一種cea陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明涉及免疫學領域,具體公開了一種腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備樹突狀細胞腫瘤疫苗的方法，a.構建載有CEA抗原肽基因的穿梭載體質粒，并利用293細胞包裝成載有CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA,b.DC細胞的分離,培養和鑒定,c.利用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得AdCEA-DC疫苗,c.AdCEA-DC疫苗的細胞學實驗。本發明利用腺病毒作為基因載體，將CEA抗原肽基因高效轉入DC細胞，通過內源性內持續刺激獲得了具有高效呈遞癌胚抗原CEA抗原肽能力的DC疫苗，并可以誘導特異性的CTL，解決了現有技術獲得的DC疫苗呈遞抗原能力較弱，特異性不強的問題。
【專利說明】一種CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學領域。具體涉及了一種腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的方法。
【背景技術】
[0002]胃癌和大腸癌是目前我國發病率很高的惡性腫瘤，胃癌占消化道惡性腫瘤的第一位，大腸癌發病率已經上升到第四位。目前大腸癌，胃癌首選的有效治療方法仍是手術切除，但切除率較低，復發轉移較高。術后綜合治療以放療，化療為主，但毒副作用大，患者往往難以接受。因此，胃癌和大腸癌預后欠佳，需要尋找新的更有效的治療方法。
[0003]隨著科學的不斷進展，腫瘤的生物治療異軍突起，已經成了繼手術，放療，化療后的第四大腫瘤治療技術，在改善患者生存質量，降低復發率方面的重要作用已經得到越來越多的認可和重視。樹突細胞(dendritic cells, DC)是人體內功能最強大的專職抗原呈遞細胞(antigen process cells, APC),能誘導出抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反應,在人體抗腫瘤免疫中發揮著重要的作用。DC細胞表面的MHC分子可以和腫瘤抗原結合，然后遞呈給T細胞，誘導T細胞活化，激活初始免疫應答，在體內發揮免疫監視功能。因此自從DC強大的遞呈抗原功能被發現以來，就得到了人們的廣泛關注，目前國內外圍繞以DC為核心的抗腫瘤免疫治療研究積累了大量的經驗。不過盡管以DC為基礎的免疫治療副作用輕微，能誘導出一定的抗腫瘤免疫反應，多數研究所獲得的臨床效果還是 有限。
[0004]癌胚抗原(CEA)是一種廣為人知的廣譜腫瘤標志物。最早是在1965年由加拿大學者Gold和Freedman首先從胎兒結腸及結腸癌的提取物中發現，在多種類型的腫瘤上都有表達。人們把有CEA表達的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現出復雜的表達模式，尤其是CEA表現出選擇性的上皮細胞表達。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達遠遠高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機體免疫系統產生針對CEA的免疫應答，故而人們一直尋求多種途徑增強CEA的免疫原性。
[0005]癌胚抗原(CEA)是一種廣為人知的廣譜腫瘤標志物。最早是在1965年由加拿大學者Gold和Freedman首先從胎兒結腸及結腸癌的提取物中發現，在多種類型的腫瘤上都有表達。人們把有CEA表達的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現出復雜的表達模式，尤其是CEA表現出選擇性的上皮細胞表達。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達遠遠高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機體免疫系統產生針對CEA的免疫應答，故而人們一直尋求多種途徑增強CEA的免疫原性。
[0006]目前腫瘤的基因治療也已經成了一個熱點。腺病毒是一種DNA雙鏈無包膜病毒，基因組為36kb，基因背景清楚，在美國應用多年，證明對人體是無害的。腺病毒載體以其宿主范圍廣，轉染效率高，不整合到宿主基因組中，僅瞬時表達，安全性高，易制備高滴度腺病毒等優點而成為人類基因治療中最理想的病毒載體之一。一般將El或E3基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體，El基因缺失喪失復制能力，但可以在El補償細胞如293細胞中復制。

【發明內容】

[0007]針對現階段應用常規方法所誘導的DC細胞受腫瘤免疫抗原性強度影響大，免疫激發力較弱等方面的不足。本發明提供了一種腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備DC細胞疫苗的方法，使獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗具有更強的免疫激發能力，并且不需要制備腫瘤抗原，讓DC疫苗的制備不再受腫瘤細胞來源較少，抗原蛋白成本較高的限制。
[0008]為實現上述目的，設計一種一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，該方法由以下步驟組成:
a.構建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA；
b.分離和培養DC細胞；
c.采用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC。
[0009]在所述的步驟(a)中將載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉染293細胞，培養至出毒，得到原代毒種；用原代毒種感染293細胞，待2-3天細胞病變后，進行濃縮純化，獲得擴增后的重組腺病毒AD-CEA。
[0010]在所述的步驟(b)中的DC細胞包括下列細胞:外周血單個核細胞培養的DC細胞，骨髓來源的DC細胞，臍帶血來源的DC細胞。
[0011]在所述的步驟(C)中，包括以下步驟:
Cl:采用步驟A中制備的重組腺病毒AD-CEA病毒液感染步驟B中制備的DC細胞；
C2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培養液，于37°C，5%C02的培養箱中繼續培養步驟Cl中感染后的DC細胞；
C3:到第5天，在步驟C2中培養的DC細胞中加入TNF-α，繼續培養3天，第8天獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗AdCEA-DC，光鏡下形態學鑒定，并用流式細胞儀檢測細胞表型 CDla，CD80，CD83，CD86，HLA-DR0
[0012]所述的步驟A中所述的重組腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，該病毒缺失El區和E3區，并且在El區位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表達盒，該表達盒依次包括:啟動子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因編碼序列，聚腺苷酸信號序列。
[0013]所述的步驟A中所述的癌胚抗原CEA抗原肽，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所
/Jn ο
[0014]所述的步驟C中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，是通過腺病毒為載體將癌胚抗原CEA抗原肽基因轉入DC細胞中獲得的，可以表達癌胚抗原CEA抗原肽基因。
[0015]所述的步驟C獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA_DC，CEA抗原肽基因陽性表達率在20%-100%。
[0016]所述的步驟C中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC可誘導出對CEA表達陽性腫瘤細胞有特異性殺傷作用的CTL。
[0017]根據本發明，所述的載有CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA是通過AdMax系統包裝得到的。所述的DC細胞是采用Ficoll密度梯度離心法分離收集人的外周血單個核細胞，培養l_2h后棄取懸浮細胞，留下貼壁細胞得到的。所述的GM-GSF的濃度為1000U/mL，IL-4的濃度為1000U/mL，TNF-a的濃度為200U/mL。從用腺病毒AD-CEA感染分離到的DC細胞到CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC的成熟需培養8天。
[0018]與現有技術相比，本發明創新優越之處有以下幾點:首先，首次使用腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備樹突狀細胞，獲得了 CEA陽性腫瘤特異性的DC疫苗；其次，所使用的癌胚抗原CEA抗原肽基因相對CEA全長基因選擇了有效序列，具有更強的特異性；再者，只是將腺病毒作為一個載體來轉染DC細胞，獲得成熟的DC疫苗后再用于人體，避免了腺病毒作為基因藥物直接用于人體可能導致的不良免疫反應；另外，轉入DC細胞的抗原基因可以持續內源表達腫瘤抗原，使本發明具有強大的免疫激發能力，可以克服腫瘤抗原直接刺激DC細胞后由于抗原復合物降解對誘導T細胞免疫應答產生的不利影響；而且，不需要制備腫瘤抗原致敏DC細胞，省去了制備抗原的成本，并且對于僅能獲得少量腫瘤細胞，無法大量制備抗原的患者，更具有實用意義；最后，轉入的基因具有腫瘤特異性，可避免自身抗原刺激DC細胞造成自身免疫疾病的風險。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是質粒TOC316的圖譜。 [0020]圖2是腺病毒AD-CEA的產毒照片，細胞變圓，成葡萄狀。
[0021]圖3是普通DC和本方法所制備的CEA陽性腫瘤特異性疫苗AdCEA-DC的光鏡圖片；圖A為對照組DC，圖B為AdCEA-DC，AdCEA-DC表現出成熟DC的形態，和對照組DC差別不大，更傾向于聚集。
[0022]圖4是流式細胞儀分析三組DC細胞的表面標志表達情況，本發明制備的DC疫苗AdCEA-DC的⑶80，⑶83，⑶86，⑶la，HLA-DR等表面標志表達高于蛋白致敏組和未致敏對照組。
[0023]圖5是不同組DC細胞誘導的CTL對LoVo，SW620, HGC-27，BEL-7402等腫瘤細胞的殺傷活性，我們所發明方法制備的疫苗AdCEA-DC對這些CEA陽性腫瘤細胞的殺傷活性更高。*代表和對照DC組相比有顯著差異，**代表和對照DC組相比有極顯著差異。
【具體實施方式】
[0024]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本發明進行進一步詳細說明；本申請中的生產設備都是本領域的常用設備，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0025]實施例1:
(一)構建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA:
1.構建含有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質粒H)C316-CEA:CEA的氨基酸序列來自GeneBank公布的CEA氨基酸和核苷酸序列M17303，根據本公司的預測結果，選擇癌胚抗原CEA抗原肽為CEA580-CEA639短肽片段基因，共60個氨基酸，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所示。
[0026]根據GeneBank中的序列設計引物，進行PCR獲得癌胚抗原CEA抗原肽基因，和PDC316質粒【圖1】連接獲得含有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質粒H)C316-CEA。
[0027]2.將構建的穿梭質粒H)C316-CEA和腺病毒骨架質粒轉染293細胞，具體步驟如下:
(1)提前一天將293細胞種6孔板，每孔5X105cells/mL密度的細胞2mL，這樣到轉染前293細胞的密度約為80% ；
(2)每個轉染孔取腺病毒骨架質粒4μ g，PDC316-CEA穿梭載體質粒I μ g，加300 μ LOpt1-mem無血清培養基混合均勻，室溫放置5min ；
(3)取10μ L脂質體Lipofectamine2000用300 μ L Opt1-mem無血清培養基混合均勻，室溫放置5min ；
(4)將兩者混合，室溫放置20min，再將混合物加入細胞中。放在37°C,5% C02培養箱中孵育；
(5)6小時后，更換新鮮的5%血清DMEM培養基。
[0028]3.原代重組腺病毒AD-CEA的收獲，具體步驟如下:
(1)轉染后第3天，將長滿的293細胞用胰蛋白酶消化傳代到T25培養瓶中，用5%血清DMEM培養基繼續培養；
(2)到第五天的時候補加IOmL新鮮的5%血清DMEM培養基；
(3)約到第7天會觀察到出毒現象，細胞變大變圓，呈葡萄狀【圖2】；
(4)繼續培養到第11天，細胞大部分病變并脫落，將已出毒的培養瓶放在_70°C冰箱到37°C水浴反復凍融3次；取凍融液5000r/min離心5min，收集上清即得到原代毒種；
4.重組腺病毒AD-CEA的擴增，具體步驟如下:
(1)提前兩天將293細胞傳代，每個T25瓶放入4X105cells/mL密度的細胞5mL，這樣用于病毒擴增的293細胞密度約為90% ；
(2)將原代病毒取ImL加入瓶中感染293細胞，此時的MOI大約為5；
(3)放在在37°C，5%C02培養箱中培養，2天后大部分細胞會發生病變，呈葡萄狀。收集細胞并重懸于ImL PBS緩沖液；
(4)將細胞重懸液于-70°C冰箱到37°C水浴反復凍融3次，5000r/min離心5min收集上清，0.22 μ m濾膜過濾后即得到擴增后的重組腺病毒AD-CEA，分裝后儲存在_70°C冰箱。
[0029]
(二)采用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC: 1.DC細胞的獲取和分離，具體步驟如下:
Cl)取人外周血50mL，肝素抗凝，加入50mL生理鹽水得到IOOmL稀釋血液。將IOOmL稀釋血液緩緩加到50mL淋巴細胞分離液上，2000r/min水平離心20min，取中間的白色細胞層即獲得單個核細胞(PBMC)；
(2)用RPMI1640培養基將單個核細胞制成細胞懸液，以4X 106cellS/mL的密度加入6孔培養板中，在37°C，5 % C02條件下培養2h，輕輕洗去懸浮細胞，剩下的細胞即為DC細胞。[0030]2.重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞及后續處理，具體步驟如下:
(1)將剩下的貼壁DC細胞分為3組:基因轉染組，蛋白致敏組和未致敏對照組；
(2)基因轉染組中洗去懸浮細胞后，加入ImL無血清RPMI1640培養基。然后在其中加入AD-CEA病毒液IOOuL (MOI=IOO),于37°C，5 % C02條件感染5h后，更換成2mL含GM-GSF (1000U/mL)的 RPMI 1640 完全培養基；
(3)其余兩組每孔用2mL含GM-GSF(1000U/mL)的RPMI1640完全培養基培養。
[0031]3.三組細胞的后續處理，具體步驟如下:
(1)到第三天，三組細胞均加入終濃度為1000U/mL的IL-4，隔天半量更換含有GM-CSF和IL-4的培養液；
(2)到第五天各組除了更換含有GM-CSF和IL-4的培養液外，蛋白致敏組需加入CEA蛋白(I μ g/mL)每孔IOOuL ;未致敏對照組加入PBS緩沖液每孔100uL。三組同時都要加入終濃度為 200U/mL 的 TNF- α。
[0032]4.重組腺病毒AD-CEA轉染獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC的收獲及鑒定，具體步驟如下:
(1)繼續培養三天，到第八天即成熟【圖3】。收集三組DC細胞，用50mL生理鹽水重懸。1500r/min水平離心10min后,棄上清重新用50mL生理鹽水重懸沉淀細胞,共洗3遍；
(2)最后用適當量生 理鹽水重懸洗過3遍的細胞沉淀，調整DC細胞密度在5X106cells/mL，獲得三組DC細胞；
(3)DC標志物的鑒定:培養8d的細胞數為5X106cells/mL的基因轉染組DC、蛋白致敏組DC和未致敏組DC各取50 μ L，加入1:20的滅活兔血清10 μ L，4°C冰箱孵育lOmin，分別加入熒光抗體 10 μ L(FITC-ant1-CDla、PE-anti_CD83、FITC-anti_CD80、PE-anti_CD86、PE-ant1-HLA-DR)，4°C暗處反應30 min, PBS洗滌3遍后，震蕩懸浮細胞后流式細胞儀檢測其表面標志表達情況【圖4】。
[0033](4)重組腺病毒AD-CEA轉染DC效率的檢測:收集基因轉染組DC，用PBS緩沖液洗2次，取細胞數為5X105置于流式細胞儀專用試管中，加入小鼠抗人CEA單抗(I / 200)，二抗用FITC標記的兔抗鼠單抗10uL，4°C冰箱中避光反應30 min,再用PBS洗3次，震蕩懸浮細胞后上流式細胞儀分析病毒感染效率。
[0034]
(三)AdCEA-DC疫苗的細胞體外實驗:
1.細胞毒性淋巴T細胞(CTL)的誘導，具體步驟如下:
Cl)以含人血清的RPMI 1640為培養基，取三組不同的DC細胞和自體T淋巴細胞，按DC:T細胞=1:20的比例混合，調節細胞濃度為2Χ 106cells/mL，96孔板每孔加入100 μ L ；
(2)使用含有 IL-2 (500U/mL)，GM-GSF(1000U/mL)和 IL-4 (1000U/mL)的 RPMI1640 培養液除繼續培養5天，期間每隔I天，進行半量換液，獲得3組不同的CTL。
[0035]2.三組CTL對幾種CEA陽性腫瘤細胞的體外特異性殺傷效應，具體步驟如下:
(1)收集3組CTL作為效應細胞，分別以LoVo(人結腸癌細胞株)，SW620(人結腸癌細胞株)，HGC-27 (人胃癌細胞株)為CEA陽性靶細胞，BEL-7402 (人肝癌細胞株)為陰性靶細胞；
(2)取96孔板，將靶細胞以lX105cellS/mL的密度每孔接入100μ L，培養3天后靶細胞長滿，設定不同的效靶比加入不同的CTL，效靶比為20:1，每種效靶比設3個復孔，每孔終體積含培養液200 μ L ;
(3)繼續在37°C ,5% C02培養箱中孵育44 h，然后每孔加入20 μ L 5mg/mL的MTT混勻。繼續培養4 h后，將培養液吸干，每孔加入二甲基亞砜IOOuL,震蕩15min后在酶標儀上測570 nm處OD值。通過所測OD值，以及單純效應細胞和單純靶細胞為陰性對照所測OD值，利用公式算得CTL的殺傷活性。
[0036]CTL殺傷活性=靶細胞對照組OD值-(實驗組OD值-效應細胞對照組OD值)/靶細胞對照組O D值【圖5】。
【權利要求】
1.一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟: a.構建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA； b.分離和培養DC細胞； c.采用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA_DC。
2.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(a)包括如下工藝步驟: al:將載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉染293細胞，培養至出毒，得到原代毒種； a2:用原代毒種感染293細胞，待2-3天細胞病變后，進行濃縮純化，獲得擴增后的重組腺病毒AD-CEA 。
3.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(b)中的DC細胞包括下列細胞:外周血單個核細胞培養的DC細胞，骨髓來源的DC細胞，臍帶血來源的DC細胞。
4.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(c)包括如下工藝步驟: cl:采用步驟(a)中制備的重組腺病毒AD-CEA病毒液感染步驟(b)中制備的DC細胞； c2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培養液，于37°C，5%C02的培養箱中繼續培養步驟(Cl)中感染后的DC細胞； c3:到第5天，在步驟(c2)中培養的DC細胞中加入TNF-α，繼續培養3天，第8天獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗AdCEA-DC，光鏡下形態學鑒定，并用流式細胞儀檢測細胞表型 CDla，CD80, CD83, CD86, HLA-DR0
5.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(a)中所述的重組腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，該病毒缺失El區和E3區，并且在El區位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表達盒，該表達盒依次包括:啟動子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因編碼序列，聚腺苷酸信號序列。
6.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(a)中所述的癌胚抗原CEA抗原肽的堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，是通過腺病毒為載體將癌胚抗原CEA抗原肽基因轉入DC細胞中獲得的，可以表達癌胚抗原CEA抗原肽基因。
8.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中用來感染DC的重組腺病毒AD-CEA的使用MOI值為50-1000。
9.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，CEA抗原肽基因陽性表達率在20%-100%ο
10.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(c)中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC可誘導出對CEA表達陽性腫瘤細胞有特異性殺傷作用的CTL。
【文檔編號】A61K39/00GK104001185SQ201310059166
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月26日 優先權日:2013年2月26日
【發明者】付建喜, 葉永清, 蘇國新 申請人:上海柯萊遜生物技術有限公司