專利名稱：參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物及聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥的應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物及聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
參歸丸首見于《古今醫(yī)鑒》卷九。由苦參(凈末)4兩，當(dāng)歸(凈末)2兩組成配方。有清熱涼血之功。目前在多種數(shù)據(jù)庫中搜索參歸丸，僅得到《均勻設(shè)計優(yōu)選當(dāng)歸苦參丸方藥的半仿生提取工藝條件》一篇文章，未見將參歸丸用于腫瘤治療的臨床或?qū)嶒瀳蟮馈Ｑ芯孔C明當(dāng)歸多糖及其硫酸酯對活化T細(xì)胞增殖有直接促進(jìn)作用，當(dāng)歸多糖能增強(qiáng)非特異性免疫功能，而對體液免疫功能有抑制作用。硫酸酯化當(dāng)歸多糖在體內(nèi)具有顯著抗腫瘤活性，當(dāng)歸多糖可誘導(dǎo)DC分化與成熟，刺 激T細(xì)胞增殖和腫瘤殺傷活性。當(dāng)歸多糖對肉瘤S-180荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用并明顯促進(jìn)荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的增加。氧化苦參堿與環(huán)磷酰胺合用可提高抑瘤率，對高劑量環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞數(shù)減少以及肝損害具有一定的緩解作用。苦參堿可以調(diào)動機(jī)體的免疫功能，產(chǎn)生抑瘤效應(yīng)，在腫瘤化療輔助用藥方面具有應(yīng)用前景。苦參堿對于小鼠Lewis肺癌原發(fā)瘤的生長具有一定的抑制作用，并能顯著抑制瘤組織微血管形成，可能與其抑制腫瘤VEGF mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。苦參堿在體內(nèi)體外都對小鼠H22肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用和誘導(dǎo)凋亡作用，促凋亡作用與其上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)，抑制Bc-1 2表達(dá)有關(guān)。參歸丸具有清熱燥濕的功效，主治與腫瘤病機(jī)相吻合。現(xiàn)代研究證明當(dāng)歸多糖和氧化苦參堿皆具有抗腫瘤作用。惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的耐受缺氧能力及代謝有關(guān)。HIF-Ια是組織細(xì)胞對低氧的適應(yīng)性反應(yīng)，是獨立于血氧濃度的敏感控制因子，能夠激活細(xì)胞內(nèi)代謝廢物清除基因及VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤組織代謝產(chǎn)物的清除及血管生成。HIF-1a可以成為腫瘤治療的潛在靶點，藥物通過下調(diào)HIF-1 a抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的清除，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。LDH同工酶是診斷心肝腎損傷的重要指標(biāo)，細(xì)胞膜損傷后釋放到細(xì)胞外。隊列研究表明LDH高，預(yù)后差。傳統(tǒng)的抗癌藥物在殺滅惡性腫瘤細(xì)胞的同時對機(jī)體的正常細(xì)胞也損傷作用，引起機(jī)體免疫等多種功能的嚴(yán)重下降，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的降低、白細(xì)胞減少。因此，研究具有抑瘤作用及對化療藥物具有增效減毒作用的中藥逐漸成為中醫(yī)藥研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物及聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個目的是提供了參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用，所述聯(lián)合化療藥物的組成為參歸丸和順鉬。進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述參歸丸中，按照重量比當(dāng)歸:苦參為1:2。進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述參歸丸的入藥形式為湯劑。進(jìn)一步的,上述的應(yīng)用,所述腫瘤細(xì)胞為H22肝癌細(xì)胞。參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，所述參歸丸的用量為每千克體重每天9g,用藥方式為灌胃,用藥時間為14天。參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用，所述聯(lián)合化療藥物中，參歸丸的用量為每千克體重每天9g，用藥方式為灌胃，用藥時間為14天；順鉬的用量為每千克體重每天2.0mg，用藥方式為腹腔注射，用藥時間為14天。本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物及聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用，參歸丸具有有效的抑瘤率(>30%);增加順鉬化療荷瘤小鼠的有效體質(zhì)量；改善荷瘤小鼠的生存 狀態(tài)；對順鉬化療所致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞減低有升高作用；參歸丸能夠拮抗順鉬化療引起的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，有升高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用，對小鼠重要免疫器官具有一定的保護(hù)作用；能夠降低HIF-Ια的濃度水平，消弱腫瘤細(xì)胞耐受低氧的能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡；降低LDH的活性，減少LDH對正常細(xì)胞的損傷，從而對順鉬化療有減毒作用。實驗驗證:
I材料:
1.1動物:
SPF級昆明小鼠100只，公45只，母55只，質(zhì)量20_22g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級動物實驗中心提供，動物合格證號:SCXK(甘)2011 — 0001，SPF級動物實驗設(shè)施使用證號:SYXK(甘)2011-0001。1.2 細(xì)胞株:
H22肝癌瘤株由甘肅中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所傳代培養(yǎng)。1.3藥物與試劑:
CO2培養(yǎng)箱(NAPC0法國)，RPMI1640(美國Invitro公司)，順鉬注射液，IOmg/支，齊魯制約有限公司(批號:201002CF); HIFla試劑盒，上海源葉生物科技有限公司(批號:20121001A) ;LDH試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號:20121011)。參歸丸為自制湯劑(每ml藥液含0.45g生藥，當(dāng)歸0.15g/ml、苦參0.30g/ml)。1.4 儀器:
SW-CJ-1F超凈臺(中國蘇州凈化設(shè)備廠)，電子天平(LD100001，龍騰電子有限公司)，Abacus Junior vet 5動物血清分析儀(蘭橋醫(yī)療)，酶標(biāo)儀(680型，美國BD-RAD公司)，UVllOl紫外-可見分光光度儀(上海天美科學(xué)有限公司)。2 方法:
2.1參歸丸湯劑的制備:
將當(dāng)歸飲片15g，苦參飲片30g放在陶土藥鍋中，加500ml去離子水浸泡30min，沸騰后文火煎藥lh，將藥液倒入燒杯中，藥渣仍留在藥鍋中，待藥鍋溫度下降后，再加500ml去離子水浸泡30min，沸騰后文火煎藥lh，將兩次煎出液混合后在水浴鍋中水浴加熱濃縮到100ml，高壓滅菌。其外觀在無色玻璃量筒中呈深棕褐色、黏稠適中、透明，藥物濃度按生藥量計算為0.45g/mL, SPF級實驗室內(nèi)常溫保存3天。2.2動物模型制備:
在無菌條件下，在SPF級實驗室內(nèi)取100只KM小鼠，母55只，公45只，實驗室條件下適應(yīng)環(huán)境4d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分出雌雄各8只，設(shè)為正常對照組。取傳代7天的腹水型H22小鼠腹水，用生理鹽水調(diào)至細(xì)胞濃度為2 X IO6個.πι Λ將84只小鼠以75%乙醇消毒，按常規(guī)方法皮下注射配制好的Η22肝癌細(xì)胞懸液0.2mL，接種于昆明小鼠右前腋皮下，細(xì)胞計數(shù)約為4X105個，以出現(xiàn)皮丘為皮下接種部位正確。5-7天內(nèi)觀察小鼠接種部位的腫瘤生長情況，接種部位可見或觸及結(jié)節(jié)為接種成功。2.3模型動物分組及處理:
第8天剔除出瘤不佳或接種不成功的小鼠，隨機(jī)挑選接種成功的小鼠，公母各32只隨機(jī)分為模型對照組、順鉬組、參歸丸組和參歸丸加順鉬組，每組16只。分組后稱重，模型對照組以生理鹽水20mL.kg—1.Cf1灌胃，順鉬組以2.0mg.kg—1.cf1腹腔注射0.2ml，參歸丸組以9g.kg—1.cf1灌胃0.4ml參歸丸藥液，參歸丸加順鉬組組以9g.kg—1.cf1灌胃參歸丸藥液，腹腔注射2.0mg.kg—1.cf1順鉬0.2ml，連續(xù)給藥14天。觀察小鼠生存狀態(tài)，作為評價藥物毒性的指標(biāo)之一；停藥后次日稱取體質(zhì)量，眼球取血檢查血常規(guī)及離心后取血清置-20°C以下保存。剝離瘤體組織，摘取肝、脾、腎、胸腺后分別稱重。計算抑瘤率、腫瘤、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺等的指數(shù)及有效指數(shù)，以及用藥前后的體質(zhì)量變化。體質(zhì)量變化=處死時的體質(zhì)量-分組完成時的體質(zhì)量。處死前死亡的小鼠，不參與平均值的計算。抑瘤率(%)=(模型對照組平均瘤質(zhì)量一實驗組平均瘤質(zhì)量)/模型對照組平均瘤質(zhì)量。器官指數(shù)=器官質(zhì)量(mg) /體質(zhì)量(g)。有效器官指數(shù)=器官質(zhì)量/ (體質(zhì)量-腫瘤質(zhì)量)。有效體質(zhì)量變化=處死時的體質(zhì)量-瘤重-分組完成時的體質(zhì)量。2.4藥效評價: 按照國家衛(wèi)生部藥政管理局制定的治療惡性腫瘤的中藥藥效評價標(biāo)準(zhǔn):
(1)對照組小鼠腫瘤均值不得低于Ig;
(2)腫瘤抑制率在30%以上，與對照組比較有顯著性差異；
(3)給藥組動物平均體質(zhì)量下降(與自身對照)不得超過15%；
(4)動物死亡數(shù)不超過20%。2.5聯(lián)合用藥療效:
根據(jù)Webb氏分?jǐn)?shù)乘積法計算q值:Q=Eab/ [Ea+(1-Ea) Eb。式中Ea為A藥(參歸丸或參歸丸)抑瘤率，Eb為B藥(順鉬)抑瘤率，Eab為聯(lián)合用藥組兩藥合用的抑瘤率，q=0.85-1.15為兩藥作用相加，q>l.25為兩藥作用增強(qiáng)(或協(xié)同)，q〈0.85為兩藥拮抗。2.6統(tǒng)計處理:
實驗數(shù)據(jù)均以(;±s)表示,
采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，方差齊性檢驗后，組間比較用t檢驗。2 結(jié)果:
2.1造模成功率:
37只雄鼠在接種7天時全部出現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，平均直徑3mm，造模成功率100%。47只雌鼠中有39只出現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，平均直徑2.3mm，造模成功率83%。多次預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)個別豆粒大小的瘤體會自行消失或不生長，使得造模成功率比實際值偏大，因此本研究用于造模的小鼠數(shù)量比理論數(shù)量多。2.2荷瘤小鼠的一般狀況:
接種成功后，瘤塊體積逐漸增大，外觀呈球形、半球形或山脈狀。初期能活動，后來大多逐漸變硬。分組前荷瘤小鼠身形勻稱(瘤體隆起處除外)，動作敏捷，反應(yīng)靈活，皮毛光滑，進(jìn)食進(jìn)水正常；分組4天后，隨著實驗時間的繼續(xù)延長，順鉬組小鼠最先出現(xiàn)精神萎靡，飲食活動減少，聚集一團(tuán)，皮毛成揪失去光澤，下腹部不潔凈，尿液變黃等現(xiàn)象，參歸丸加順鉬組中上述現(xiàn)象的出現(xiàn)比順鉬組較晚。模型組中上述現(xiàn)象的出現(xiàn)又晚一些，當(dāng)歸貝母苦參組丸中上述現(xiàn)象的出現(xiàn)最晚。從飲食、活動及毛發(fā)色澤來看，參歸丸組小鼠生存質(zhì)量和生存狀態(tài)均明顯高于順鉬組。一般狀況比較表明順鉬整體狀況最差。如表I所示為接種第21天時各組小鼠一般狀況比較。表I
權(quán)利要求
1.參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
2.參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述聯(lián)合化療藥物的組成為參歸丸和順鉬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述參歸丸中，按照重量比當(dāng)歸:苦參為1:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述參歸丸的入藥形式為湯劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為H22肝癌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述參歸丸的用量為每千克體重每天9g，用藥方式為灌胃，用藥時間為14天。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述聯(lián)合化療藥物中，參歸丸的用量為每千克體重每天9g，用藥方式為灌胃，用藥時間為14天；順鉬的用量為每千克體重每天。2.0mg，用藥方式為腹腔注射，用藥時 間為14天。
全文摘要
本發(fā)明公開了參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物及聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的參歸丸在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物及聯(lián)合化療藥物中的應(yīng)用，參歸丸具有有效的抑瘤率(>30%)；增加順鉑化療荷瘤小鼠的有效體質(zhì)量；改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)；對順鉑化療所致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞減低有升高作用；參歸丸能夠拮抗順鉑化療引起的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，有升高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用，對小鼠重要免疫器官具有一定的保護(hù)作用；能夠降低HIF-1α的濃度水平，消弱腫瘤細(xì)胞耐受低氧的能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡；降低LDH的活性，減少LDH對正常細(xì)胞的損傷，從而對順鉑化療有減毒作用。
文檔編號A61K9/20GK103202875SQ20131008584
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者劉永琦 申請人:甘肅中醫(yī)學(xué)院