”的抗體是一種通過(guò)任何方式誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗體，所述方式示例而不限于，膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，胱天蛋白酶活性，DNA的片段化，細(xì)胞收縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，細(xì)胞片段化和/或膜囊泡的形成(稱為凋亡小體)。當(dāng)用于本文時(shí)，“抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞 毒性”應(yīng)該理解為意指這樣的細(xì)胞毒性作用，所述細(xì)胞毒性作用來(lái)源于由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的雜交瘤上清或抗體，由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體，由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，及其抗原結(jié)合片段，或抗體配體，所述作用不必與結(jié)合程度相關(guān)。在整個(gè)說(shuō)明書中，備選地，雜交瘤細(xì)胞系以及由其產(chǎn)生的分離的單克隆抗體由它們的內(nèi)部命名 H460-16-2(鼠)，(ch)ARH460-16-2-1gGl, (ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)，(hu)ARH460-16-2 或保藏命名 ATCCPTA-4621 指示。當(dāng)用于本文時(shí)，“抗體-配體”包括這樣的部分，所述部分表現(xiàn)出針對(duì)靶抗原的至少一個(gè)表位的結(jié)合特異性，并且其可以是完整的抗體分子、抗體片段、以及至少具有它的抗原-結(jié)合區(qū)或部分(即，抗體分子的可變部分)的任何分子，例如，F(xiàn)v分子，F(xiàn)ab分子，F(xiàn)ab’分子，F(xiàn)(ab’)2分子，雙特異性抗體，融合蛋白，或特異性識(shí)別和結(jié)合這樣的抗原的至少一個(gè)表位的任何遺傳工程分子，所述抗原與由命名為ATCC PTA-462KATCC PTA-4621抗原)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體、由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合。當(dāng)用于本文時(shí)，“減輕癌性疾病的抗體”(CDMAB)是指這樣的單克隆抗體及其抗體-配體，所述單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病過(guò)程，例如，通過(guò)減少腫瘤負(fù)荷或延長(zhǎng)腫瘤攜帶個(gè)體的生存的方式。"CDMAB相關(guān)結(jié)合劑”，以 其廣義，理解為包括，但不僅限于，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于至少一個(gè)CDMAB靶表位的任何形式的人或非-人抗體、抗體片段、抗體-配體等。“競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑”理解為包括對(duì)至少一個(gè)CDMAB靶表位具有結(jié)合親和力的任何形式的人或非-人抗體、抗體片段、抗體-配體等。待治療的腫瘤包括原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤，以及頑固性腫瘤。頑固性腫瘤包括對(duì)使用單獨(dú)化療劑、單獨(dú)抗體、單獨(dú)輻射或其組合的治療未能應(yīng)答或?qū)ζ渚哂锌剐缘哪[瘤。頑固性腫瘤還包括表現(xiàn)出受使用所述試劑治療抑制但停止治療后至多5年、有時(shí)至多10年或更長(zhǎng)復(fù)發(fā)的腫瘤。可以治療的腫瘤包括未血管化、或尚未充分血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤。可以因此治療的實(shí)體腫瘤實(shí)例包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤。所述腫瘤的一些實(shí)例包括表皮樣 腫瘤，鱗狀細(xì)胞腫瘤，諸如頭頸腫瘤，結(jié)腸直腸腫瘤，前列腺腫瘤，乳腺腫瘤，肺腫瘤，包括小細(xì)胞和非-小細(xì)胞肺腫瘤，胰腺腫瘤，甲狀腺腫瘤，卵巢腫瘤，和肝腫瘤。其他實(shí)例包括卡波西肉瘤、CNS瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、毛細(xì)血管成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤、黑素瘤、胃腸癌和腎癌和肉瘤、橫紋肌肉瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤優(yōu)選多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、和平滑肌肉瘤。當(dāng)用于本文時(shí)，“抗原-結(jié)合區(qū)”意指分子識(shí)別靶抗原的部分。當(dāng)用于本文時(shí)，“競(jìng)爭(zhēng)性抑制”意指使用常規(guī)的交互(reciprocal)抗體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定(Belanger L., Sylvestre C.和Dufour D.(1973),通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性和夾心方法對(duì)α胎蛋白的酶聯(lián)免疫測(cè)定(Enzyme linked immunoassay for a fetoprotein by competitive andsandwich procedures).Clinica Chimica Acta 48,15)能夠識(shí)別和結(jié)合這樣的決定族位點(diǎn)，所述決定簇位點(diǎn)是由命名為ATCC PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(ATCCPTA-4621抗體)、由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體、其抗原結(jié)合片段或抗體配體所針對(duì)的。當(dāng)用于本文時(shí)，“靶抗原”是ATCC PTA-4621抗原或其部分。當(dāng)用于本文時(shí)，“免疫綴合物”意指與細(xì)胞毒素、放射性試劑、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥劑化學(xué)或生物學(xué)連接的任何分子或CDMAB,如抗體。所述抗體或CDMAB可以在分子的任何位置處與所述細(xì)胞毒素、放射性試劑、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥物連接，只要它能夠結(jié)合其靶點(diǎn)。免疫綴合物的實(shí)例包括抗體毒素化學(xué)綴合物和抗體-毒素融合蛋白。適合于用作抗-腫瘤試劑的放射性試劑是本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員已知的。例如，使用1311或211At。利用常規(guī)技術(shù)使這些同位素附著于抗體(例如Pedley等，英國(guó)癌癥雜志(Br.J.Cancer) 68，69-73 (1993))。備選地，附著于抗體的抗-腫瘤試劑是活化前體藥物的酶。可以施用這樣的前體藥物，所述前體藥物保持其失活形式直到其到達(dá)腫瘤位點(diǎn)，一旦施用抗體復(fù)合物所述前體藥物在該位點(diǎn)處轉(zhuǎn)化為其細(xì)胞毒素形式。實(shí)際上，將抗體-酶綴合物施用于患者并容許定位在待治療的組織區(qū)域。然后將前體藥物施用于患者，從而使向細(xì)胞毒性藥物的轉(zhuǎn)化發(fā)生在待治療組織區(qū)域中。備選地，與抗體綴合的抗-腫瘤試劑是細(xì)胞因子，諸如白細(xì)胞介素-2(IL_2)、白細(xì)胞介素-4(IL_4)或腫瘤壞死因子a (TNF-α )。所述抗體靶向針對(duì)腫瘤的細(xì)胞因子，以使得細(xì)胞因子在不影響其他組織的條件下介導(dǎo)針對(duì)腫瘤的損傷或破壞。利用常規(guī)重組DNA技術(shù)使細(xì)胞因子在DNA水平上與抗體融合。還可以使用干擾素。當(dāng)用于本文時(shí)，“融合蛋白”意指任何嵌合蛋白，其中抗原結(jié)合區(qū)與生物活性分子如毒素、酶、熒光蛋白 、發(fā)光標(biāo)記、多肽標(biāo)記物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分或蛋白藥物連接。本發(fā)明還預(yù)期本發(fā)明的CDMAB，靶標(biāo)或報(bào)告部分與所述CDMAB相連接。靶標(biāo)部分是結(jié)合對(duì)的第一個(gè)成員。抗-腫瘤試劑，例如，與所述對(duì)的第二個(gè)成員綴合，且由此針對(duì)抗原-結(jié)合蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。所述結(jié)合對(duì)的常見(jiàn)實(shí)例是抗生物素蛋白和生物素。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物素與本發(fā)明CDMAB的靶抗原綴合，并由此為抗-腫瘤試劑或與抗生物素蛋白或鏈親和素綴合的其他部分提供靶標(biāo)。備選地，生物素或另一種所述部分與本發(fā)明CDMAB的靶抗原相連接，并用作，例如診斷系統(tǒng)中的報(bào)告分子，在所述診斷系統(tǒng)中可檢測(cè)的信號(hào)-生成試劑與抗生物素蛋白或鏈親和素綴合。可檢測(cè)的信號(hào)-生成試劑有效用于體內(nèi)和體外診斷目的。信號(hào)生成試劑產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)，所述信號(hào)是可以通過(guò)外部方法，通常電磁輻射測(cè)量法檢測(cè)的。通常，所述信號(hào)生成試劑是酶或發(fā)色團(tuán)，或由熒光、磷光或化學(xué)發(fā)光引起的發(fā)光。發(fā)色團(tuán)包括在紫外或可見(jiàn)區(qū)吸收光的染料，且可以是酶催化反應(yīng)的底物或降解產(chǎn)物。而且，在本發(fā)明范圍內(nèi)包括本發(fā)明CDMAB體內(nèi)和體外用于研究或診斷方法的用途，這在本領(lǐng)域中是公知的。為了執(zhí)行如本文中所預(yù)期的診斷方法，本發(fā)明還可以包括試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的CDMAB。所述試劑盒應(yīng)該有效用于通過(guò)檢測(cè)CDMAB的靶抗原在該個(gè)體細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)而確定處于某種類型癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體。診斷測(cè)定試劑盒
預(yù)期利用處于診斷測(cè)定試劑盒形式的本發(fā)明CDMAB確定腫瘤的存在。通常基于一種或多種腫瘤-特異性抗原，例如在生物學(xué)樣品，諸如血液、血清、尿液和/或腫瘤活組織檢查中的蛋白質(zhì)和/或編碼所述蛋白的多核苷酸的存在，檢測(cè)患者中的腫瘤，所述樣品應(yīng)該是獲自所述患者的。所述蛋白起指示具體腫瘤，例如結(jié)腸、乳腺、肺或前列腺腫瘤存在或缺乏的標(biāo)記的作用。還預(yù)期所述抗原應(yīng)該具有檢測(cè)其他癌性腫瘤的效用。在診斷試劑盒中包括包含本發(fā)明CDMAB的結(jié)合試劑或CDMAB相關(guān)結(jié)合試劑，允許檢測(cè)與生物學(xué)樣品中的試劑相結(jié)合的抗原水平。多核苷酸引物和探針可以用于檢測(cè)編碼腫瘤蛋白的mRNA水平，其也指示是否存在癌癥。為了使該結(jié)合測(cè)定具有診斷性，產(chǎn)生這樣的數(shù)據(jù)，即所述數(shù)據(jù)與和正常組織中存在的抗原相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的抗原水平相關(guān)，從而能夠?qū)嵤┳R(shí)別確定地診斷癌腫瘤存在的結(jié)合。預(yù)期許多形式應(yīng)該有效用于本發(fā)明的診斷測(cè)定，如本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知地，從而使用結(jié)合試劑檢測(cè)樣品中的多肽標(biāo)記。例如，如Harlow和Lane,抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(抗體:ALaboratory Manual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory), 1988 中舉例說(shuō)明的。還預(yù)期前述診斷測(cè)定形式的任意和全部組合、改變或修飾。患者中是否存在癌癥應(yīng)該典型地通過(guò)以下確定:(a)使獲自患者的生物學(xué)樣品與結(jié)合試劑接觸；(b)檢測(cè)樣品中與結(jié)合試劑結(jié)合的多肽水平；和(c)比較多肽水平和預(yù)定截?cái)嘀怠Ｔ谂e例說(shuō)明的實(shí)施方案中，預(yù)期該測(cè)定應(yīng)該包括使用固定在固體支持物上的基于CDMAB的結(jié)合試劑結(jié)合以及去除樣品的殘余中的多肽。結(jié)合的多肽然后可以利用檢測(cè)試劑檢測(cè)，所述檢測(cè)試劑包含報(bào)告基團(tuán)并特異性結(jié)合于結(jié)合試劑/多肽復(fù)合物。例證性檢測(cè)試劑可以包括基于CDMAB的結(jié)合試劑，所述結(jié)合試劑特異性結(jié)合于多肽或抗體或特異性結(jié)合于所述結(jié)合試劑的其他試劑，諸如抗-免疫球蛋白、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A或凝集素。在備選的實(shí)施方案中，預(yù)期可 以使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記多肽，并容許其在結(jié)合試劑與樣品一起溫育后結(jié)合于固定的結(jié)合試劑。樣品與固定的結(jié)合試劑的反應(yīng)性指示是所述樣品成分抑制標(biāo)記的多肽與結(jié)合試劑結(jié)合的程度。對(duì)于在所述測(cè)定中使用合適的多肽包括結(jié)合試劑對(duì)其具有結(jié)合親和力的全長(zhǎng)腫瘤-特異性蛋白和/或其部分。所述診斷試劑盒具有固體支持物，其可以處于蛋白質(zhì)可以附著的本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的任何材料形式。合適的實(shí)例可以包括微量滴定板中的檢測(cè)孔或硝化纖維或其他合適的膜。備選地，所述支持物可以是珠或盤，諸如玻璃、玻璃纖維、膠乳或塑料材料諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物還可以是磁性粒子或光纖傳感器，諸如例如美國(guó)專利號(hào)5，359,681中公開的那些。預(yù)期利用多種本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員已知的技術(shù)將結(jié)合試劑固定在固體支持物上，這詳細(xì)地記述在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中。術(shù)語(yǔ)“固定”指非共價(jià)締合諸如吸附和共價(jià)附著，其在本發(fā)明的情形中，可以是所述試劑和所述支持物官能團(tuán)之間的直接連接，或可以是通過(guò)交聯(lián)劑的連接。在優(yōu)選但非限制性實(shí)施方案中，通過(guò)吸附固定于微量滴定板的孔或膜是優(yōu)選的。吸附可以通過(guò)使結(jié)合試劑，在合適的緩沖液中，與固體支持物接觸一段合適的時(shí)間獲得。接觸時(shí)間可以隨溫度變化，且應(yīng)該通常在約I小時(shí)-約I天的范圍內(nèi)。結(jié)合試劑與固體支持物的共價(jià)附著一般通過(guò)首先使該支持物與雙功能試劑反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，所述雙功能試劑與支持物和結(jié)合試劑上的官能團(tuán)，諸如羥基或氨基基團(tuán)二者反應(yīng)。例如，結(jié)合試劑可以通過(guò)使用苯醌或通過(guò)使支持物上的醛基與結(jié)合配偶體上的胺和活性氫縮合共價(jià)附著于具有合適聚合物涂層的支持物(參見(jiàn)，例如，Pierce ImmunotechnologyCatalog and Handbook (皮爾斯免疫技術(shù)目錄和手冊(cè))，1991,在A12A13)。還預(yù)期所述診斷測(cè)定試劑盒采用雙-抗體夾心式測(cè)定的形式。該測(cè)定可以通過(guò)首先使抗體，例如本發(fā)明公開的固定在固體支持物，通常是微量滴定板的孔上的CDMAB，與樣品接觸進(jìn)行，從而容許該樣品中的多肽結(jié)合于固定的抗體。然后從固定的多肽-抗體復(fù)合物中去除未結(jié)合的樣品，并加入包含報(bào)告基團(tuán)的檢測(cè)試劑(優(yōu)選地，能夠結(jié)合于多肽上不同位點(diǎn)的二級(jí)抗體)。然后使用適合于特異性報(bào)告基團(tuán)的方法確定保持與固體支持物結(jié)合的檢測(cè)試劑的量。 在具體實(shí)施方案中，預(yù)期抗體一旦固定在如上所述的支持物上，應(yīng)該通過(guò)使用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的任何合適封閉劑，諸如牛血清清蛋白或吐溫20 (西格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical C0.), St.Louis, M0.)封閉支持物上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。然后使固定的抗體與樣品一起溫育，且容許多肽結(jié)合于所述抗體。溫育前，可以用合適的稀釋齊U，諸如磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋樣品。通常，合適的接觸時(shí)間(即溫育時(shí)間)應(yīng)該進(jìn)行選擇以對(duì)應(yīng)于這樣的時(shí)間期，所述時(shí)間期足以檢測(cè)獲自患有特定選擇的腫瘤的個(gè)體的樣品中多肽的存在。優(yōu)選地，接觸時(shí)間足以獲得在結(jié)合和未結(jié)合多肽之間平衡時(shí)獲得的結(jié)合水平的至少約95%的結(jié)合水平。本領(lǐng)域中那些普通技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)獲得平衡所需的時(shí)間可以容易地通過(guò)測(cè)定經(jīng)過(guò)一段時(shí)間發(fā)生的結(jié)合水平來(lái)確定。還預(yù)期未結(jié)合的樣品應(yīng)該然后通過(guò)用合適的緩沖液清洗固體支持物而去除。然后應(yīng)該將包含報(bào)告基團(tuán)的二級(jí)抗體加入固體支持物。然后進(jìn)行檢測(cè)試劑與固定的抗體-多肽復(fù)合物在一起溫育一段足以檢測(cè)結(jié)合的多肽的時(shí)間量。隨后，然后去除未結(jié)合的檢測(cè)試劑，并利用報(bào)告基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑。用于檢測(cè)報(bào)告基團(tuán)的方法必須特異于所選報(bào)告基團(tuán)的類型，例如，針對(duì)放射性基團(tuán)，閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影法通常是適合的。光譜法可以用于檢測(cè)染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。生物素可以利用與不同報(bào)告基團(tuán)(通常，放射性或熒光基團(tuán)或酶)偶聯(lián)的抗生物素蛋白檢測(cè)。酶報(bào)告基團(tuán)可以通常通過(guò)添加底物(通常進(jìn)行一段特定時(shí)期)，隨后進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的光譜或其他分析來(lái)檢測(cè)。為了使用本發(fā)明的診斷測(cè)定試劑盒確定是否存在癌癥，諸如前列腺癌，通常將從保持與固體支持物結(jié)合的報(bào)告基團(tuán)檢測(cè)到的信號(hào)與對(duì)應(yīng)于預(yù)確定截?cái)嘀档男盘?hào)相比較。例如，用于檢測(cè)癌癥的例證性截?cái)嘀悼梢允钱?dāng)使固定的抗體與來(lái)自無(wú)癌癥患者的樣品一起溫育時(shí)獲得的平均信號(hào)。通常，認(rèn)為產(chǎn)生高于預(yù)確定截?cái)嘀导s3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的信號(hào)的樣品是癌癥陽(yáng)性的。在備選的實(shí)施方案中，按照Sackett等，臨床流行病學(xué)(ClinicalEpidemiology).臨床醫(yī)學(xué)基本科學(xué)(A Basic Science for Clinical Medicine),利特爾布朗公司(Little Brown and C0.)，1985，106-7頁(yè)的方法，截?cái)嘀邓疽岳媒邮苷卟僮髑€(Receiver Operator Curve)確定。在該實(shí)施方案中，截?cái)嘀悼梢詮膶?duì)應(yīng)于關(guān)于診斷檢測(cè)結(jié)果的每種可能的截?cái)嘀档恼?yáng)性率(即靈敏性)和假陽(yáng)性率(100%-特異性)對(duì)的圖表確定。在最接近左上角的圖表中的截?cái)嘀?即包含最大面積的值)是最準(zhǔn)確的截?cái)嘀担宜疽哉J(rèn)為產(chǎn)生高于由該方法確定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品是陽(yáng)性的。備選地，截?cái)嘀邓疽匝刂鴪D表向左移動(dòng)，從而最小化假陽(yáng)性率，或向右移動(dòng)，從而最小化假陰性率。一般，認(rèn)為產(chǎn)生高于由該方法確定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品對(duì)癌癥是陽(yáng)性的。
預(yù)期可通過(guò)所述試劑盒進(jìn)行的診斷測(cè)定以流通式或試驗(yàn)紙檢驗(yàn)(strip test)形式進(jìn)行，其中結(jié)合試劑固定在膜，諸如硝化纖維膜上。在流通式檢測(cè)中，當(dāng)樣品流經(jīng)膜時(shí)，樣品中的多肽結(jié)合于固定的結(jié)合試劑。第二種標(biāo)記的結(jié)合試劑在包含該第二種結(jié)合試劑的溶液流經(jīng)該膜時(shí)，再結(jié)合于結(jié)合試劑-多肽復(fù)合物。結(jié)合的第二種結(jié)合試劑的檢測(cè)可以然后如上所述進(jìn)行。在試驗(yàn)紙檢驗(yàn)形式中，將結(jié)合試劑結(jié)合的膜的一端浸沒(méi)在包含樣品的溶液中。該樣品沿該膜移動(dòng)經(jīng)過(guò)包含第二種結(jié)合試劑的區(qū)域，并到達(dá)固定的結(jié)合試劑的區(qū)域。所述第二結(jié)合試劑在固定的抗體區(qū)域處的濃度指示癌癥的存在。在結(jié)合位點(diǎn)形成可以視覺(jué)讀取的圖案，諸如線，指示陽(yáng)性檢測(cè)。缺乏所述圖案指示陰性結(jié)果。一般，選擇固定在膜上的結(jié)合試劑的量，從而在生物學(xué)樣品包含足以在處于上述形式的雙-抗體夾心式測(cè)定中產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的多肽水平時(shí)，產(chǎn)生視覺(jué)可辨別的圖案。對(duì)于在本診斷測(cè)定中使用的優(yōu)選結(jié)合試劑是目前公開的抗體，其抗原-結(jié)合片段、和如本文中所述的任何CDMAB相關(guān)結(jié)合試劑。固定在膜上的抗體的量應(yīng)該是有效引起診斷測(cè)定的任意量，且可以在約25毫微克-約I微克的范圍內(nèi)。典型地，所述檢測(cè)可以利用非常小量的生物學(xué)樣品進(jìn)行。另外，本發(fā)明的CDMAB由于其識(shí)別其靶抗原的能力，可以用在進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)室中。為了更充分地理解本文所述的本發(fā)明，進(jìn)行了下述描述。本發(fā)明提供特異性識(shí)別和結(jié)合ATCC PTA-4621抗原的CDMAB( S卩，ATCC PTA-4621CDMAB，由以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、由以保藏號(hào)PTA4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體、其抗原結(jié)合片段或抗體配體)。通過(guò)以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的CDMAB司以以任何形式存在，只要它具有這樣的抗原-結(jié)合區(qū)，所述抗原-結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)性抑制由雜交瘤ATCC PTA-4621產(chǎn)生的分離的單克隆抗體與其靶抗原的免疫特異性結(jié)合。因此，具有與ATCC PTA-4621抗體相同的結(jié)合特異性的任何重組蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗體與第二蛋白如淋巴因子或腫瘤抑制性生長(zhǎng)因子結(jié)合)均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDMAB是ATCC PTA-4621抗體。在其它實(shí)施方案中，所述CDMAB是抗原結(jié)合片段，其可以是Fv分子(如單鏈Fv分子)、Fab分子、Fab’分子、F(ab’)2分子、融合蛋白、雙特異性抗體、異種抗體或具有ATCCPTA-4621抗體的抗原-結(jié)合區(qū)的任何重組分子。本發(fā)明的CDMAB針對(duì)所述ATCC PTA-4621單克隆抗體針對(duì)的表位。本發(fā)明的CDMAB可以在分子內(nèi)進(jìn)行修飾，即，通過(guò)氨基酸修飾，以產(chǎn)生衍生物分子。化學(xué)修飾也可以是可能的。通過(guò)直接突變、親和力成熟方法、噬菌體展示或鏈改組的修飾也司以是司能的。親和力和特異性可以通過(guò)突變CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)殘基和篩選具有所需特征的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)或改良。(例如，Yang等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，(1995) 254:392-403)。一種方法是隨機(jī)化各個(gè)殘基或殘基的組合，從而在其它方面相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)群中，2-20個(gè)氨基酸的子集存在于特定位置處。備選地，突變可以通過(guò)易錯(cuò)PCR方法在一定范圍的殘基中誘導(dǎo)(例如，Hawkins等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.), (1992)226:889-96)。在另一個(gè)實(shí)例中，包含重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體展示載體可以在大腸桿菌(E.coli)突變菌株中增殖(例如，Low等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，(1996) 250:359-68)。這些誘變方法是許多本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知方法的例證。增加本發(fā)明抗體親和力的另一種方式是進(jìn)行鏈改組，其中重鏈或輕鏈與其他重鏈或輕鏈隨機(jī)配對(duì)，從而制備具有較高親和力的抗體。抗體中的多種CDR也可以利用其他抗體中相對(duì)應(yīng)的⑶R改組。衍生物分子將保留所述多肽的功能特性，S卩，具有這樣的取代的分子仍然允許所述多肽與所述ATCC PTA-4621抗原或其部分結(jié)合。這些氨基酸取代包括，但不必要限于，本領(lǐng)域內(nèi)已知為“保守的”氨基酸取代。例如，充分確定的蛋白質(zhì)化學(xué)原理認(rèn)為，通常可以在蛋白質(zhì)內(nèi)頻繁進(jìn)行稱為“保守氨基酸取代”的特定的(certain)氨基酸取代，而不改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的構(gòu)象或功能。這樣的變化包括用異亮氨酸(I)，纈氨酸(V)，和亮氨酸(L)中的任一種取代這些疏水性氨基酸中的任意其它一種；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，并且反之亦然；和用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，并且反之亦然。其它取代也可以被認(rèn)為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境及其在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)常常可以互換，同樣丙氨酸和纈氨酸(V)也可以互換。相對(duì)疏水性的甲硫氨酸(M)常常可以與亮氨酸和異亮氨酸互換，并且有時(shí)可以與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)常常在這樣的情形中互換，在所述情形中，氨基酸殘基的重要特征是其電荷，并 且這兩種氨基酸殘基的不同的pK’ s并不顯著。在特定的情形中，還有其它的變化司以被認(rèn)為是“保守的”。實(shí)施例1關(guān)于人MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)以前證明了(如 S.N.10/603,000 中公開)H460-16-2 針對(duì) MDA-MB-231 人乳腺癌異種移植模型的功效。為了擴(kuò)展該發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-468人乳腺煽異種移植模型中測(cè)試H460-16-2。參考圖1和2，對(duì)8_10周齡雌性無(wú)胸腺裸鼠通過(guò)在每只小鼠在右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬(wàn)人乳腺煽細(xì)胞(MDA-MB-468)。將小鼠隨機(jī)分成2個(gè)處理組，每組10只。在植入后第35天，即當(dāng)小鼠平均腫瘤體積達(dá)到約83mm3時(shí)，在用含有2.7mM KCl7ImM KH2PO4,137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀釋劑從儲(chǔ)備的濃縮液稀釋后，對(duì)每組腹膜內(nèi)施用300微升體積的20mg/kg的H460-16-2檢測(cè)抗體或緩沖液對(duì)照。然后，在約三周內(nèi)每周施用所述抗體和對(duì)照樣品三次。大約每3-10天用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。在8劑抗體后，結(jié)束處理。在腫瘤測(cè)量的同時(shí)記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，一旦它們達(dá)到終點(diǎn)，按照CCAC指導(dǎo)將所有動(dòng)物處死。H460-16-2在人乳腺癌細(xì)胞的MDA_MB_468體內(nèi)確立模型中顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。如在第79天，即最后抗體劑量后26天時(shí)確定地，與緩沖液處理組相比，用ARIUS抗體H460-16-2處理減少M(fèi)DA-MB-468腫瘤生長(zhǎng)62.8% (p = 0.005506, t_檢驗(yàn))圖1。腫瘤生長(zhǎng)抑制通過(guò)用對(duì)照和處理組減去最初腫瘤體積計(jì)算。在整個(gè)研究過(guò)程中，不存在明顯的臨床毒性跡象。以每周時(shí)間間隔測(cè)量的體重是健康和不能健壯生長(zhǎng)的替代品。從研究的開始到結(jié)束，所有組中的平均體重均增加(圖2)。在第35天和第79天之間，平均體重在對(duì)照組中增加1.82g(7.2% )和在H460-16-2處理組中增加2.30g(9.9% )。在處理期間內(nèi)，各組間不存在顯著差別。
總之，H460-16-2在人乳腺煽異種移植模型中是良好耐受的，并且顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例2關(guān)于人PC-3前列腺癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)以前證明了(如S.N.10/810, 165中公開)H460-16-2與化療劑順鉬結(jié)合針對(duì)PC-3人前列腺癌異種移植模型的功效。為了確定在缺乏該藥物時(shí)是否能證明該功效，在不同的小鼠品系異種移植模型中單獨(dú)地測(cè)試H460-16-2。參考圖3和4，對(duì)8_10周齡雄性無(wú)胸腺裸鼠通過(guò)在每只小鼠的右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬(wàn)人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)。將小鼠隨機(jī)分成2個(gè)處理組，每組10只。在植入后第6天，即當(dāng)小鼠平均腫瘤體積達(dá)到約 95mm3 時(shí)，在用含有 2.7mM KCl, ImM KH2PO4,137mM NaCl 和 20mM Na2HPO4 的稀釋劑從儲(chǔ)備的濃縮液稀釋后，對(duì)每組腹膜內(nèi)施用300微升體積的20mg/kg的H460-16-2檢測(cè)抗體或緩沖液對(duì)照。然后，在約三周內(nèi)每周施用所述抗體和對(duì)照樣品三次。大約每4-10天用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。在10劑抗體后，結(jié)束處理。在腫瘤測(cè)量的同時(shí)記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，一旦它們達(dá)到終點(diǎn)，按照CCAC指導(dǎo)將所有動(dòng)物處死。H460-16-2在人前列腺癌的PC-3體內(nèi)確立模型中顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。如在第71天，即最后抗體劑量后44天時(shí)確定地(圖3)，與緩沖液處理組相比，用ARIUS抗體財(cái)60-16-2處理減少？(:-3腫瘤生長(zhǎng)61.9% (p = 0.002414，t_檢驗(yàn))。腫瘤生長(zhǎng)抑制通過(guò)用對(duì)照和處理組減去最初腫瘤體積計(jì)算。在整個(gè)研究過(guò)程中，不存在明顯的臨床毒性跡象。以每周時(shí)間間隔測(cè)量的體重是健康和不能健壯生長(zhǎng)(fail to thrive)的替代品。從研究的開始到結(jié)束，所有組中的平均體重均增加(圖4)。在第6天和第71天之間，平均體重在對(duì)照組中增加3.47g(14.3% )和在H460-16-2處理組中增加3.86g(15.1% )0在處理期間內(nèi)，各組間不存在顯著差別。總之，H460-16-2在這種人前列腺癌異種移植模型中是良好耐受的，并且單獨(dú)作為抗體，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例3關(guān)于人MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)以前證明了(如S.N.10/603, 000中公開)Η460_16_2針對(duì)MDA-MB-231人乳腺癌異種移植模型的功效。為了確定有效劑量水平，在確立的MDA-MB-231人乳腺癌異種移植模型中測(cè)試處于多種劑量的(ch)ARH460-16-2-1gGl。參考圖5和6，對(duì)8_10周齡雌性SCID小鼠通過(guò)在每只小鼠的右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬(wàn)人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)。當(dāng)小鼠平均腫瘤體積達(dá)到約IOOmm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分成5個(gè)處理組，每組 10 只。在植入后第 11 天，在用含用 2.7mMKCl, ImM KH2PO4,1 37mM NaCl 和 20mM Na2HPO4的稀釋劑從儲(chǔ)備的濃縮液稀釋后，對(duì)每組腹膜內(nèi)施用300微升體積的20、10、2或0.2mg/kg的(ch)ARH460-16-2-1gGl檢測(cè)抗體或緩沖液對(duì)照。然后，在約三周內(nèi)每周施用所述抗體和對(duì)照樣品三次。大約每4-7天用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。在10劑抗體后，結(jié)束處理。在腫瘤測(cè)量的同時(shí)記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，一旦它們達(dá)到終點(diǎn)，按照CCAC指導(dǎo)將所有動(dòng)物處死。
(ch)ARH460-16-2-1gGl證明了在人乳腺癌的MDA-MB-231體內(nèi)確立模型中的劑量依賴性腫瘤生長(zhǎng)抑制和退化，第11天-第32天之間處理期間內(nèi)的最低劑量為0.2mg/kg，且在給藥后繼續(xù)維持腫瘤生長(zhǎng)抑制。如在第55天，即最后抗體劑量后23天時(shí)確定地，與緩沖液-處理組相比，使用20、10、2或0.2mg/kg劑量的ARIUS抗體(ch) ARH460-16-2_IgGl處理分別以 91.3,89.0,86.1 或 63.5% (p < 0.00001，t_ 檢驗(yàn))減小 MDA-MB-231 腫瘤的生長(zhǎng)(圖5)。在整個(gè)研究過(guò)程中，不存在明顯的臨床毒性跡象。以每周時(shí)間間隔測(cè)量的體重是健康和不能健壯生長(zhǎng)的替代品。從研究的開始到結(jié)束，所有組中的平均體重均增加(圖6)。在第O天和第55天之間，平均體重在對(duì)照組中增加2.33g(ll.9% )和在劑量為20、10、2和0.2mg/kg 的 H460-16-2 處理組中分別增加 2.44g(12.8%),2.0g (10.0%),2.0g (10.5%),和2.0g (10.5% )。在處理期間內(nèi)，各組間不存在顯著差別。總之，(ch)ARH460-16-2-1gGl在這種人乳腺癌異種移植模型中在所有測(cè)試的劑量以劑量依賴性方式 是良好耐受的，并且顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)并產(chǎn)生腫瘤尺寸的退化。實(shí)施例4人結(jié)腸腫瘤組織染色進(jìn)行了關(guān)于人結(jié)腸腫瘤組織的IHC研究，以進(jìn)一步評(píng)估H460-16-2與人癌癥的結(jié)合。進(jìn)行了 IHC最優(yōu)化研究，從而確定其他實(shí)驗(yàn)條件。利用人結(jié)腸腫瘤組織微陣列(Imgenex,圣地亞哥，CA)進(jìn)行H460-16-2與59份人結(jié)腸腫瘤組織的結(jié)合。組織切片通過(guò)在58°C溫箱中干燥I小時(shí)去石蠟并通過(guò)浸沒(méi)在科普林缸(Coplin jar)的二甲苯5次,4分鐘/次脫臘。在通過(guò)一系列分級(jí)乙醇清洗(100%至75% )處理后，使切片在水中重新水合。將載玻片浸沒(méi)在IOmM檸檬酸鹽緩沖液pH6 (Dako，多倫多，安大略)中，然后以高、中、和低能量設(shè)置各微波處理5分鐘，并且最后浸沒(méi)在冷PBS中。然后將載玻片浸沒(méi)在3%過(guò)氧化氫溶液中6分鐘，用PBS清洗3次，5分鐘/次，干燥并在通用封閉溶液(Dako，多倫多，安大略)中室溫溫育5分鐘。H460-16-2，抗人肌肉肌動(dòng)蛋白(克隆HHF35，Dako，多倫多，安大略)，或同種型對(duì)照抗體(針對(duì)黑曲霉(Aspergilltsniger)葡糖氧化酶，即在哺乳動(dòng)物組織中既不存在也不可誘導(dǎo)的酶；Dako，多倫多，安大略)在抗體稀釋緩沖液中(Dako，多倫多，安大略)稀釋到其工作濃度(除了抗肌動(dòng)蛋白被稀釋到0.5微克/mL外，每種抗體為5微克/mL)，并在濕潤(rùn)室內(nèi)室溫溫育I小時(shí)。然后用PBS清洗載玻片3次，5分鐘/次。使用如提供的HRP綴合的二級(jí)抗體(Dako預(yù)見(jiàn)系統(tǒng)(Dako Envision System),多倫多，安大略)在室溫下檢測(cè)/顯現(xiàn)初級(jí)抗體的免疫反應(yīng)性30分鐘。在該步驟后，載玻片用PBS清洗3次，5分鐘/次，并且通過(guò)添加DAB (3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺tetrahydrachloride,Dako,多倫多，安大略)發(fā)色團(tuán)底物溶液以在室溫下進(jìn)行免疫過(guò)氧化物酶染色10分鐘形成顏色反應(yīng)。在自來(lái)水中洗滌載玻片終止發(fā)色反應(yīng)。在用梅爾蘇木精(Sigma Diagnostics (西格瑪診斷)，Oakville, ON)復(fù)染色后,載玻片用分級(jí)乙醇(75-100% )脫水并用二甲苯透明化。利用封固劑(mounting media) (Dako Faramount,多倫多，安大略)封蓋載玻片。利用Axiovert 200 (Ziess加拿大，多倫多，0N)顯微鏡法檢驗(yàn)載玻片，并用 Northern Eclipse Imaging Software (北方日食圖像軟件)(Mississauga,ON)獲得和保存數(shù)字圖像。由組織病理學(xué)家對(duì)結(jié)果進(jìn)行閱讀、評(píng)分和解釋。圖7顯示人結(jié)腸腫瘤組織陣列的H460-16-2染色結(jié)果的總結(jié)。由該表，36/59(61%)的測(cè)試腫瘤對(duì)于H460-16-2是陽(yáng)性的。H460-16-2特異于腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞(圖8)。細(xì)胞定位主要在膜和細(xì)胞質(zhì)膜。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比在< 10%->50%的范圍內(nèi)，這說(shuō)明該抗體與腫瘤細(xì)胞的異源結(jié)合。不能準(zhǔn)確評(píng)估抗體結(jié)合和腫瘤階段(AmericanJoint Committee on Cancer, AJCC staging)的關(guān)系,這歸因于不同腫瘤階段之間腫瘤數(shù)量的差異，即 I，II，III 和 IV 期分另Ij為 0/0，19/29 (66% ), 14/25 (56% )和 3/5 (60% ) 抗肌動(dòng)蛋白，作為陽(yáng)性抗體對(duì)照，顯示出與肌內(nèi)組織預(yù)期的陽(yáng)性結(jié)合。IgG同種型陰性對(duì)照顯示出與檢測(cè)組織的陰性結(jié)合。作為其結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞的結(jié)果，H460-16-2的治療益處可以擴(kuò)展到治療結(jié)腸煽。實(shí)施例5 正常人和獼猴交叉反應(yīng)性進(jìn)行IHC研究，以表征正常獼猴組織上的H460-16-2抗原。使用抗體(ch)ARH460-16-2-1gGl (FITC，由LifeSpan標(biāo)記，西雅圖，WA，美國(guó))和同種型對(duì)照抗體(Sigma (西格瑪),由LifeSpan標(biāo)記,西雅圖，WA,美國(guó))進(jìn)行抗體滴定實(shí)驗(yàn)，以確定將導(dǎo)致最小背景和最大檢測(cè)信號(hào)的濃度。為了最優(yōu)化，以20微克/mL, 10微克/mL,5微克/mL,和
2.5微克/mL在福爾馬林固定的、石蠟包埋的和新鮮冷凍的組織上進(jìn)行連續(xù)稀釋。抗體(ch)ARH460-16-2-1gGl和同種型對(duì)照抗體用作初級(jí)抗體，二級(jí)抗體是在兔中制備的抗-FITC抗體(DAKO，Mississauga, 0N，加拿大)。主要檢測(cè)系統(tǒng)由具有DAB作為發(fā)色團(tuán)的DAKOEnvision過(guò)氧化物酶標(biāo)記聚合物(DAKO, Mississauga, 0N,加拿大)組成,其用于產(chǎn)生褐色沉淀。陰性對(duì)照由在缺乏初級(jí)抗體的條件下在相鄰切片上進(jìn)行完整免疫組化程序組成。用與尼康(Nikon)顯微鏡連接的DVC 1310C數(shù)碼相機(jī)捕獲載玻片的高能量圖像。用裝備有萊卡(Leica)DMLA顯微鏡的LifeSpan專有成像儀(ALIAS system)捕獲完整切片的圖像。用Adobe Photoshop將圖像作為TIFF文件保存。抗體(ch) ARH460-16-2_IgGl在2.5微克/mL顯示出陽(yáng)性人對(duì)照組織的強(qiáng)染色，更高抗體濃度時(shí)背景更高。因此，濃度2.5微克/mL用于進(jìn)一步免疫組化研究。同樣地，福爾馬林固定、石蠟包埋的組織顯 示出比冷凍切片更少的背景染色；因此，固定的組織用于進(jìn)一步IHC研究。總之，由關(guān)于有限數(shù)量樣品的最優(yōu)化研究，信號(hào)存在于人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物樣品的福爾馬林固定組織上，盡管人皮膚比靈長(zhǎng)類動(dòng)物皮膚組織更陽(yáng)性染色。關(guān)于16份正常人和獼猴(血液、骨髓、腦、結(jié)腸、眼睛、心臟、腎、肝、肺、骨骼肌、卵巢、胰腺、皮膚、脾、睪丸和甲狀腺)福爾馬林固定石蠟包埋組織進(jìn)行擴(kuò)展的IHC(圖9和10)。在人樣品中，(ch)ARH460-16-2-1gGl證明在下述細(xì)胞類型中對(duì)中度細(xì)胞質(zhì)或膜染色很微弱:嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的子集、骨髓中的myeloid series、漿細(xì)胞子集、II型肺細(xì)胞、表皮角化細(xì)胞和皮膚附器。白質(zhì)束也微弱陽(yáng)性。微弱的細(xì)胞核染色見(jiàn)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)、腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、和睪丸和呼吸上皮之一的樣品。其他細(xì)胞類型和組織是陰性的，包括紅細(xì)胞系列和巨核細(xì)胞，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，結(jié)腸上皮，平滑肌，內(nèi)皮，成纖維細(xì)胞，除巨噬細(xì)胞外的眼睛，心臟，肝，卵巢，胰腺，骨骼肌，淋巴細(xì)胞和脾內(nèi)皮，和甲狀腺。IgG同種型對(duì)照抗體在測(cè)試的所有人組織中是陰性的。在猴組織內(nèi)，在許多組織中存在與人樣品相比更高水平的細(xì)胞核染色。也在嗜中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元子集、結(jié)腸上皮細(xì)胞子集、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞子集、偶然收集的管、卵巢和眼睛中的多種細(xì)胞類型、精母細(xì)胞中觀察到對(duì)中等細(xì)胞質(zhì)染色很微弱。細(xì)胞核染色見(jiàn)于大多數(shù)也對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色陽(yáng)性的細(xì)胞類型中。以下細(xì)胞類型在缺乏細(xì)胞質(zhì)或膜染色的條件下表現(xiàn)出細(xì)胞核染色:神經(jīng)膠質(zhì)，腦膜細(xì)胞，心肌細(xì)胞，腎小球和腎小管和腎管中的細(xì)胞子集，膽管上皮，呼吸上皮和肺細(xì)胞、和胰島。獼猴組織中的IgG同種型對(duì)照表現(xiàn)出神經(jīng)元中的微弱細(xì)胞核染色，和結(jié)腸和白質(zhì)束中神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的微弱細(xì)胞質(zhì)染色。當(dāng)比較這兩種物種之間的染色模式時(shí)，跨越若干細(xì)胞類型證明了獼猴樣品增加的細(xì)胞核染色，包括神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、腎小管上皮、和膽管。關(guān)于細(xì)胞質(zhì)或膜染色，觀察到以下區(qū)別:在獼猴結(jié)腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)元、卵巢的卵母細(xì)胞和卵泡上皮，和精母細(xì)胞中觀察到略微增加的染色。人骨髓髓樣前體比獼猴樣品中觀察到的早期前體更加陽(yáng)性。其他組織，包括外周血樣品、肺、骨骼肌、胰腺、皮膚、脾、和甲狀腺在獼猴和人樣品之間顯示出類似的染色。為了進(jìn)行在一些切片，特別是獼猴組織中的那些切片中過(guò)程的細(xì)胞核染色，關(guān)于人和獼猴肺、皮膚、和心臟組織，以2.5，1.25，0.6，0.3，0.15，0.08，和0.04微克/mL的(ch)ARH460-16-2-1gGl濃度使用冷凍切片，從而確定在膠原蛋白和結(jié)締組織中保持初級(jí)信號(hào)但降低背景的濃度，并還評(píng)估一些福爾馬林固定的組織中存在的細(xì)胞核染色。然后將處于該濃度的載玻片與以前關(guān)于這兩種物種中相同器官的福爾馬林固定組織的研究進(jìn)行比較。在濃度1.5微克/mL時(shí)，細(xì)胞核染色人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的福爾馬林固定組織樣品中均基本降低，且在冷凍樣品內(nèi)，細(xì)胞核染色大量缺乏，這強(qiáng)烈地提示福爾馬林固定的組織中普遍的細(xì)胞核染色是人工的，且歸因于方法學(xué)或固定人工制品。總之，嵌合抗體(ch)ARH460-16-2-1gGl與獼猴正常組織交叉反應(yīng)。實(shí)施例6
交叉競(jìng)爭(zhēng)研究為了進(jìn)一步表征H460-16-2和AR37A335.8(如 S.N.11/364，013 中公開地)的結(jié)合特性，通過(guò)Western印跡進(jìn)行抗體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，從而確定H460-16-2和AR37A335.8識(shí)別CD44的相似的還是不同表位。利用制備的孔梳，在非還原條件下對(duì)500微克MDA-MB-231總膜制劑進(jìn)行SDS-PAGE，所述孔梳橫跨2個(gè)10%聚丙烯酰胺凝膠的每一個(gè)的完整長(zhǎng)度。將來(lái)自該凝膠的蛋白質(zhì)以150V，在4°C轉(zhuǎn)移到PVDF膜2小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上用處于TBST中的5%脫脂奶，在4°C封閉該膜約17小時(shí)。該膜用約20mLTBST清洗2次，并置于產(chǎn)生20個(gè)單獨(dú)通道的Western多銀幕儀中，在其中應(yīng)用不同的探測(cè)溶液。以前，利用EZ-連接NHS-PEO固相生物素化試劑盒(Pierce，Rockford，IL)制備了生物素化的H460-16-2和AR37A335.8。初級(jí)抗體溶液通過(guò)混合生物素化的H460-16-2或生物素化的AR37A335.8和不同濃度的非生物素化的抗體而制備。具體地，制備溶液含有在處于TBST中的3%脫脂奶中的I微克/mL生物素化的H460-16-2加上2微克/mL，10微克/mL，100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化的抗體。所用的非生物素化的抗體是H460-16-2，AR37A335.8和對(duì)照抗體1B7.11 (同種型對(duì)照，抗TNP鼠IgGl，內(nèi)部純化)。含有I微克/mL生物素化的AR37A335.8的溶液利用以上列出的相同濃度的非生物素化的抗體AR37A335.8，H460-16-2和對(duì)照抗體8B1B.1 (同種型對(duì)照，抗藍(lán)舌病病毒鼠IgG2b，內(nèi)部純化)制備。在搖動(dòng)平臺(tái)上，將初級(jí)抗體溶液在所述膜上的單獨(dú)的通道內(nèi)室溫溫育2小時(shí)。在搖動(dòng)平臺(tái)上，將每個(gè)通道用TBST清洗3次，10分鐘。將處于TBST中的3%脫脂奶中的0.01微克/mL過(guò)氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白的二級(jí)溶液(Jackson Immunoresearch (杰克遜免疫研究)，West Grove,PA)應(yīng)用到所述膜上的每個(gè)通道中。將該膜在二級(jí)溶液中，在搖動(dòng)的平臺(tái)上室溫溫育I小時(shí)。在搖動(dòng)平臺(tái)上，將每個(gè)通道用TBST清洗3次，10分鐘。將該膜從多銀幕儀中取出并用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)溶液(GE Healthcare(GE衛(wèi)生保健)，LifeSciences (生命科學(xué))，以前的 Amersham Biosciences (Amersham 生物科學(xué))，Piscataway,NJ)，按照制造商的指導(dǎo)，進(jìn)行溫育。然后對(duì)該膜進(jìn)行拍照和顯影。圖11和12顯示抗體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。生物素化的H460-16-2的結(jié)合，在與濃度為100微克/mL以上(100倍過(guò)量；圖11，圖A，泳道1_5)的非生物素化的H460-16-2混合時(shí)，受到完全地抑制，而生物素化的AR37A335.8的結(jié)合，在與濃度為10微克/mL以上(10倍過(guò)量；圖12，圖B，泳道6-10)的非生物素化的AR37A335.8混合時(shí)，受到完全地抑制。生物素化的H460-16-2的結(jié)合在任何含有IgGl同種型對(duì)照抗體的樣品中不受抑制(圖11，圖C，泳道11-15)，且生物素化的AR37A335.8的結(jié)合在任何含有IgG2b同種型對(duì)照抗體的樣品中不受抑制(圖12，圖C，泳道11-15)。這說(shuō)明關(guān)于與相同非生物素化抗體混合的生物素化抗體觀察到的結(jié)合抑制歸因于抗原結(jié)合位點(diǎn)被非生物素化抗體，而不是單獨(dú)的過(guò)量抗體的非特異性相互作用而占據(jù)。生物素化的AR37A335.8的結(jié)合，在與濃度為500微克/mL以上(500倍過(guò)量；圖12，圖A，泳道1-5)的非生物素化的H460-16-2混合時(shí)，受到完全地抑制，且生物素化的H460-16-2的結(jié)合，在與所有測(cè)試濃度(圖11，圖B，泳道6_10)的非生物素化的AR37A335.8混合時(shí)，受到完全地抑制。這些結(jié)果說(shuō)明H460-16-2的結(jié)合阻止AR37A335.8的結(jié)合，且反之亦然。總之，競(jìng)爭(zhēng)Western印跡的結(jié)果提示⑶44分子的由H460-16-2和AR37A335.8識(shí)別的表位是相同或在空間上彼此非常接近的，這樣一種抗體的結(jié)合可以完全封閉另一種抗體的結(jié)合。實(shí)施例7確定AR37A335.8與rhCD44的結(jié)合親和性AR37A335.8與重組CD44 (rhCD44)的結(jié)合親和性通過(guò)表面等離振子共振(SPR)確定。利用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)程序固定重組人⑶44/Fc (R&D系統(tǒng)，Minneapolis，MN，美國(guó))。通過(guò)注射104微升0.4M EDC和0.1M NHS的1:1混合物(流速10微升/分鐘)激活CM5傳感器芯片(GE Healthcare (GE衛(wèi)生保健)，Piscataway, NJ,美國(guó)，以前的Biacore)的表面。rhCD44以20微克/mL(稀釋在IOmM乙酸鈉，pH5.5)的濃度注射以達(dá)到約500RU。最后，在該表面上注射119微升1.0M乙醇胺- HClpH8.5，以封閉傳感器芯片表面上任何未占據(jù)的活化位點(diǎn)。注射不同濃度的AR37A335.8抗體。為了后繼注射再生傳感器芯片表面通過(guò)以50微升/分鐘的流速注射IOmM甘氨酸-HCl pH2.070秒實(shí)現(xiàn)。抗體稀釋在運(yùn)行緩沖液(HBS_EP+,GE Healthcare (GE 衛(wèi)生保健)，Piscataway,NJ 美國(guó)，以前的 Biacore)中并以0.67-667nM范圍內(nèi)的濃度連續(xù)注射，并在每個(gè)周期之間再生表面。作為對(duì)照，也在參考表面上注射各種抗體濃度，其不使得rh⑶44固定在該表面上。利用Biacore TlOO評(píng)估軟件1.1版，利用簡(jiǎn)單的1:1相互作用模型對(duì)獲得的sensograms進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)合和解離率常數(shù)用于計(jì)算抗體的KD。實(shí)驗(yàn)利用Biacore TlOO系統(tǒng)(GE Healthcare (GE衛(wèi)生保健)，Piscataway，NJ美國(guó)，以前的Biacore)進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果關(guān)于AR37A335.8產(chǎn)生0.09425nM的KD圖13)。這些結(jié)果說(shuō)明AR37A335.8具有處于納摩爾以下(sub-nanomolar)范圍內(nèi)的KD，且AR37A335.8的親和性高于H460-16-2的親和性(參考以下實(shí)施例10)。還將結(jié)合率常數(shù)(Ka)和解離率常數(shù)(Kd)列表(圖13)。
實(shí)施例8磷酸-RTK(受體酪氨酸激酶)蛋白質(zhì)組Profiler印跡為了確定受嵌合的(ch)ARH460-16-2_IgGl處理影響的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，利用蛋白質(zhì)組profiler人磷酸-RTK抗體陣列(ARY001, R&D Systems Inc.(R&D系統(tǒng)公司)，Minneapolis, MN)對(duì)來(lái)自用(ch)ARH460-16-2_IgGl處理的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行篩選。處理和制備細(xì)胞以前的工作(如S.N.11/364,013中公開地)利用在重度聯(lián)合免疫缺損小鼠(SCID)中生長(zhǎng)的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，證明了(ch)ARH460-16-2_IgGl在乳腺癌異種移植模型中的體內(nèi)功效。因此，對(duì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子活性的篩選利用MDA-MB-231細(xì)胞系進(jìn)行。MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)至接近匯合，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，并然后在血清和增補(bǔ)劑-缺乏的培養(yǎng)基中37°C饑餓過(guò)夜。此后，將(ch)ARH460-16-2-1gGl(20微克/mL)或人IgGl (Sigma-Aldrich, St.Louis, MI) (20微克/mL)加入到細(xì)胞中并容許在4°C結(jié)合20分鐘。然后通過(guò)向細(xì)胞中加入胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉以提供10% FBS，1% L-谷氨酰胺，和1%丙酮酸鈉的最終濃度來(lái)刺激細(xì)胞。將細(xì)胞置于37°C溫育器中并在刺激后I小時(shí)收集細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。通過(guò)用PBS清洗細(xì)胞2次和在NP-40溶胞緩沖液(20mMTris-HCl (pH8.0)，137mM氯化鈉，10%甘油，2mM EDTA, ImM原釩酸鈉，10微克/mL牛胰蛋白酶抑制劑，10 微克 /mL 抑酶醛肽，I % NP-40 (Igepal* CA-630，Sigma-Aldrich, St.Louis,
MI))中收獲來(lái)收集溶胞產(chǎn)物。通 過(guò)吸移管吹吸重新混懸細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到1.5mL微量離心管中并通過(guò)渦旋在4°C混合30分鐘。然后以14000xg離心溶胞產(chǎn)物5分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)二辛可寧酸(BCA)蛋白測(cè)定(Pierce, Rockford, IL)確定。人磷酸-RTK抗體陣列人磷酸-RTK抗體陣列按照制造商所述的流程，針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞溶胞產(chǎn)物篩選(第3修訂版，2005年11月，R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)。簡(jiǎn)言之，每種人磷酸-RTKprofiler膜通過(guò)在1.5mL陣列緩沖液I (Partn0.895477:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)中，在搖動(dòng)平臺(tái)搖動(dòng)器中溫育I小時(shí)制備。對(duì)于每種處理，150微克總蛋白用陣列緩沖液I稀釋達(dá)至IJl.5mL的總體積。將該混合物加入到制備的profiler膜中，并在搖動(dòng)平臺(tái)搖動(dòng)器中4°C溫育過(guò)夜。然后在IX清洗緩沖液(由25X儲(chǔ)液(Part n0.895003:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)在純化蒸餾水中稀釋)中清洗每個(gè)膜三次并與稀釋在IX陣列緩沖液2 (5X陣列緩沖液2，Part n0.895478:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)中的1.5mL抗磷酸酪氨酸-HRP檢測(cè)抗體混合物(Part n0.841403:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001) —起溫育2小時(shí)。在IX清洗緩沖液中清洗膜三次，并使其暴露于ECL+Western檢測(cè)試劑(GE Healthcare (GE衛(wèi)生保健)，LifeSciences (生命科學(xué))，Piscataway,NJ),以顯影。膜暴露于化學(xué)發(fā)光膠片(Kodak(柯達(dá))，Rochester, NY)并利用X-射線醫(yī)學(xué)處理器顯影。顯影的X-射線膠片上的磷酸-RTK陣列數(shù)據(jù)通過(guò)在發(fā)送模式掃描儀上掃描膠片和利用圖像J分析軟件(Image Jl.37v, NIH)分析陣列圖像文件量化。對(duì)于每種RTK，利用膜透明區(qū)域的像素密度計(jì)算關(guān)于相應(yīng)復(fù)制點(diǎn)的平均像素密度，并從背景信號(hào)中減去。對(duì)于各相應(yīng)磷酸-蛋白靶標(biāo)，(ch)ARH460-16-2-1gGl處理樣器的平均標(biāo)準(zhǔn)化像素密度除以同種型對(duì)照，人IgGl處理樣品的平均標(biāo)準(zhǔn)化像素密度，以獲得相對(duì)變化比。磷酸-蛋白信號(hào)的減少百分比通過(guò)由I減去相對(duì)變化比并乘以100確定。來(lái)自用(ch)ARH460-16-2-1gGl溫育的磷酸-RTK陣列的結(jié)果顯示在圖14中。與同種型對(duì)照相比，(ch)ARH460-16-2-1gGl處理用免疫球蛋白樣和EGF樣結(jié)構(gòu)域l(Tie-l)誘導(dǎo)RTK酪氨酸激酶磷酸化的減少(約51 %)。Tie-1和Tie-2—起形成血管生成素、促進(jìn)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子的受體。血管生成素與其受體的結(jié)合誘導(dǎo)Tie-1和Tie-2的磷酸化和啟動(dòng)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。(ch)ARH460-16-2-1gGl在受到血清和增補(bǔ)劑刺激時(shí)，可以減少Tie-1的磷酸化，這提示(ch) ARH460-16-2-1gGl可以通過(guò)活化血管生成素/Tie-1/2受體配體復(fù)合物阻斷生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)細(xì)胞分化和腫瘤進(jìn)展。實(shí)施例9
H460-16-2 的人源化重組DNA技術(shù)利用本領(lǐng)域中公知的方法,和適當(dāng)時(shí),這些方法中所用酶的廠商使用說(shuō)明進(jìn)行。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)室方法也記述如下。利用多聚A 束系統(tǒng) 1000 (Poly A Tract SystemlOOO) mRNA 提取試劑盒(PromegaCorp.，Madison,WI),按照制造商的說(shuō)明，由雜交瘤H460-16-2細(xì)胞提取mRNA。反轉(zhuǎn)錄mRNA如下:對(duì)于K輕鏈，5.0微升mRNA與1.0微升20pmol/微升MuIgGnVL_3’弓丨物0L040 (圖15)和5.5微升無(wú)核酸酶水(Promega Corp., Madison, WI)混合。對(duì)于λ輕鏈,5.0微升mRNA與1.0微升20pmol/微升MuIgGn'-3，引物0L042(圖15)和5.5微升無(wú)核酸酶水(Promega Corp., Madison, WI)混合。對(duì)于 Y 重鏈，5 微升 mRNA 與 1.0 微升 20pmol/ 微升 MuIgG Vh_3’ 引物 0L023 (圖 16)和 5.5 微升無(wú)核酸酶水(Promega Corp.,Madison, WI)混合。將全部三種反應(yīng)混合物置于被設(shè)置為70°C的預(yù)熱的熱循環(huán)器塊中5分鐘。將這些在冰上冷凍5分鐘，隨后分別加入到4.0微升ImPromII5x反應(yīng)緩沖液(Promega Corp,.Madison, WI), 0.5 微升 RNasin 核糖核酸酶抑制劑(Promega Corp,.Madison, WI), 2.0 微升 25mM MgCl2 (Promega Corp,.Madison, WI), 1.0 微升 IOmM dNTP 混合物(Invitrogen,Paisley, UK)和 1.0 微升 Improm II 反轉(zhuǎn)錄酶(Promega Corp., Madison, WI)中。將反應(yīng)混合物在室溫下溫育5分鐘，隨后轉(zhuǎn)移到設(shè)置為42°C的預(yù)熱PCR塊中I小時(shí)。此后，通過(guò)在PCR塊中70°C溫育15分鐘熱滅活反轉(zhuǎn)錄酶。 如下由cDNA擴(kuò)增重鏈和輕鏈序列:PCR總混合物通過(guò)將37.5微升IOx高保真擴(kuò)展PCR 緩沖液:(Roche (羅氏)，Mannheim,德國(guó))，7.5 微升 IOmM dNTP 混合物(Invitrogen,Paisley,英國(guó))和3.75微升高保真擴(kuò)展DNA聚合酶(Roche (羅氏)，Mannheim,德國(guó))加入到273.75微升無(wú)核酸酶水中制備。將該總混合物在冰上分配為容納在15個(gè)薄壁PCR反應(yīng)管中的21.5微升等分試樣。向這些管中的6個(gè)加入2.5微升MuIgVH-3’反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物和1.0微升重鏈5’引物集合HA-HF (關(guān)于引物序列和引物集合組成參見(jiàn)圖16)。向另外7個(gè)管中加入2.5微升MuIgKVL-3’反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和1.0微升輕鏈5’引物集合LA-LG (圖15)。向最后的管中加入2.5微升血181^1^3’反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和1.0微升λ輕鏈引物MuIgA VL5, -LI。將反應(yīng)置于熱循環(huán)器塊中并加熱到95°C 2分鐘。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng):在94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行I分鐘和72°C進(jìn)行30秒的循環(huán)，進(jìn)行40次。最后在72°C加熱PCR產(chǎn)物5分鐘，并然后保持在4 C。利用 pGEM-T 易載體(easy Vector)系統(tǒng) I (Promega Corp.,Madison,WI)試劑盒，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到PGEM-T易載體中并測(cè)序。由此生成的VH和VL序列分別顯示在圖17和18中。為了生成嵌合抗體，利用引物0L437和0L438通過(guò)PCR擴(kuò)增VH區(qū)基因(圖19);設(shè)計(jì)這些，從而利用來(lái)自所述cDNA克隆之一的質(zhì)粒DNA作為模板在5 ’ MluI和3 ’ Hindi 11限制性酶位點(diǎn)中進(jìn)行改造。向0.5mLPCR管中，將5微升IOx高保真擴(kuò)展PCR緩沖液:(Roche (羅氏),Mannheim,德國(guó))，1.0 微升 IOmM dNTP 混合物(Invitrogen, Paisley,英國(guó))，0.5 微升引物0L437，0.5微升引物0L438，1.0微升模板DNA和0.5微升高保真擴(kuò)展DNA聚合酶(Roche (羅氏)，Mannheim,德國(guó))力口入至丨J 41.5微升無(wú)核酸酶水中。利用寡核苷酸0L439和0L090 (圖20)以相似的方法擴(kuò)增VL區(qū)，從而在BssHII和BamHI限制性酶位點(diǎn)中改造。將反應(yīng)置于熱循環(huán)器塊中并加熱到95°C 2分鐘。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng):在94°C進(jìn)行30秒，55 °C進(jìn)行I分鐘和72°C進(jìn)行30秒的循環(huán)，進(jìn)行30次。最后在72°C加熱PCR產(chǎn)物5分鐘，并然后保持在4°C。然后，分別在Mlul/Hindlll和BssHII/BamHI位點(diǎn)處將PCR產(chǎn)物的VH和VL區(qū)分別克隆到雙載體pANT18 (圖21)中。pANT18是基于pAT153的質(zhì)粒，其包含人Ig重鏈和輕鏈表達(dá)盒和dhff選擇基因。所述重鏈盒由受hCMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的具有下游人IgG多聚A區(qū)的人基因組IgGl恒定區(qū)基因組成。所述輕鏈盒包含受hCMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的具有下游輕鏈多聚A區(qū)的基因組人K恒定區(qū)。人Ig引導(dǎo)序列和恒定區(qū)之間的克隆位點(diǎn)容許可變區(qū)基因的插入。PANT18還包含受SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的具有下游SV40多聚A區(qū)的倉(cāng)鼠dhfr基因。人源化V區(qū)基因利用用于PCR的小鼠H460-16-2VH和VL模板構(gòu)建，所述PCR使用長(zhǎng)重疊寡核苷酸引入來(lái)自同源人VH和VL序列的氨基酸。用于生成不同人源化VH和VL序列的寡核苷酸分別顯示在表19和20中。還將人源化變體直接克隆到表達(dá)載體PANT18中。人源化VH和VL變體的序列分別顯示在圖22和23中。`將由此產(chǎn)生的嵌合(ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)，和人源化構(gòu)建體通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染到CHO/dhff-細(xì)胞(ECACC，94060607)中，并在缺乏次黃嘌呤和胸昔的培養(yǎng)基(具有L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉的高葡萄糖DMEM(Invitrogen, Paisley,英國(guó))+5%滲析的FBS(目錄號(hào)26400-044 Invitrogen,Paisley,英國(guó))，脯氨酸(Sigma(西格瑪)，Poole,英國(guó))和青霉素/鏈霉素(Invitrogen, Paisley,英國(guó))中選擇。如通過(guò)下述人IgGl/κ捕獲ELISA所測(cè)量地，基于在培養(yǎng)基中分泌的人IgG水平選擇集落。擴(kuò)大選擇的集落并通過(guò)使用ImLHiTrapMabSelect SuRe柱(GE Healthcare (GE衛(wèi)生健康)，Amersham,英國(guó))的蛋白A親合層析法，遵照制造商建議的條件從細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化抗體。純化的抗體過(guò)濾滅菌，隨后+4°C保存(在PBS ρΗ7.4中)。抗體濃度通過(guò)使用純化的人IgGl/ κ (Sigma (西格瑪)，Poole，UK)作為標(biāo)準(zhǔn)物的hlgGl/kappa捕獲ELISA計(jì)算。免疫吸附96孔板(Nalge nunc, Hereford,英國(guó))用在IXPBS(pH 7.4)中以1: 1500稀釋的小鼠抗人IgG Fe-特異性抗體(I6260Sigma(西格瑪)，Poole,UK)在37°C包被I小時(shí)。在PBS+0.05%吐溫20中清洗板三次，隨后加入稀釋在2%BSA/PBS中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)物。室溫下溫育板I小時(shí)，隨后在PBS/吐溫中清洗三次并加入在2% BSA/PBS中以1: 1000稀釋的100微升/孔檢測(cè)抗體山羊抗人κ輕鏈過(guò)氧化物酶綴合物(Α7164 Sigma (西格瑪)，Poole，英國(guó))。在室溫下溫育板I小時(shí)，隨后用PBS/吐溫清洗5次，并用(PD底物(Sigma(西格瑪)，Poole，英國(guó))檢測(cè)結(jié)合的抗體。該測(cè)定在黑暗中顯影5分鐘，隨后通過(guò)加入3M HCl終止。然后在MRX TCII板讀數(shù)器(Dynex Technologies (Dynex技術(shù)),Worthing,英國(guó))中在490nm讀該測(cè)定板。嵌合(ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)，和人源化變體抗體在利用H460-16-2小鼠抗體的基于ELISA的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中測(cè)試，利用生物素標(biāo)記物微型生物素化試劑盒(Biotintagmicro biotinylation kit) (Sigma(西格瑪)，Poole,英國(guó))生物素化。生物素化的小鼠H460-16-2用于在存在不同濃度的競(jìng)爭(zhēng)抗體的條件下結(jié)合重組的人⑶44(R&D systems (R&D系統(tǒng))，Abingdon,英國(guó))。將重組人⑶44以處于0.05 M碳酸鹽緩沖液pH9.0 (Sigma(西格瑪)，Poole,英國(guó))中的5微克/mL,在+4°C,在免疫吸附96孔微滴定板(Nalge nunc,Hereford，英國(guó))上固定過(guò)夜。將生物素化的小鼠H460-1 6_2抗體稀釋到0.2微克/mL并與處于0-20微克/mL濃度范圍內(nèi)的等體積的競(jìng)爭(zhēng)抗體混合。⑶44板在PBS+0.05 %吐溫20中清洗3次。將100微升抗體混合物轉(zhuǎn)移到⑶44包被的板的孔中，并將其在室溫下溫育I小時(shí)。清洗該板，并且通過(guò)加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP綴合物(Sigma(西格瑪)，Poole,英國(guó))(以1: 500稀釋)和TMB底物(Sigma(西格瑪)，Poole,英國(guó))檢測(cè)結(jié)合的生物素化的小鼠H460-16-2。該測(cè)定在黑暗中顯影5分鐘，隨后通過(guò)加入3M HCl終止。然后在MRXTCII 板讀數(shù)器(Dynex Technologies (Dynex 技術(shù))，Worthing,英國(guó))中以 450nm 處的吸光度讀該測(cè)定板。吸光度相對(duì)測(cè)試抗體濃度作圖，以提供圖24中所示的圖表。顯示出，嵌合(ch) ARH460-16-2 (VK0VH0)抗體和2種人源化變體在與生物素化的H460-16-2抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合重組⑶44中與小鼠H460-16-2抗體等效。實(shí)施例10
確定鼠科H460-16-2和(hu) ARH460-16-2變體與rhCD44的結(jié)合親和性通過(guò)確定結(jié)合重組CD44(rhCD44)后各自的解離常數(shù)，比較Η460_16_2，(hu)ARH460-16-2變體I和(hu) ARH460-16-2變體2的結(jié)合親和性。利用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)程序固定重組人CD44/Fc (R&D Systems (R&D系統(tǒng))，Minneapolis，MN，美國(guó))。通過(guò)注射104微升0.4M EDC和0.1M NHS的1:1混合物(流速10微升/分鐘)激活CM5傳感器芯片(GE Healthcare (GE衛(wèi)生保健)，Piscataway，NJ美國(guó)以前的Biacore)的表面。以濃度20微克/mL(稀釋于IOmM乙酸鈉ρΗ5.5中)注射rhCD44以達(dá)到約500RU。最后，將119微升1.0M乙醇胺-HCL pH8.5注射到該表面上，從而封閉傳感器芯片表面上的任何未占據(jù)活化位點(diǎn)。注射不同濃度的H460-16-2，(hu)ARH460-16-2變體I或(hu)ARH460-16-2變體2。為了后繼注射再生傳感器芯片表面通過(guò)以50微升/分鐘的流速注射IOmM甘氨酸-HCl pH2.070秒實(shí)現(xiàn)。抗體稀釋在運(yùn)行緩沖液(HBS-EP+，GEHealthcare (GE 衛(wèi)生保健)，Piscataway, NJ 美國(guó)，以前的 Biacore)中并以 0.67_667nM 范圍內(nèi)的濃度連續(xù)注射，并在每個(gè)周期之間再生表面。作為對(duì)照，也在參考表面上注射各種抗體濃度，其不使得rh⑶44固定在該表面上。利用Biacore T100評(píng)估軟件1.1版，利用簡(jiǎn)單的1:1相互作用模型對(duì)獲得的sensograms進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)合和解離常數(shù)用于計(jì)算抗體的 KD。實(shí)驗(yàn)利用 Biacore T100 系統(tǒng)(GE Healthcare (GE 衛(wèi)生保健),Piscataway, NJ美國(guó)，以前的Biacore)進(jìn)行。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果關(guān)于鼠H460-16-2產(chǎn)生4.19 nM的數(shù)值，而發(fā)現(xiàn)(hu)ARH460-16-2 變體 HV1/KV1 和(hu) ARH460-16-2 變體 HV2/KV1 的 KD 分別為 6.32和3.17nM(圖25)。這些結(jié)果說(shuō)明所有抗體具有處于納摩爾范圍內(nèi)的KD，且人源化抗體的親和性類似于母體鼠H460-16-2的親和性。還將結(jié)合常數(shù)(Ka)和解離常數(shù)(Kd)列表(圖25)。
實(shí)施例11分離競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑給定抗體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制CDMAB，例如競(jìng)爭(zhēng)性抗體，其是一種識(shí)別相同表位的抗體(Belanger L 等頭 Clinica Chimica Acta4815_18 (1973))。一種方法需要(entails)用這樣的免疫原進(jìn)行免疫，所述免疫原表達(dá)被所述抗體識(shí)別的抗原。樣品可以包括，但不限于，組織、分離的蛋白或細(xì)胞系。得到的雜交瘤可以使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定進(jìn)行篩選，所述競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定是一種鑒定抑制測(cè)試抗體結(jié)合的抗體的測(cè)定，諸如ELISA，F(xiàn)ACS或蛋白質(zhì)印跡。另一種方法可以使用曬菌體展示抗體文庫(kù)，和淘選(panning)識(shí)別所述抗原的至少一個(gè)表位的抗體(Rubinstein JL等年度生物化學(xué)(Anal Biochem) 314:294-300 (2003) )0在每種情形中，基于抗體置換初始標(biāo)記抗體與其靶抗原的至少一個(gè)表位的結(jié)合的能力，選擇抗體。因此，這樣的抗體將如初始抗體一樣具有識(shí)別抗原的至少一個(gè)表位的特征。
實(shí)施例12克隆H460-16-2單克隆抗體的可變區(qū)以前確定了來(lái)自由H460-16-2雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈(Vh)和輕鏈的可變區(qū)序列(如S.N.11/364，013中所公開)。為了生成嵌合和人源化IgG，可以將可變輕和司變重結(jié)構(gòu)域亞克隆到合適的載體中表達(dá)(如以上實(shí)施例9中所公開)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，H460-16-2或其去免疫的、嵌合的或人源化的形式通過(guò)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)編碼所述抗體的核酸產(chǎn)生，從而表達(dá)并司以回收抗體。例如，抗體可以以促進(jìn)回收和純化的組織特異性方式表達(dá)。在一個(gè)該實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體表達(dá)在乳腺中，從而在哺乳期過(guò)程中分泌。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括但不僅限于小鼠、山羊和兔。(i)單克隆抗體使用常規(guī)方法容易地分離并測(cè)序編碼單克隆抗體(如以上實(shí)施例9中所公開)的DNA(例如，通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼所述單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核昔酸探針)。雜交瘤細(xì)胞作為這樣的DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，所述DNA可以置于表達(dá)載體內(nèi)，然后將其轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞中，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。也可以修飾所述DNA，例如，通過(guò)人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域編碼序列取代替換同源鼠序列。也可以使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法，包括涉及交聯(lián)劑的那些方法，體外制備嵌合抗體或雜交抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過(guò)形成硫醚鍵構(gòu)建免疫毒素。用于這一目的的適當(dāng)試劑的實(shí)例包括亞氨基硫羥酸鹽(iminothiolate)和甲基_4_巰基 butyrimidate。(ii)人源化抗體人源化抗體具有從非人來(lái)源引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“引入”的殘基，其典型地來(lái)自“引入的”可變結(jié)構(gòu)域。司以通過(guò)Winter及合作者的方法用嚙齒類CDRs或CDR序列取代相對(duì)應(yīng)的人抗體序列進(jìn)行人源化(Jones等，自然(Nature) 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，自然(Nature) 332:323-327(1988)；Verhoeyen 等，科學(xué)(Science) 239:1534-1536 (1988);在 Clark,今日免疫學(xué)(hmmunol.Today) 21:397-402(2000)中的綜述)。
可以通過(guò)使用母體和人源化序列的三維模型分析母體序列和多種概念人源化產(chǎn)物的方法而制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的和熟悉的。圖解和展示所選候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可獲得的。這些展示的觀察允許分析殘基在所述候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方式，可以從共有和引入序列中選擇FR殘基且組合FR殘基，以便獲得需要的抗體特征，如對(duì)靶抗原增加的親和性。通常，⑶R殘基直接且最顯著地(most substantially)參與影響抗原結(jié)合。(iii)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了生產(chǎn)抗體片段的各種技術(shù)。這些片段可以通過(guò)重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生(綜述于 Hudson,現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)(Curr.0pin.1mmunol.) 11:548-557 (1999) ；Little 等，今日免疫學(xué)(Immunol.Today) 21:364-370 (2000))。例如，F(xiàn)ab，-SH片段可以直接從大腸桿菌回收，并且化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab’)2片段(Carter等，生物技術(shù)(Biotechnology)IO:163-167(1992))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進(jìn)F(ab’)2分子的組裝而形成F(ab’)2。根據(jù)另一種方法，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離Fv，F(xiàn)ab或F(ab’ )2片段。

實(shí)施例13包括本發(fā)明的抗體的組合物本發(fā)明抗體可以用作預(yù)防/治療癌癥的組合物。所述包括本發(fā)明抗體的用于預(yù)防/治療癌癥的組合物可以作為它們采用液體制劑的形式施用，或作為適用于人或哺乳動(dòng)物(例如，大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、犬、猿猴、等等)的制劑的藥物組合物□服或腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、等等)施用。本發(fā)明抗體可以以本身施用，或可以作為適當(dāng)?shù)慕M合物施用。用于所述施用的組合物可以包含藥用載體，和本發(fā)明抗體或其鹽，稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用的藥物制劑的形式提供。用于腸胃外施用的組合物的實(shí)例是可注射制劑、栓劑等。可注射制劑可以包括這樣的劑型，諸如靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射，滴注，關(guān)節(jié)內(nèi)注射等等。這些可注別制劑可以通過(guò)公知方法制備。例如，可注射制劑可以通過(guò)將本發(fā)明抗體或其鹽溶解、混懸或乳化在常規(guī)用于注射的無(wú)菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中而制備。對(duì)于水性注射介質(zhì)，存在如生理鹽水，含有葡萄糖和其他輔助試劑的等滲溶液等，其可以與適當(dāng)?shù)脑鋈軇┤绱?例如乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如，聚山梨酸酯80，HC0-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50 moIs)加合物))等組合使用。對(duì)于油性介質(zhì)，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以與增溶劑如苯甲酸芐酯、苯甲醇等組合使用。這樣制備的注射劑通常裝在適當(dāng)?shù)陌碴持小Ｓ糜谥蹦c施用的栓劑可以通過(guò)將本發(fā)明抗體或其鹽與常規(guī)用于栓劑的基質(zhì)混合而制備。用于口服施用的組合物包括固體或液體制劑，具體為片劑(包括糖衣和薄膜包被的片劑)，丸劑、粒劑、粉末制劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳液、混懸液等。這樣的組合物通過(guò)公知方法制備，并且可以包含常規(guī)用在藥物制劑領(lǐng)域中的媒介物(vehicle)、稀釋劑或賦形劑(excipient)。用于片劑的媒介物(vehicle)或賦形劑(excipient)的實(shí)例包括乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。有利地，將上述用于口服或腸胃外應(yīng)用的組合物制備成適于符合活性成分劑量的單位劑量的藥物制劑。所述單位劑量制劑包括，例如，片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓齊U、等等。所包含的前述化合物的量通常為5-500mg/劑量單位形式；優(yōu)選地特別是在注射液形式中含有約5-約IOOmg的上述抗體，并且對(duì)于其他形式含有10-250mg的上述抗體。前述包括本發(fā)明抗體的預(yù)防性/治療性藥劑或調(diào)節(jié)劑的劑量可以取決于下列各項(xiàng)而不同:被施用的受試者，目的疾病，病癥，施用途徑等等。例如，當(dāng)用于治療/預(yù)防目的時(shí)，例如，治療/預(yù)防成年人中的乳腺癌時(shí)，有利地以約0.01-約20mg/kg體重、優(yōu)選地約
0.1-約10mg/kg體重且更優(yōu)選地約0.1-約5mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的抗體，約1-5次/天，優(yōu)選約1-3次/天。在其他腸胃外和口服施用中，所述藥劑可以以與上述劑量相對(duì)應(yīng)的劑量施用。當(dāng)病癥特別嚴(yán)重時(shí)，可以依據(jù)病癥增加劑量。本發(fā)明抗體可以以其自身或以適當(dāng)組合物的形式施用。用于施用的組合物可以包含藥用載體與前述抗體或其鹽，稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用(例如，血管內(nèi)注射、皮下注射等)的藥物制劑的形式提供。上述每種組合物還可以包含其他活性成分。此外，本發(fā)明抗體可以與其他藥劑聯(lián)合使用，所述其他藥劑例如烷基化試劑(例如，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide),等)，代謝拮抗劑(例如，甲氨喋呤，5_氟尿喃啶，等)，抗腫瘤抗生素 (例如，絲裂霉素，阿霉素，等)，植物來(lái)源的抗腫瘤藥(例如，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛，泰素，等)，順鉬，卡鉬，依托泊苷，伊立替康，等。本發(fā)明抗體和上述藥物可以同時(shí)或以交錯(cuò)的次數(shù)施用給患者。本文中所述的治療方法，特別是對(duì)于癌癥的，也可以同施用其他抗體或化療劑進(jìn)行。例如，也可以施用針對(duì)EGFR的抗體，諸如ERBITUX (西妥昔單抗(cetuximab))，特別是當(dāng)治療結(jié)腸癌時(shí)。ERBITUX 還顯示出有效治療銀屑病。其他組合使用的抗體包括Herceptin (曲妥單抗)(特別是當(dāng)治療乳腺癌時(shí))，AVASTINk (特別是當(dāng)治療結(jié)腸癌時(shí))，和SGN-15 (特別是當(dāng)治療非-小細(xì)胞肺癌時(shí))。施用本發(fā)明的抗體和其他抗體/化療劑可以同時(shí)，或者分別，通過(guò)相同或不同的途徑進(jìn)行。使用的化療劑/其他抗體方案包括認(rèn)為最佳適合于治療患者病癥的任何方案。不同的惡性腫瘤可以需要使用特異性抗-腫瘤抗體和特異性化療劑，所述特異性抗-腫瘤抗體和特異性化療劑應(yīng)該基于具體患者確定。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，化學(xué)治療與抗體治療同時(shí)，或更優(yōu)選地，化學(xué)治療在抗體治療后施用。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明不局限于任何具體的施藥方法或途徑。證據(jù)的優(yōu)勢(shì)表明H460-16-2、(ch)ARH460-16-2_IgG2 和(ch)ARH460-16-2_IgGl通過(guò)與⑶44上存在的表位連接而介導(dǎo)抗癌作用。以前還顯示，(如在S.N.10/647，818，現(xiàn)在的美國(guó)專利7，189，397中公開地)H460-16-2抗體可以用于從表達(dá)細(xì)胞諸如MDA-MB-231細(xì)胞免疫沉淀關(guān)聯(lián)抗原。此外，司以表明，H460-16-2，(ch)ARH460-16-2-1gG2, (ch)ARH460-16-2-1gGl, (ch) ARH460-16-2 (VKOVHO)或人源化變體，(hu)ARH460-16_2 可以用于檢測(cè)表達(dá)與其特異性結(jié)合的⑶44抗原部分的細(xì)胞和/或組織；這使用所示的但不限于FACS、細(xì)胞ELISA或IHC的技術(shù)。如用H460-16-2抗體，其他抗⑶44抗體司以用于免疫沉淀和分離⑶44抗原的其他形式，且抗原也司以用于利用相同類型的測(cè)定抑制那些抗體與表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織的結(jié)合。SEQ ID NOs
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體，其中所述單克隆抗體包括SEQIDNO:7的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 或其人⑶44結(jié)合片段。
2.有效治療人腫瘤的組合物，包括處于組合形式的: 權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段； 所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自由細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分和造血細(xì)胞組成的組中的成員的綴合物；和 需要量的藥用載體； 其中所述組合物有效治療所述人腫瘤。
3.有效治療人腫瘤的組合物，包括處于組合形式的: 權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段；和需要量的藥用載體； 其中所述組合物有效治療所述人腫瘤。
4.有效治療人腫瘤的組合物，包括處于組合形式的: 權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段與選自由細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分和造血細(xì)胞組成的組中的成員的綴合物；和 需要量的藥用載體； 其中所述組合物有效治療所述人腫瘤。
5.用于檢測(cè)人癌性腫瘤存在的測(cè)試試劑盒，其中所述人癌性腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求I的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述試劑盒包括權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段，和用于檢測(cè)所述單克隆抗體或其片段是否結(jié)合多肽的工具，所述多肽以特定截?cái)嗨降拇嬖谠\斷所述人癌性腫瘤的存在。
6.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減少的量的權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于在哺乳動(dòng)物中減少人腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
9.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
10.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
11.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減少的量的權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于在哺乳動(dòng)物中減少易受抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用影響的人腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
12.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
13.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
14.權(quán)利要求11 的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
15.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
16.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減少的量的權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段和至少一種化療劑在制備用于在哺乳動(dòng)物中減少人腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用，其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
17.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
18.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
19.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
20.權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
21.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的人腫瘤負(fù)荷減少的量的權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于減少人腫瘤負(fù)荷的藥物中的應(yīng)用，其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求I的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
22.權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
24.權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
25.權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
26.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的人腫瘤負(fù)荷減少的量的權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段和至少一種化療劑在制備用于減少人腫瘤負(fù)荷的試劑盒中的應(yīng)用，其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要 求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
27.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
28.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
29.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
30.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
31.至少一種權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于減少人腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤表達(dá)與所述人源化抗體或其片段特異性結(jié)合的人CD44抗原的至少一個(gè)表位， 其中所述至少一種人源化抗體或其片段用于施用給患有所述人腫瘤的個(gè)體， 其中所述一個(gè)或多個(gè)表位的結(jié)合導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的減少。
32.至少一種權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段聯(lián)合至少一種化療劑在制備用于減少人腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用，所述腫瘤表達(dá)與所述人源化抗體或其片段特異性結(jié)合的人CD44抗原的至少一個(gè)表位，其中所述至少一種人源化抗體或其片段聯(lián)合至少一種化療劑用于向患有所述人腫瘤的個(gè)體施用， 其中所述施用導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的減少。
33.至少一種權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于確定被所述人源化抗體或其片段特異性結(jié)合的選自人腫瘤的組織樣品中癌細(xì)胞的存在的診斷劑中的應(yīng)用， 其中至少一種所述人源化抗體或其片段用于與來(lái)自所述人腫瘤的組織樣品相接觸以確定所述至少一種提供的抗體或其片段與所述組織樣品的結(jié)合； 由此指示所述癌性細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。
34.權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于確定表達(dá)被所述人源化抗體或其片段特異性識(shí)別的CD44的細(xì)胞的存在的診斷劑中的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段用于與細(xì)胞樣品相接觸以確定所述人源化抗體或其片段與所述細(xì)胞樣品的結(jié)合； 由此確定表達(dá)被所述人源化抗體或所述其片段特異性結(jié)合的CD44的抗原的細(xì)胞的存在。
35.至少一種權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于確定特異性結(jié)合所述人源化抗體或其片段的靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織樣品中細(xì)胞存在的診斷劑中的應(yīng)用， 其中至少一種所述提供的抗體或其片段用于與來(lái)自所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的組織樣品相接觸以確定所述至少一種提供的抗體或其片段與所述組織樣品的結(jié)合； 由此指示所述組織樣品中存在所述癌細(xì)胞。
36.權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于減少癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的藥物中的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)CD44的至少一個(gè)表位，所述至少一個(gè)表位，在與所述人源化抗體或由 所述人源化抗體產(chǎn)生的片段結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞毒作用，其中所述人源化抗體或片段用于接觸所述癌細(xì)胞，由此細(xì)胞毒性作為所述人源化抗體或所述其片段與所述⑶44的至少一個(gè)表位結(jié)合的結(jié)果發(fā)生。
37.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
38.權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
39.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述人源化抗體激活補(bǔ)體。
40.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述人源化抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒作用。
41.權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段在制備用于減少癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的藥物中的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)CD44的至少一個(gè)表位，所述至少一個(gè)表位，在與所述人源化抗體或其片段結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞毒作用， 所述人源化抗體或所述片段用于與所述癌細(xì)胞相接觸， 由此細(xì)胞毒性作為所述人源化抗體或所述片段與所述CD44的至少一個(gè)表位結(jié)合的結(jié)果發(fā)生。
42.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減少的量的特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段在制備用于在哺乳動(dòng)物中減少人腫瘤的藥物中的應(yīng)用， 其中所述單克隆抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
43.權(quán)利要求42的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
44.權(quán)利要求43的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
45.權(quán)利要求42的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
46.權(quán)利要求42的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
47.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減少的量的特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段在制備用于在哺乳動(dòng)物中減少易受抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用影響的人腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述單克隆抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
48.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
49.權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
50.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
51.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
52.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減少的量的特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段和至少一種化療劑在制備用于在哺乳動(dòng)物中減少人腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用， 其中所述單克隆抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
53.權(quán)利要求52的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
54.權(quán)利要求53的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
55.權(quán)利要求52的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
56.權(quán)利要求52的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
57.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的人腫瘤負(fù)荷減少的量的特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段在制備用于減少人腫瘤負(fù)荷的藥物中的應(yīng)用， 其中所述單克隆抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氮基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氮基酸序列； 其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
58.權(quán)利要求57的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
59.權(quán)利要求58的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
60.權(quán)利要求57的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
61.權(quán)利要求57的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
62.有效導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的人腫瘤負(fù)荷減少的量的特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段和至少一種化療劑在制備用于減少人腫瘤負(fù)荷的試劑盒中的應(yīng)用， 其中所述單克隆抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 其中所述人腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合權(quán)利要求1的人源化抗體或人CD44結(jié)合片段的抗原的至少一個(gè)表位，其中所述片段的特征在于競(jìng)爭(zhēng)抑制所述人源化抗體與其靶抗原結(jié)合的能力。
63.權(quán)利要求62的應(yīng)用，其中所述人源化抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
64.權(quán)利要求63的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
65.權(quán)利要求62的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段激活補(bǔ)體。
66.權(quán)利要求62的應(yīng)用，其中所述人源化抗體或其片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
67.至少一種特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段在制備用于減少人腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤表達(dá)與所述人源化抗體或其片段特異性結(jié)合的人CD44抗原的至少一個(gè)表位， 其中所述單克隆抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 其中所述至少一種人源化抗體或其片段用于施用給患有所述人腫瘤的個(gè)體， 其中所述一個(gè)或多個(gè)表位的結(jié)合導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的減少。
68.至少一種特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段聯(lián)合至少一種化療劑在制備用于減少人腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用，所述腫瘤表達(dá)與所述人源化抗體或其片段特異性結(jié)合的人CD44抗原的至少一個(gè)表位， 其中所述單克隆抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 其中所述至少一種人源化抗體或其片段聯(lián)合至少一種化療劑用于向患有所述人腫瘤的個(gè)體施用， 其中所述施用導(dǎo)致腫瘤負(fù) 荷的減少。
69.有效治療人腫瘤的組合物，包括處于組合形式的: 人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段； 所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自由細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分和造血細(xì)胞組成的組中的成員的綴合物；和需要量的藥用載體； 其中所述組合物有效治療所述人腫瘤， 其中所述抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
70.有效治療人腫瘤的組合物，包括處于組合形式的: 人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段和需要量的藥用載體； 其中所述組合物有效治療所述人腫瘤， 其中所述抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
71.有效治療人腫瘤的組合物，包括處于組合形式的: 人源化抗體或其人CD44結(jié)合片段與選自由細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分和造血細(xì)胞組成的組中的成員的綴合物；和需要量的藥用載體； 其中所述組合物有效治療所述人腫瘤， 其中所述抗體包括SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
全文摘要
CD44，即單鏈透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合糖蛋白，其表達(dá)在多種正常組織、全部造血細(xì)胞和若干癌癥組織中。針對(duì)來(lái)自雜交瘤H460-16-2的CD44的單克隆抗體，以前顯示為是減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)，在癌癥模型包括前列腺癌和乳腺癌中通過(guò)細(xì)胞毒性抑制腫瘤生長(zhǎng)和減小腫瘤負(fù)荷，所述雜交瘤H460-16-2以保藏號(hào)PTA-4621保藏在ATCC中。還分離和測(cè)序了該單克隆抗體的可變區(qū)，從而制備具有比該單克隆抗體提高的抗癌活性的嵌合抗體。現(xiàn)在制備與母體PTA-4621單克隆抗體具有相似CD44結(jié)合活性的人源化抗體。所述單克隆、嵌合和人源化抗體可以與毒素、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報(bào)告部分和造血細(xì)胞綴合，從而治療癌癥。這些抗體還用在結(jié)合測(cè)定中以確定CD44在細(xì)胞上的表達(dá)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK103204934SQ20131002994
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者戴維·S·F·楊, 海倫·P·芬德利, 蘇珊·E·哈恩, 莉薩·M·切凱托, 福爾圖娜塔·麥康基 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司