專利名稱：抗肌抑素單鏈抗體及其編碼基因、表達載體、重組轉化子和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種抗肌抑素單鏈抗體及其編碼基因、表達載體、重組轉化子和應用。
背景技術：
畜禽肉產品是人類主要動物性食品之一。隨著人們生活水平的不斷提高，消費者對畜禽肉產品的需求日益增加。提高動物產肉性能一直是動物生產研究人員所努力的目標。但目前通過傳統的遺傳改良和營養調控手段來提高動物生產性能已很難再有大的進展。為了提高動物的生產性能，在飼料中添加各種違禁藥物造成食物中毒甚至死亡的事件時有發生，因而研究一種安全、高效、對人類無毒副作用的提高動物生產性能的制劑或產品是目前養殖業所面臨的迫切問題。
人類骨骼肌萎縮是目前世界上比較常見的肌肉疾病，肌肉萎縮可發生于多種生理、病理條件下，如衰老，惡病質，燒傷，肌肉廢棄等，主要表現為肌肉體積的縮小，肌細胞數量的減少，肌細胞內蛋白質含量降低等。
動物的產肉性能或人的肌肉發育總是由促進和抑制兩類激素或因子聯合控制的。如果把免疫學的方法應用于動物或人肌肉發育的調控，選擇對肌肉發育有抑制作用的激素或因子作為研究對象，體外制備這些激素或因子的抗體，對動物或人進行被動免疫，從而抑制或減弱該類激素或因子的生理功能，進而提高動物的產肉性能或治療人類肌肉萎縮。
肌抑素(Myostatin，MSTN，GenBank號:ΝΜ_005259.2)又稱⑶F_8 (GrowthDifferentiation Factor8,生長分化因子8),屬于TGF-β超家族，其僅在骨骼肌中特異表達并分泌至血漿中，是影響骨骼肌生長發育的抑制因子。
肌抑素首先以一個376個氨基酸組成的前體非活性形式產生，含有N端的前體肽和C端成熟肽，經兩步蛋白酶切后，兩個C端亞基通過一個多肽鏈分子間二硫鍵形成一個具生物學活性的雙亞基成熟肌抑素，同時兩個亞基的其余半胱氨酸殘基形成經典的半胱氨酸結。成熟肽的氨基酸序列在人類 、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、馬、雞和狗間的同源性均是100%。
該基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。該基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。該基因天然缺失的比利時藍牛被稱為“雙肌牛”。該基因的缺失只影響骨骼肌的發育，對心肌、平滑肌等沒有任何影響，不對動物的其它性能產生危害，牛自然狀態下的雙肌現象證明了這一點。因而肌抑素阻斷劑在農業畜禽生產方面具有巨大的應用前景。同時，由于阻斷肌抑素信號通路還有望緩解許多疾病伴隨的肌肉萎縮癥狀，因此肌抑素阻斷劑同樣在肌肉萎縮藥物研究方面具有重要的應用前景。目前已經有關于肌抑素結合蛋白或其通路阻斷劑的研究，以期用于農業及醫藥生產。這些肌抑素拮抗劑包括:肌肉抑制劑結合蛋白、外源競爭性可溶肌抑素受體、肌抑素特異性單克隆抗體、肌抑素抗原蛋白、針對肌抑素的RNAi和DNA疫苗等。但上述拮抗劑均存在分子量大、組織穿透性差、免疫原性強等不足之處，在使用多次后會引發動物或人產生特異免疫反應，從而大大限制了其運用。而RNAi和DNA疫苗的穩定性和安全性差，應用效果不理想。
通過抗體工程技術來克服上述不足，用完全人源化或者畜禽來源的序列構建單鏈抗體或單結構域抗體，可以消除潛在的抗免疫球蛋白的特異免疫反應。單鏈抗體由于其分子量小而具有較強的組織穿透力，免疫原性也比單克隆抗體的大大降低，進而極大地減少了產生抗免疫球蛋白特異免疫反應的可能性。同時由于單鏈抗體與抗原的結合位點沒有改變，其抗體親和力不會因為分子量降低而變弱。此外，單鏈抗體還可通過常規基因重組技術在體外工程菌等生物反應器大量獲得，與單克隆抗體生產相比大大降低了成本，因此無論在治療人類肌肉萎縮及提高動物生產性能方面均具有很好的應用前景。
目前關于單鏈抗體的研究主要是針對細菌或病毒的抗原，通過制備相應的單鏈抗體來中和這些致病細菌或病毒。細菌或病毒是原核生物，其表達的膜抗原等結構簡單，針對這些抗原的單鏈抗體的制備也較方便。但高等動物的內源性激素或因子往往是蛋白肽鏈經過各種折疊及二硫鍵相連等形成的具高級結構的多維蛋白，如肌抑素單體蛋白必須通過二硫鍵形成二聚體后才有生物活性。因此目前尚未發現針對內源性激素的單鏈抗體的相關研究。發明內容
本發明提供了一種抗肌抑素單鏈抗體，免疫原性低，與肌抑素親和力強，并可在大腸桿菌中高效表達。
一種抗肌抑素單鏈抗體，包括重鏈可變區、輕鏈可變區和連接肽，所述重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
該抗肌抑素單鏈抗體分子量小，組織穿透力強，免疫原性低、抗體對肌抑素親和力強。
適宜的連接肽可避免影響抗體蛋白的折疊及其水溶性。本發明所選用的連接肽為(Gly4Ser)4,氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
本發明還提供了編碼所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因。該編碼抗肌抑素單鏈抗體的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，經大腸桿菌喜愛的密碼子設計優化得到，適宜在大腸桿菌中表達 ，避免了因大腸桿菌的密碼子偏好導致的抗肌抑素單鏈抗體翻譯效率和表達水平低的問題。
本發明還提供了包含所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因的表達載體。
構建表達載體時，選用的原始載體可以為pET_30a(+)。
本發明還提供了包含所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因的重組轉化子。
本發明所述的抗肌抑素單鏈抗體，由包含所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因的重組轉化子在16 18° C，180 220r/min，誘導表達30 38h后得到。
采用低溫、長時誘導表達的方案進行抗肌抑素單鏈抗體可溶性誘導表達，這樣蛋白產物不會形成包涵體，不需經過蛋白變性復性的過程，可使蛋白保持天然活性。
優選的，誘導表達的溫度為18°C，轉速為200r/min，時間為36h。
構建重組轉化子，即將重組表達載體轉化至宿主菌中。所述的宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
本發明還提供了所述的抗肌抑素單鏈抗體在制備肌肉萎縮藥物中的應用。
本發明還提供了所述的抗肌抑素單鏈抗體在制備動物增重藥物中的應用。
MSTN基因的缺失或阻斷只影響骨骼肌的發育，對心肌、平滑肌等沒有任何影響，不對動物的其它性能產生危害，牛自然狀態下的雙肌現象證明了這一點。因此，將抗肌抑素單鏈抗體作為肌抑素拮抗劑，制備動物增重藥物，可促進肌肉發育，中和肌抑素對肌肉發育的抑制作用，促進成肌細胞增殖及肌細胞生長分化，增加肌肉產量，提高動物的生產性能。
本發明抗肌抑素單鏈抗體為抗人源肌抑素單鏈抗體，可以用來中和肌抑素對肌肉發育的抑制作用。由于肌抑素成熟肽的氨基酸序列在人類、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、馬、雞和狗間的同源性均是100%，因此本發明所研制的抗肌抑素單鏈抗體適用于人類及上述各類動物。
與現有技術相比，本發明的有益效果為:
本發明抗肌抑素單鏈抗體是世界上首例能夠中和內源抑制性激素-肌抑素的單鏈抗體，抗體分子量小，組織穿透力強，免疫原性低、抗體親和力強。
本發明抗肌抑素單鏈抗體可在大腸桿菌中大規模表達生產，成本低。


圖1a為RNAstructure software預測的優化前單鏈抗體序列的mRNA 二級結構；
圖1b為RNAstructure software預測的優化后單鏈抗體序列的mRNA 二級結構；
圖1c為Vienna RNA web server software預測的優化前單鏈抗體序列的mRNA二級結構；
圖1d為Vienna RNA web server software預測的優化后單鏈抗體序列的mRNA二級結構；
圖2a為SOE-PCR合成全長單鏈抗體(scFv)基因示意圖2b為單鏈抗體全基因合成后的DNA電泳結果；
其中，E:含 scFv 的重組質粒酶切圖；M =Marker ;F1_10 =Fl-1O 片段；F9_20:F9_20片段；scFv:單鏈抗體全基因；
圖3a為抗肌抑素單鏈抗體的SDS-PAGE電泳；
其中，各列從左向右分別為:蛋白Marker (kD);陽性菌株的裂解液上清；陽性菌株的裂解液沉淀；純化的單鏈抗體；
圖3b為抗肌抑素單鏈抗體的Western blot檢測其中，各列從左向右分別為:蛋白Marker ;單鏈抗體；
圖4為ELISA檢測純化后的單鏈抗體與肌抑素的`親和力(n=5)；
其中，scFv:單鏈抗體為結合100 μ L0.4 μ g/mL肌抑素所需要的單鏈抗體的中間有效濃度EC50 ；
圖5a為MTT法檢測單鏈抗體對鼠成肌細胞C2C12增殖的影響(n=5)；
圖5b為MTT法檢測單鏈抗體對鼠成肌細胞C2C12增殖的影響(n=5)；
其中，圖5a和圖5b中，不同的小寫字母代表差異顯著(P〈0.05)，不同的大寫字母代表差異極顯著(P〈0.01)；
圖6為單鏈抗體對小鼠成肌細胞數量的影響；
其中，各圖中的比例尺是100 μ m。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡釋。
實施例1抗肌抑素單鏈抗體的設計、拼接及密碼子優化
根據已公開專利(ChinER,等.Antibodies to myostatin.USA patentNo:7807159.10/05/2010.http://www.patentstorm, us/patents/7807159/full text,ht ml)的抗肌抑素單克隆抗體序列，將 其重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)通過(Gly4Ser) Jinker 連接成 ‘VH-linker-VL’，稱為優化前DNA序列(SEQ ID N0.27)，然后據此DNA序列推出相應的氨基酸序列(SEQ ID N0.26)，再根據該氨基酸序列和大腸桿菌密碼子偏愛性、GC含量、mRNA 二級結構穩定性等優化出核苷酸序列(序列優化由上海生工公司完成)，為優化后DNA序列(SEQ ID N0.4)。
將優化前后的DNA序列用OPTIMIZER服務器比較其序列同源性、GC含量、CAI (密碼子適用指數，Codon Adaptation Index)值(Puigb6P,等 _0PTIMIZER:aweb server for optimizing the codon usage of DNA sequences.NucleicAcids Res, 2007, 35 (Web Server issue): W126-W131 )、mRNA 二級結構(Do CB,等.CONTRAfold:RNA secondary structure prediction without physics-based models.Bioinformatics, 2006, 22:e90-e98 ；Gruber AR,等.The vienna RNA websuite.NucleicAcids Res, 2008，36:W70-W74)等(見表 I 和圖1)。
表I單鏈抗體(VH-linker-VL)氨基酸序列及優化前后核苷酸序列比對
權利要求
1.一種抗肌抑素單鏈抗體，包括重鏈可變區、輕鏈可變區和連接肽，其特征在于，所述重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
2.如權利要求1所述的抗肌抑素單鏈抗體，其特征在于，所述連接肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3 所示。
3.編碼如權利要求1或2所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因。
4.包含如權利要求3所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因的表達載體。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，原始載體為pET-30a(+)。
6.包含如權利要求3所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因的重組轉化子。
7.如權利要求1或2任一項所述的抗肌抑素單鏈抗體，其特征在于， 由包含所述的抗肌抑素單鏈抗體的基因的重組轉化子在16 18° C，180 220r/min,誘導表達30 38h后得到。
8.如權利要求7所述的抗肌抑素單鏈抗體，其特征在于，所述重組轉化子的宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
9.如權利要求1或 2任一項所述的抗肌抑素單鏈抗體在制備肌肉萎縮藥物中的應用。
10.如權利要求1或2任一項所述的抗肌抑素單鏈抗體在制備動物增重藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗肌抑素單鏈抗體及編碼基因、表達載體、重組轉化子和應用，該抗肌抑素單鏈抗體包括重鏈可變區、輕鏈可變區和連接肽，所述重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發明還提供了所述的抗肌抑素單鏈抗體的編碼基因、表達載體和重組轉化子。本發明還提供了所述的抗肌抑素單鏈抗體在制備肌肉萎縮藥物或動物增重藥物中的應用。本發明抗肌抑素單鏈抗體可在大腸桿菌中大規模表達生產，成本低，且該抗肌抑素單鏈抗體分子量小，組織穿透力強，免疫原性低、抗體親和力強。
文檔編號A61K39/395GK103145836SQ201310046330
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月7日 優先權日2013年2月7日
發明者牛冬, 吳兵兵, 袁陶燕, 齊瑞利, 何俊 申請人:浙江大學