Cthrc1蛋白在制備促進創面愈合作用的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及CTHRC1蛋白在制備促進創面愈合作用的藥物中的應用。CTHRC1蛋白能有效地促進創面愈合，并可避免激素類藥物的副作用。
【專利說明】CTHRC1蛋白在制備促進創面愈合作用的藥物中的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及制藥應用領域，更具體地說，本發明涉及CTHRCl蛋白在制備促進創面愈合作用的藥物中的應用。

【背景技術】
[0002]一般來說，創面是正常皮膚(組織)在外界致傷因子如外科手術、外力、熱、電流、化學物質、低溫以及機體內在因素如局部血液供應障礙等作用下所導致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚的正常功能受損。也稱為傷口或者創傷。
[0003]創面愈合過程可以分為止血期、炎癥期、增生期和重塑期，它是機體固有的組織修復過程。
[0004]具體來說，止血期從創面形成的一瞬間開始，機體首先出現的反應是自身的止血過程。這一過程包括一些非常復雜的生物學反應:先是創面周圍的小血管、毛細血管等反應性收縮使局部血流量減少，即之而來的是暴露的膠原纖維吸引血小板聚集形成血凝塊；隨后血小板釋放血管活性物質如5-羥色胺及前列腺素等，使血管進一步收縮，血流減慢，同時釋放的磷脂和ADP將吸引更多的血小板聚集。最后，內源性及外源性凝血過程也將被啟動。凝血過程結束后，機體即開始進行創面的愈合。
[0005]炎癥期開始自創面形成開始的前2-3天。由于局部血管的收縮，導致局部組織缺血，引起組織胺和其他血管活性物質的釋放，使創面局部的血管擴張；同時，因壞死組織，以及可能的致病微生物的存在，引發機體的防御反應(炎癥反應):免疫細胞如粒細胞和巨噬細胞向創面移動和集中。一方面，粒細胞防止或吞噬入侵的細菌，另一方面，巨噬細胞吞噬消化壞死的組織細胞碎片，同時，組織細胞破壞后釋放出來的自身蛋白溶酶也可以消化溶解壞死的組織細胞碎片，使創面清潔，以便啟動組織的修復過程。巨噬細胞除吞噬消化組織細胞碎片外，同時也是刺激成纖維細胞增殖分化，合成膠原蛋白的關鍵因素。這一過程也被稱為清創階段。同時，創面會反應性地出現收縮，以期減少創面面積。臨床上因這一時期的創面大多被黑色的壞死組織所覆蓋，因此也被稱為黑色期。而當這一層壞死組織被清除后，創面仍會被一層薄薄的腐爛失活組織所覆蓋，使創面外觀呈黃色，因此臨床上分期時常將此時的創面稱為黃色期。
[0006]增生期開始自創面形成后的2-24天，上皮細胞再生創面修復首先是創面周緣健存的基底細胞開始增生，并向中心部位移行。與此同時，基底細胞的增殖刺激創面基底部毛細血管和結締組織的反應性增生。當創面被新生的上皮細胞覆蓋后，創面外觀呈粉紅色，故而又稱此時的創面為粉紅色期。肉芽組織形成隨后，基底細胞的增生刺激肉芽組織的生長。同時，巨噬細胞釋放的生長因子如血小板衍生生長因子(PDGF)，β轉型生長因子(β-TGF)和α轉型生長因子(α-TGF)等，加速肉芽組織的形成。肉芽組織的形成有著重要的生物學意義，主要表現在:(I)填補組織的缺損；(2)保護創面，防止細菌感染，減少出血；(3)機化血塊和壞死組織及其他異物由于新生健康的肉芽組織外觀呈鮮紅色，因此，臨床上又將此時的創面稱之為紅色期。隨著肉牙組織的不斷形成，創面組織的缺失被填充，上皮細胞便從創面周緣向中心移行，最終使得創面得以完全被再生的上皮細胞覆蓋。
[0007]然而，當創面被再生的上皮細胞完全覆蓋后，創面的愈合過程并沒有完全結束。這就是創面的重塑期。因為新生的肉芽組織和上皮細胞還需要進一步分裂分化、轉型，使其力量增強，才最后使創面得以完全愈合。這一過程主要表現在以下2個方面:
[0008](I)新形成的上皮細胞不斷分裂，使表皮層增厚；(2)肉芽組織內部轉型:形成的膠原纖維排列發生改變，使新生的結締組織力量增加；同時，毛細血管數目減少，使創面局部顏色減退，接近于正常色。
[0009]正常的創面愈合需要全身和局部多種因素的協調，某些因素的不足或過度就可能造成病理性的創面愈合。延遲的創面愈合，包括難愈合創面就是對廣大患者個人、家庭及社會造成嚴重影響的最常見病理性創面愈合類型。而這種情況的發生，主要是由于不正常的炎癥和增生過程，其核心的一點是表皮的角質形成細胞不能及時覆蓋創面。角質形成細胞及時覆蓋創面，不但意味著創面滲出的停止，感染可能和營養丟失的緩解，還可以避免繼發的過度瘢痕形成。因此，促進角質形成細胞的及時覆蓋，是治療創面的核心問題。
[0010]影響創面愈合的因素包括全身因素和局部因素。全身因素主要指年齡、性別、有無糖尿病、高血壓、營養狀況等，這些因素雖然重要，但往往難以干預，或者是僅能部分得到控制。因此，從改善局部因素著手，是治療創面的一個更重要的方向。而局部因素中，創面微環境起到了重要作用。細胞外基質不僅是創面微環境的結構基礎，它還包含了非常多的成分，如細胞因子、分泌蛋白、結構蛋白、炎癥細胞、間質細胞、血管內皮細胞、血管外膜細胞等。其中部分成分不但為正常發育和組織器官修復、結構功能維持所必需，對腫瘤、外傷、炎癥、畸形的發生、發展、維持和消退也起到重要影響。在創面愈合過程中也是如此，部分細胞外基質蛋白成分的過多或者不足，可能對創面的愈合速度和質量起到重要影響。
[0011]由此可見，創面是一個非常常見而且重要的臨床問題。外傷性創面、糖尿病足、靜脈瘀滯性潰瘍、壓力性潰瘍以及感染、腫瘤切除引起的創面發病率居高不下，且隨著經濟社會的發展，有不斷增高趨勢。創面不但給患者帶來疼痛、影響工作、生活，還可能造成局部及全身感染可能，延遲愈合的創面往往造成嚴重的瘢痕，而經久不愈的創面可能導致惡性腫瘤發生。目前臨床可用的促進創面愈合藥物非常有限，主要是生長因子類藥物及生長激素類藥物。但是效果不能讓人滿意，并且使用有局限性。因此，開發新的促進創面愈合藥物仍然非常必要。
[0012]膠原三股螺旋重復蛋白I (collagen triple helix repeat containing
I,CTHRC1)是一種細胞外分泌蛋白，2005年首次被報導。最初發現其具有促進成纖維細胞和血管平滑肌細胞遷移，抑制膠原蛋白表達的作用，而且是TGF-β信號的負調節因子。后來發現其還和細胞分化，腫瘤發生、發展有關(例如，參見王萍等，CTHRCl與腫瘤關系的研究進展，《生命科學》2010年08期；周琦等，宮頸癌組織中膠原三股螺旋重復蛋白I表達及臨床意義，《中華實用診斷與治療雜志》，2011年07期等)。但是，目前為止，CTHRCl與角質形成細胞和創面愈合的關系還沒有報導。


【發明內容】

[0013]本發明的一個目的是提供CTHRCl蛋白在制備促進創面愈合作用的藥物中的應用。
[0014]在一個實施方案中，所述的CTHRCl蛋白選自重組人CTHRCl蛋白或重組小鼠CTHRCl 蛋白。
[0015]所述的創面可以發生在哺乳動物，特別是人和小鼠的身上。
[0016]具體來說，發明人下面通過小鼠創面標本和人正常皮膚及瘢痕標本免疫組化證實，CTHRCl在正常皮膚上皮中基本不表達，而在創面愈合過程中高表達，說明它與創面愈合有相關性。而根據CTHRCl在其它細胞中具有促進遷移和抑制膠原蛋白表達的作用，發明人推測其可能具有加快創面愈合，改善創面愈合質量的作用。為了驗證該假說，發明人構建了小鼠源性和人源性CTHRCl蛋白表達載體，表達并純化了重組蛋白。接著通過體內外實驗證實了 CTHRCl重組蛋白不明顯影響角質形成細胞增殖，但可以促進角質形成細胞遷移，促進小鼠創面愈合。這些結果揭示了 CTHRCl蛋白具有成為促進創面愈合外用藥物的潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1a 為人真皮成纖維細胞(Human dermal fibroblasts, HDF)及 HaCaT 細胞CTHRCl的mRNA表達水平的柱形圖。
[0018]圖1b為人真皮成纖維細胞及HaCaT細胞CTHRCl的蛋白表達水平的柱形圖。
[0019]圖1c為在炎癥因子TGF-β I誘導下(2ng/ml)，HaCaT細胞CTHRCl的mRNA表達水平的柱形圖。
[0020]圖1d為正常人皮膚和人未成熟瘢痕的照片。
[0021]圖1e為正常人體皮膚表皮和在未成熟瘢痕表皮中的CTHRCl表達水平的柱形圖。
[0022]圖1f為正常小鼠皮膚和小鼠創面皮膚的照片。
[0023]圖1g為正常小鼠皮膚和小鼠創面皮膚中的CTHRCl表達水平的柱形圖。
[0024]圖2a為從合成的小鼠CTHRCl編碼區中PCR出帶相應酶切位點的編碼CTHRCl蛋白的核苷酸序列的瓊脂糖電泳圖。
[0025]圖2b為雙酶切V152、V162載體及CTHRCl編碼序列PCR產物的瓊脂糖電泳圖。
[0026]圖2c為所述的雙酶切產物膠回收后經轉化后選取的8個單克隆(clonel、clone2、clone3、clone4、clone5、clone6、clone7 和 clone8)的瓊脂糖電泳圖。
[0027]圖2d為clonel經測序驗證后表達的CTHRCl重組蛋白的Western blot圖。
[0028]圖3為實施例三進行的劃痕實驗的照片及相應的柱狀圖。
[0029]圖4為實施例四進行的增殖實驗的柱狀圖。
[0030]圖5為實施例五中小鼠創面愈合照片和相應的柱狀圖。
[0031]下面基于具體實施例并結合附圖對本發明作進一步的闡述。

【具體實施方式】
[0032]預備實施例、免疫組化步驟；
[0033]人正常皮膚及未成熟瘢痕組織、成熟瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織及小鼠創面組織多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟至水；檸檬酸鈉緩沖液水浴抗原修復；0.3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性；10%BSA室溫封閉I小時；一抗4度過夜，PBS清洗3次；二抗室溫孵育I小時，PBS清洗3次；DAB發色，自來水洗10分鐘；蘇木素復染10秒，自來水洗10分鐘；脫水透明后封片。
[0034]實施例一、CTHRCl在體外及體內的表達；
[0035]實時定量PCR (Real time PCR):
[0036]RNA提取:①6厘米培養皿中HDF及HaCaT細胞生長至80_90%融合時，棄去培養基，1*PBS洗一次，加入RNAiso Plus(購自Takara，中國大連)300μ 1，以細胞刮勺刮下細胞后轉移至離心管，移液槍反復吹吸至裂解液中無肉眼可見沉淀。室溫放置5分鐘。②加Λ 60 μ I氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5分鐘。12，000g4°C離心15分鐘。③將上清液轉移至新離心管中并加入與上清液等體積的異丙醇，室溫靜置10分鐘。12，000g4°C離心10分鐘。④棄去上清，向沉淀中加入lml75%的乙醇清洗沉淀，12，000g4°C離心5分鐘。⑤棄上清并室溫干燥沉淀，溶解于適量DEPC處理水中，并測定濃度。
[0037]反轉錄:配制10 μ I反應體系如下,5 X PrimeScriptTM緩沖液(購自Takara,中國大連)2.0 μ I, Random6mers (購自 Takara,中國大連)(100 μ M) 0.5 μ I, PrimeScriptTMRT Enzyme Mixl (Takara,中國大連)0.5 μ 1，Oligo dT Primer (購自 Takara,中國大連)(50 μ Μ) 0.5 μ I,總 RNA (購自 Takara,中國大連)500ng, RNase Free dH20 (購自 Takara,中國大連)加至總體積10 μ I。反轉錄條件為:37°C 30分鐘，850C 5秒鐘，4°C保存。
[0038]實時定量PCR:采用ABI PRISM7300實時定量PCR系統。反應體系配制(10 μ I):SYBR Premix Ex TaqTM(購自 Takara,中國大連)(2 X) 5 μ 1，PCR Forward Primer (購自 Takara,中國大連)(10 μ M) 0.4 μ I, PCR Reverse Primer (購自 Takara,中國大連)(10 μ Μ) 0.4 μ 1，ROX參照染料(購自Takara，中國大連)(50 X) 0.2 μ 1，DNA模板(反轉錄產物以dH20稀釋40倍)I μ I, dH203 μ I。反應條件為:階段195°C，30秒；階段295°C 5秒，600C 31秒，循環40次； 階段395°C 15秒，60°C 30秒，95°C 15秒。結果與GAPDH表達水平采用2-dt CT法定量比較。
[0039]Western blot:①6厘米培養皿中HDF及HaCaT細胞生長至80-90%融合時，棄去培養基，1*PBS洗一次，冰上放置，加入300 μ IlX負載緩沖液(loading buffer)，刮下細胞，冰上放置I到2分鐘。沸水浴變性10分鐘后放置于冰上。②聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠濃度10%);③轉膜，條件為恒流300mA，90分鐘5%脫脂牛奶室溫封閉I小時后孵育一抗，CTHRCl小鼠單抗(杭州華安生物技術有限公司制備)，4°C過夜過I X TBS洗4次，每次5分鐘后避光孵育抗小鼠熒光二抗，室溫I小時；?掃膜后Image J軟件半定量。
[0040]免疫組織化學染色
[0041]人正常皮膚及未成熟瘢痕組織、成熟瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織及小鼠創面組織多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟至水；檸檬酸鈉緩沖液水浴抗原修復；0.3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性；10%BSA室溫封閉I小時；一抗4度過夜，PBS清洗3次；二抗室溫孵育I小時，PBS清洗3次；DAB發色，自來水洗10分鐘；蘇木素復染10秒，自來水洗10分鐘；脫水透明后封片。
[0042]如圖1所示，CTHRCl在HaCaT細胞中的表達水平極低，幾乎不能被檢出。圖1a所不為人真皮成纖維細胞(Human dermal fibroblasts, HDF)及HaCaT細胞CTHRCl的mRNA表達水平，圖1b所示為二者CTHRCl的蛋白表達水平。但是在炎癥因子TGF-β I誘導下(2ng/ml)，HaCaT細胞CTHRCl的mRNA表達水平可以明顯上調(參見圖lc)。在正常人體皮膚表皮中，通過免疫組化的方法幾乎檢測不到CTHRCl蛋白的表達，但是在愈合不久的未成熟瘢痕表皮中，可見CTHRCl蛋白表達明顯增加(參見圖1d和圖le)。類似的結果通過C57小鼠創面模型也得到了驗證，在小鼠正常皮膚表皮中，CTHRCl蛋白幾乎不表達，但是在創面愈合過程中，CTHRCl蛋白的表達水平均明顯增加(參見圖1f和圖1g)。
[0043]實施例二、小鼠源性及人源性CTHRCl重組蛋白表達載體的構建及重組蛋白的表達、純化；
[0044]①查詢小鼠源性及人源性CTHRCl基因⑶S序列并合成；
[0045]②合成PCR引物，并從⑶S序列中PCR出包含酶切位點的CTHRCl序列；
[0046]③雙酶切PCR產物及載體質粒；
[0047]④酶切產物電泳，膠回收后連接，轉化感受態DH5a細菌，并涂板，挑單克隆，搖菌，菌液PCR、酶切及測序驗證；
[0048]⑤驗證成功后提質粒，轉染293吉凱細胞，兩天后篩選，篩選穩定后收上清；
[0049]⑥親和柱層析法純化重組蛋白并測定濃度,分裝，western blot鑒定。
[0050]小鼠CTHRCl重組蛋白表達載體構建及蛋白表達、純化、鑒定過程及結果為:首先從合成的小鼠CTHRCl編碼區中PCR出帶相應酶切位點的編碼CTHRCl蛋白的核苷酸序列，并經瓊脂糖電泳驗證分子量，如圖2a所示。然后雙酶切V152、V162載體及CTHRCl編碼序列PCR產物，以瓊脂糖電泳分離，如圖2b所示。雙酶切產物膠回收后4度水浴連接16小時，轉化感受態DH5a細菌，并涂板，挑單克隆八個，搖菌后菌液PCR驗證連接是否成功，如圖2c所示。挑選其中一個測序，完全吻合后搖菌提質粒，并轉染293吉凱細胞后嘌呤霉素篩選，收集上清，然后以親和柱層析發純化蛋白，測定濃度后分裝，以Western blot驗證,如圖2d所示。人CTHRCl重組蛋白與此相同，僅合成⑶S序列不同。
[0051]實施例三、體外角質形成細胞遷移實驗；
[0052]永生化角質形成細胞(HaCaT)細胞種入24孔板(3X 105/ml)，以含10% FBS的DMSO培養基培養，兩天左右細胞生長融合。換液為含1%FBS的DMEM，24小時后用移液器小槍頭垂直皿底輕輕劃痕，以PBS清洗3次，去除漂浮細胞。然后每孔加入含不同濃度重組人CTHRCl蛋白(Onm，lnm, 1nm, 10nm)的培養基(含1%FBS的DMEM)500 μ I。放入活細胞工作站，每6小時拍照一次至24小時。測量每個視野縮小的面積并統計分析。實驗重復三次，算出均值后以Student’ T檢驗法比較各組間P值，P值小于0.05認為有統計學意義。
[0053]角質形成細胞的遷移是創面愈合過程中核心的細胞過程，遷移較快意味著創面愈合加速。如圖3所示，通過劃痕實驗發現，重組人CTHRCl蛋白可以促進HaCaT細胞遷移，而且這種作用有濃度依賴性。
[0054]實施例四、體外角質形成細胞增殖實驗；
[0055]HaCaT細胞以含10% FBS的DMSO培養基培養至70-80%融合時消化并種入96孔板，以含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞后，每孔種入加入含2000個細胞的100 μ I培養基。24小時后換液為含1%FBS的DMEM并加入不同濃度人源性重組CTHRCl蛋白(Onm，lnm, 1nm,10nm),每兩天換液I次,每兩天以CCK-8法測定波長450nm0D值一次。測定至加蛋白后第6天。實驗重復三次，算出均值后以Student’ T檢驗法比較各組間P值，P值小于0.05認為有統計學意義。
[0056]結果顯示，重組人CTHRCl蛋白對HaCaT細胞體外增殖無明顯影響；角質形成細胞增殖也是和創面愈合密切相關的細胞過程，如圖4所示，重組人CTHRCl蛋白在促進HaCaT細胞遷移的濃度范圍內，對HaCaT細胞體外增殖沒有明顯影響。
[0057]實施例五、小鼠創面愈合模型的建立及重組蛋白處理，創面愈合過程的觀察。
[0058]實驗開始前I天小鼠背部剃毛后以10%硫化鈉脫毛。實驗開始時標記小鼠背部4個創面位置，前兩個創面中點為耳后1.5厘米，背部中線兩次各0.5厘米，另兩個創面中點為前兩個創面中點后1.5厘米。創面直徑均為5毫米。畫線后以銳利眼科剪剪去全層皮膚。每天創面給藥一次，分別為空白對照，Onm重組蛋白(即蛋白稀釋液)，1nm小鼠源性重組CTHRCl蛋白，40nm小鼠源性重組CTHRCl蛋白。每天創面大小拍照。共6只小鼠，各時間點創面大小以Student’ T檢驗法比較各組間P值，P值小于0.05認為有統計學意義。
[0059]如圖5所示，發明人構建了 C57小鼠創面模型，并且將重組小鼠CTHRCl蛋白外用，每日I次，然后觀察創面愈合速度，結果發現，創面直接外用CTHRCl蛋白可以有效促進小鼠創面的愈合。
[0060]本發明據此發現了 CTHRCl蛋白外用促進創面愈合藥物的潛力，它能有效地幫助創面愈合，并可避免激素類藥物的副作用。
【權利要求】
1.CTHRCl蛋白在制備促進創面愈合作用的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的CTHRCl蛋白選自重組人CTHRCl蛋白或重組小鼠CTHRCl蛋白。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述的創面發生在哺乳動物上。
4.如權利 要求3所述的應用，其特征在于，所述的哺乳動物是人或小鼠。
【文檔編號】A61P17/02GK104043106SQ201310080556
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優先權日:2013年3月13日
【發明者】張志剛, 劉曉瑾, 楊小妹 申請人:上海市腫瘤研究所