專利名稱：一種用于治療乙肝的重組質粒疫苗及其組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療乙肝疾病的重組質粒DNA疫苗及其組合物，屬于生物醫學領域。
背景技術：
乙型肝炎嚴重危害人類健康，目前尚無特效治療手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后機體缺乏持久的特異性細胞免疫及體液免疫。HBV外殼蛋白是有大蛋白LS (S1S2S抗原，由前S1-前S2-S基因編碼)、中蛋白MS(S2S抗原，由前S2-S基因編碼)、小蛋白S (S抗原，由S基因編碼)三種分子構成，其中，前S2抗原分子量小，抗原性強，涉及乙肝病毒對宿主細胞的吸附，因而含前S2抗原的疫苗對于接種者的保護作用應更為有效。HBcAg是由乙型肝炎病毒基因C區基因編碼，從第2個ATG起始翻譯，含183-185個氨基酸多肽，分子量約為21KD，其C端富含精氨酸和多種蛋白酶作用位點，有結合RNA的能力，并與其組裝成乙肝核心顆粒密切相關。HBcAg顆粒由多個核心蛋白亞基構成，呈正二十面體對稱的顆粒樣結構，單個核心蛋白亞基(包括183-185個氨基酸多肽鏈)先形成同型二聚體(Homodimer), 二聚體再進一步聚集而形成HBcAg顆粒。重組質粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表達載體上，然后將重組質粒直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生抗原激活機體的免疫系統，引發免疫反應。與傳統的疫苗相比，重組質粒DNA疫苗不僅能有效誘導體液免疫，還能誘導細胞免疫，可兼做預防和治療性疫苗，DNA質粒疫苗已經在許多疾病的治療和預防方面顯示出廣泛的應用前景。Mancini (Manc ini M, HadchoueI M, Davis HL, et al.DNA-mediatedimmunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigenchronic carrier state.Pro Natl Acad Sci USA.1996,93:12496-12501)等應用編碼preS2/SHBV包膜蛋白的重組質粒免疫HBV轉基因小鼠，經過一次肌肉注射就能清除轉基因小鼠循環中的HBsAg，并且能夠長期抑制肝細胞中的病毒復制，證實了 DNA疫苗在治療慢性乙肝攜帶者的潛在優勢。Mancin1-Bourgine M等(Mancin1-BourgineM,Fontaine H, Scott-Algara D, et al.1nduction or expansion of T—cell responseseby a hepatitis B DanA vaccine administered to chronic HBV carriers.Hepatology.2004, 40:874-882)應用編碼preS2/S HBV包膜蛋白的重組質粒免疫10例慢性乙肝攜帶者，這10例攜帶者未接受過任何的抗病毒治療。結果發現，疫苗能夠很好地耐受，有2例攜帶者的PBMC發生抗原特異性的T淋巴細胞增殖反應，并且HBV特異性分泌IFN- Y的T細胞數目在免疫后有較大幅度的提高，有5例攜帶者的血清HBV DNA水平下降，但是這種下降僅僅是暫時性的。此次研究也證實了 HBV DNA疫苗的安全性以及能夠在部分慢性乙肝攜帶者體內誘導出特異的T細胞免疫應答。HBcAg作為優勢抗原,在乙肝疫苗的研究中也得到了廣泛應用，Veremeiko TA等(Veremeiko TA, Lebedev LR, Chikaev NA, et al.Humoral immune response of Balb/c mice immunized with chimer HBcAg proteins carrying the epitopes of surfacehepatic B virus protein.Vopr virusol, 2007，52:40-45)把 HBV 外殼蛋白表位插入至IjHBcAg,成功構建了 HBcAg-HBsAg融合蛋白，并以此融合蛋白免疫Balb/cxiaoshi ,產生了高滴度的針對插入表位HBsAg和載體蛋白HBcAg抗體。張煒等(張煒，懂生福，孫淑惠，等.乙肝病毒核心抗原DNA疫苗誘導小鼠抗原特異性CD8+T細胞動態變化和動態分布.中國免疫學雜志.2004, 20 (6): 379-383)研究了重組HBcAg真核表達質粒pHBcl44對C57BL/6小鼠的免疫作用，結果發現，pHBcl44面以后抗原特異性CD8+T細胞逐漸增多，在初次免疫的第14天出現第一個免疫應答高峰，此后抗原特異性CD8+T細胞數量組建下降進入免疫記憶期并在I年內維持在穩定水平。胸腺肽、GSF、IL-2、IL_4、IL-12或IFN- Y等為常作為免疫佐劑或增強劑，其中將胸腺肽、63 、幾-2或0^-￥作為佐劑與HBV疫苗聯合使用已有研究。IL-12具有多種生物活性，是最強的N K細胞激活因子，可促進CD4+ThO細胞分化為Thl細胞，可協調亞適劑量IL-2誘導LAK(activated killer cells)細胞活性。作為重要的免疫調節分子，IL-12是迄今所知誘導Thl型免疫應答的最主要的細胞因子，原體如細菌、寄生蟲、真菌和病毒感染所致疾病及腫瘤的DNA疫苗的研究。中國專利CN1316518A公開了一種重組真核表達質粒pS2S，質粒中含有細胞擊落刺激因子，并將重組疫苗質粒與含IL-2和IFN- Y的重做佐劑質粒聯合使用，發現發現重組佐劑質粒可以提高重組疫苗質粒的免疫和治療作用。目前該項目已進入臨床研究階段。將乙肝表面抗原與乙肝核心抗原聯合構建重組疫苗質粒時，現階段通常是利用HBcAg能裝配成直徑為27nm的顆粒狀結構的特點，直接以HBcAg作為表達載體將乙肝病毒表面抗原融合到HBcAg，構建得到融合蛋白疫苗，或者擴增HBV的S和C基因并拼接成SC融合片段，將融合片段插入真核表達載體中構建融合表達HBsAg/HBcAg的重組DNA質粒。但這種方式構建得到的重組DNA質粒，在獲得其中一種抗體滴度時，另一種抗原所產生的抗體滴度很弱，下降明顯。

雖然DNA疫苗的初步臨床試驗結果令人滿意，但其免疫效果還未達到理想水平，因此如何增強免疫效果已成為DNA疫苗研究的關鍵，尤其是在如何保證如何使DNA疫苗可同時獲得較強的HBsAg和HBcAg的免疫效果方面。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于治療乙型肝炎的經優化的重組質粒DNA疫苗，所述的重組質粒DNA疫苗同時攜帶乙肝表面抗原蛋白編碼基因和乙肝核心抗原蛋白編碼基因。本發明中，所述的重組質粒DNA疫苗中的乙肝表面抗原蛋白編碼基因和乙肝核心抗原蛋白編碼基因不是通過直接連接而形成融合蛋白編碼基因的形式，而是通過優化質粒，在重組質粒上設計兩個目的蛋白表達盒，兩編碼基因彼此隔開。本發明中，HBV便面抗原蛋白編碼基因可以是S1S2S蛋白編碼基因、S2S蛋白白編碼基因或S蛋白編碼基因，優選乙肝病毒包膜中蛋白S2S蛋白編碼基因就，所述的乙肝核心抗原蛋白編碼基因為編碼乙肝病毒核心Core蛋白的編碼基因。
本發明中，所述的乙肝病毒S2S蛋白編碼基因，其核苷酸序列與Seq ID N0.5具有至少70%的同源性，優選至少80%的同源性，更優選為至少90%的同源性，最優選為與天然的乙肝病毒中蛋白S2S編碼基因核苷酸序列完全相同。本發明中，所述的乙肝病毒Core蛋白編碼基因，其核苷酸序列與Seq IDN0.11具有至少70%的同源性，優選至少80%的同源性，更優選為至少90%的同源性，最優選為與天然的乙肝病毒核心Core蛋白編碼基因核苷酸序列完全相同。本發明中，構建的重組質粒DNA疫苗還包括大腸桿菌復制起始點ColEl、卡那抗性基因序列Kan及兩個目的蛋白表達盒；其中處于上游位置的表達盒為優化目的蛋白表達盒，其包括來源于SV40的增強子元件Enhancer、轉錄調控元件內含子Intronl和外顯子Exonl、來源于HBV的轉錄后調節元件HPRE。本發明中，構建的重組質粒DNA疫苗可以是優化表達HBV包膜中蛋白S2S的同時表達乙肝核心Core蛋白(C)的重組疫苗質粒PS2S-C，所述的重組疫苗質粒pS2S_C具有如Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；或者是優化表達乙肝核心Core蛋白的同時表達乙肝包膜中蛋白的S2S的重組疫苗質粒pC-S2S，所述的重組疫苗質粒pC-S2S具有如Seq ID N0.2所示的核苷酸序列。本發明中，核心Core蛋白可以是天然的全長核心Core蛋白，也可以是截短后的核心Core蛋白，其截短后的Core蛋白含N末端的144aa,優選為全長的核心Core蛋白。本發明的再一目的在于提供一種含有本發明所述的重組質粒DNA疫苗的組合物，所述的組合物除含有本發明所述重組質粒DNA疫苗外，還可以含有一些其它治療或者具有輔助治療性的藥物，如核苷類治療乙肝的藥物，細胞因子，提高免疫作用的中藥成分等。本發明的再一目的在于提供通過基因重組技術而構建的一種用于治療乙肝的雙質粒DNA疫苗組合物，本發明所述的雙質粒DNA疫苗組合物，包括HBVDNA重組疫苗質粒和白介素-12重組佐劑質粒pIL12。本發明中，提供的 雙質粒DNA疫苗組合物，其中所構建的重組疫苗質粒為攜帶HBV中蛋白S2S編碼基因和核心Core (C)蛋白編碼基因的重組疫苗質粒，在所述的重組疫苗質粒中，抗原的表達先后順序可以是先表達HBV中蛋白S2S后表達HBV核心Core蛋白，即構建的重組質粒為pS2S_C(質粒結構示意圖見圖1),具有如Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；也可以是先表達HBV核心Core蛋白后表達HBV中蛋白S2S，即構建的重組質粒為pC_S2S (質粒結構示意圖見圖2),具有如Seq ID N0.2所示的核苷酸序列。本發明中，所述的重組白介素12佐劑質粒(pIL12)，其中白介素12可以是來源于鼠的白介素12，所述的鼠白介素12可以是大鼠、小鼠或其它鼠的白介素12，所構建重組佐劑質粒pmIL12 (具有如Seq ID N0.4所示的核苷酸序列);也可以是來源于人的白介素12，構建重組佐劑質粒phIL12 (具有如Seq ID N0.3所示的核苷酸序列)。本發明中，所述重組白介素12佐劑質粒還還包括大腸桿菌復制起始點ColEl、卡那抗性基因序列Kan及兩個目的蛋白表達盒，以及來源于SV40的增強子元件Enhancer、免疫調節序列CpG等元件。本發明中，所述的重組疫苗質粒和重組佐劑質粒還可攜帶有多克隆位點區MCS，所述的多克隆位點區包括Swa1、Kpn1、Sail、EcoRV、BgIII等酶切位點。本發明的目的還在于提供一種雙質粒DNA疫苗組合物的構建方法。
1、重組質粒 HBV DNA 疫苗質粒 pS2S_C (pRec2.0_preS2S_C)(I)先構建重組質粒載體骨架pOE-EKS:以pDRVISVl.0為模板，以Primerl與Primer2為引物，其中引物2為5’末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為748bp的復制子區域(Ori)，同時引入EcoR1、KpnI及SwaI酶切位點；Primerl:5， -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’ Primer2:5，-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’以pDRVISVl.0為模板，以Primer3與Primer4為引物，其中引物3為5’末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為1056bp的卡那抗性標記基因(Kan)，同時引入EcoRI酶切位點；Primer3:5， -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’Primer4:5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’將上述兩個片段分別以EcoRI進行單酶切，連接后構建重組克隆pOK-EKS;(2)構建重組質粒 DNA 疫苗 pRec2.0_PreS2.S將合成基因PreS2S通過Xhol+Xbal雙酶切與Sall+Xbal雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-P`reS2S ；所用的合成基因PreS2S委托北京雷默生物科技有限公司合成，其核苷酸序列為具有Seq ID N0.5所示的核苷酸序列:以pDRVISVl.0為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的BGHpolyA區，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-Sal1-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE_PreS2S載體中，獲得重組質粒 pHPRE’ -PreS2S ；Primer5:5， -CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag-3’ Primer6:5，-GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE’ _PreS2S的PreS2S表達盒克隆入載體pOK-EKS 中，構建重組質粒 pRec2.0_PreS2S。(3)構建重組質粒pRec2.0-C將合成基因CPreSl通過Xhol+`Xbal雙酶切與Sall+Xbal雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-CPreSl;合成基因CPreSl的核苷酸序列為Seq ID N0.6所不的核苷酸序列。以pDRVISVl.0為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的BGHpolyA區，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-Sal1-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE-CPreSl載體中，獲得重組質粒 pHPRE’ -CPreSl;通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE’ -CPreSl的CPreSl表達盒克隆入載體pOK-EKS 中，構建重組質粒 pRec2.0-CPreSl;以pRec2.0-CPreSl為模板，以Primer7與Primer8為引物，擴增獲得大小為596bp的Core基因(C)，并通過Pstl+Xbal雙酶切后克隆入Pstl+Xbal雙酶切的pRec2.0-CPreSl載體中，獲得重組質粒pRec2.0-C。Primer7:5， -gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3，Primer8:5，-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，(4)構建重組質粒 pRec2.0-PreS2S_C (pS2S_C)以pRec2.0_C為模板，以Primer9與Primer8為引物，擴增獲得大小為579bp的Core基因(C)，通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得pcDNA3.1-C ；Primer9:5，-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3，Primer8:5，-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.1-C上切出C表達盒，克隆入Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2.0_PreS2S 中，構建獲得重組質粒 pRec2.0_PreS2S_C。2 重組 HBV DNA 疫苗質粒 pC-SM (即 pRec2.0-C-preS2S)以上述步驟(2)中構建得到的pRec2.0_PreS2S為模板，以Primerll與Primerl2為引物，擴增獲得大小為873bp的PreS2S基因，通過HindiΙΙ+XbaI雙酶切與HindiII+XbaI雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接， 構建獲得pcDNA3.l_PreS2S ；Primerll: 5，-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3，Primer 12:5’ -GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3’通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.l_PreS2S上切出PreS2S表達盒，克隆入Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2.0-C 中，構建獲得重組質粒 pRec2.0_C_PreS2S (pC_S2S)。3重組佐劑質粒pmIL12的構建(I)將合成基因mP35 (具有Seq ID N0.7所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_mP35 ；(2)通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.l_mP35中切出mP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2.0_PreS2S中，獲得重組質粒pRec2.0-PreS2S-mP35 ；(3)將合成基因mP40 (具有Seq ID N0.8所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_mP40 ；(4)通過Sall+PvuII雙酶切出mP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒pRec2.0-PreS2S-mP35 中，獲得重組質粒 pRec2.0-PreS2S_mIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2.0-PreS2S_mIL12，共切出3個條帶(1870bp+3448bp+3855bp),回收1870bp片段及3855bp片段，將回收的3855bp片段進行CIP去磷酸化后，與1870bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pmIL12。4重組佐劑質粒phIL12的構建(I)將合成基因hP35 (具有Seq ID N0.9所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l-hP35 ；(2)通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.l_hP35中切出hP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2.0_PreS2S中，獲得重組質粒pRec2.0-PreS2S-hP35 ；(3)將合成基因hP40 (具有Seq ID N0.10所示的核苷酸序列)通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l-hP40 ；(4)通過Sall+PvuII雙酶切出hP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒pRec2.0-PreS2S-hP35 中 ，獲得重組質粒 pRec2.0-PreS2S-hIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2.0_PreS2S_hIL12，共切出3個條帶(1882bp+3446bp+3812bp),回收1882bp片段及3812bp片段，將回收的3812bp片段進行CIP去磷酸化后，與1882bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒phIL12。本發明的再一目的在于提供一種疫苗的制備方法，各質粒(pS2S-C、pC-S2S和PIL12)的制備方法相同，但分開生產，將重組質粒pS2S-C、pC-S2S、pmIL12、phIL12分別轉化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆，含重組質粒的陽性單克隆經發酵培養、擴增，再經裂解和柱純化后得到提純的重組質粒，具體可以為:發酵:在_70°C中取出含有質粒的大腸桿菌DH5ci，用接種環沾取少量菌液，于平皿上挑取單克隆置于5-10ml含有相應抗生素的LB液體培養基中，37°C、200rpm培養10-12h，以1:1000的比例將培養液加入2.5L含相應抗生素的LB培養基，37°C、200rpm培養12-16h后，將培養物進行離心處理，收集菌體，即得含質粒的發酵培養物。裂解:將菌體加Buffer液，輕柔的顛倒離心管數次，室溫放置，使其裂解充分。柱層析:裂解后的菌體通過DNA制備柱，洗脫分離，收集質粒并用有機溶劑沉淀，用生理鹽水溶解質粒DNA即得。為了能夠更加便捷高效地表達本發明所述的重組疫苗質粒和重組佐劑質粒，本發明還構建了含有本發明所述重組質粒的大腸桿菌，應用本發明所述的重組大腸桿菌，可以更為快捷地制備本發明中的各個質粒。大腸桿菌菌株DH5 a /pmIL12，含有重組佐劑質粒pmIL12，通過事先構建重組質粒pmIL12，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編:100101 )，保藏日期:2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌Escherichiacoli，保藏編號為:CGMCCN0.3726。大腸桿菌菌株DH5 a /phIL12,含有重組佐劑質粒phIL12，通過事先構建重組質粒phIL12，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編:100101 )，保藏日期:2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌Escherichiacoli，保藏編號為:CGMCC N0.3727。大腸桿菌菌株DH5 a /pRec2.0_S2S_C，含有重組佐劑質粒pS2S_C，通過事先構建重組質粒PS2S-C，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編=100101)，保藏日期:2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏編號為:CGMCCN0.3728。大腸桿菌菌株DH5 a /pRec2.0-C-S2S，含有重組佐劑質粒pC_S2S，通過事先構建重組質粒PC-S2S，轉化大腸桿菌DH5 α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編=100101)，保藏日期:2010年04月13日，建議的分類名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏編號為:CGMCCN0.3729。本發明的再一目的還在于提供本發明所述的重組質粒DNA疫苗和雙質粒DNA疫苗在制備具有預防和治療乙型病毒性肝炎藥物中的應用。本發明的還一目的在于提供一種本發明所述重組質粒DNA疫苗或雙質粒疫苗在預防和治療乙型肝炎時的免疫給藥方式，其給藥方式可以是皮下注射、肌肉注射或借助電穿孔方式，優選給藥方式為借助電穿孔方式給藥進行免疫或治療。本發明用于治療乙肝的雙質粒DNA疫苗的體外鑒定采用體外轉染293-T和C0S-7細胞，檢測到目的蛋白(HBsAg、HBcAg、IL12)的高水平表達。雙質粒DNA疫苗能誘導機體產生高水平的乙肝表面抗體(HBsAb)及核心抗體(HBcAb)水平和特異性的細胞免疫反應。本發明更值得注意的是，借助于電穿孔技術進行面以后，乙肝雙質粒DNA疫苗能夠誘導出顯著提高的免疫效果。


圖1為重組佐劑質粒phIL12的結構示意圖。圖2為重組佐劑質粒pmIL12的結構示意圖。圖3為重組佐劑質粒pmIL12酶切電泳圖譜，其中:泳道I為經PstI單酶切后，切出的三條普帶，大小為280bp、2100bp、3300bp，其中280bp大小普帶模糊，其余兩條完全正確；泳道2為經NdeI單酶切后切出的2條普帶，大小分別為1900bp、3800bp，兩條帶完
全正確；泳道3為經EcoRI+Bglll雙酶切后切出的兩條普帶，大小分別為1700bp、4000bp，
兩條帶完全正確；泳道4、5 分別為 DL15000、DL2000marker ；泳道6為經EcoRI單切后的線性片段，大小約為5700bp ；泳道7為未進行酶切的重組佐劑質粒pmIL12。圖4為重組佐劑質粒phIL12酶切電泳圖譜，其中:泳道1、2 分別為 DL2000、DL15000markero泳道3為經HindIII單酶切后，切出的三條普帶，大小分別為1496bp、1882bp、2343bp，現實完全正確；泳道4為經EcoRI+Bgl 11雙酶切后，切出的兩條普帶，大小分別為1752、3942bp，兩條帶現實完全正確；泳道5為經EcoRI單酶切后的線性片段，大小約為5700bp ；
泳道6為未進行酶切的重組佐劑質粒phIL12。
具體實施例本發明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發明的范圍或實施方式的限制。本發明的范圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的范圍。在不偏離本發明的精神和范圍的前提下，本領域技術人員可以對本發明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發明的范圍內。所用試劑及材料:大腸桿菌DH5 α購自Invitrogen公司；攜帶轉錄后調節元件(HPRE)的DNA疫苗質粒plnH、質粒pDRVISVl.0由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心病毒免疫室惠贈(該質粒的構建過程及詳細資料已在中國專利CN1560259A中完全公開);真核表達質粒pcDNA3.1購自Invitrogen公司；真核表達載體pHPRE由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心病毒免疫室構建；攜帶內部核糖體進入位點(IRES)的雙順反子表達質粒PlRESneo購自Clontech公司；293T、C0S_7細胞購自于ATCC ;小鼠脾細胞以1640完全培養基培養(10%胎牛血清，Invitrogen公司);各種限制性內切酶、pfu聚合酶、DNA連接試劑Sol I均購自NEB公司；質粒抽提純化試劑盒購自TIANGEN公司；乙肝表面抗原及表面抗體定量ELISA檢測試劑盒(化學發光法)購自北京源德生物科技有限公司。小鼠IFN- Y的ELISP0T檢測試劑盒購自BD公司。抗原刺激肽由北京賽百盛生物技術有限公司合成。基因合成及基因測序工作委托北京英峻生物科技有限公司進行。實施例1重組質粒pRec2.0-preS2S_C (簡寫為pS2S_C)的構建(1)先構建重組質粒載體骨架pOE-EKS，其核苷酸序列為Seq N0.1所標示的核苷酸序列:以pDRVISVl.0為模板，以Primerl與Primer2為引物，其中引物2為5’末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為748bp的復制子區域(Ori)，同時引入EcoR1、KpnI及SwaI酶切位點；Primerl:5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’Primer2:5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’以pDRVISVl.0為模板，以Primer3與Primer4為引物，其中引物3為5’末端磷酸化的引物，擴增獲得大小為1056bp的卡那抗性標記基因(Kan)，同時引入EcoRI酶切位點；Primer3:5> -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’Primer4:5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’將上述兩個片段分別以EcoRI進行單酶切，連接后構建重組克隆P0K-EKS;(2)構建重組質粒 DNA 疫苗 pRec2.0_PreS2.S將合成基因PreS2S通過Xhol+Xbal雙酶切與Sall+Xbal雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-PreS2S ；
以pDRVISVl.0為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的BGHpolyA區，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-Sal1-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE_PreS2S載體中，獲得重組質粒 pHPRE’ -PreS2S ；Primer5:5，-CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag-3’Primer6:5，-GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE’ _PreS2S的PreS2S表達盒克隆入載體pOK-EKS中，構建重組質粒pRec2.0_PreS2S，其核苷酸序列為Seq N0.2所標示的核苷酸序列。(3)構建重組質粒pRec2.0-C將合成基因CPreSl通過Xhol+Xbal雙酶切與Sall+Xbal雙酶切的載體pHPRE連接，構建獲得重組克隆pHPRE-CPreSl;以pDRVISVl.0為模板，以Primer5與Primer6為引物，擴增獲得大小為271bp的BGHpolyA區，同時在上游引入BamHI酶切位點，下游引入Bglll-EcoRV-Sal1-KpnI酶切位點；通過BamHI+Kpnl雙酶切后克隆入Bglll+Kpnl雙酶切的pHPRE-CPreSl載體中，獲得重組質粒 pHPRE’ -CPreSl;通過EcoRI+Kpnl將重組質粒pHPRE’ -CPreSl的CPreSl表達盒克隆入載體pOK-EKS 中，構建重組質粒 pRec2.0-CPreSl;以pRec2.0-CPreSl為模板，以Primer7與Primer8為引物，擴增獲得大小為596bp的Core基因(C)，并 通過Pstl+Xbal雙酶切后克隆入Pstl+Xbal雙酶切的pRec2.0-CPreSl載體中，獲得重組質粒pRec2.0-C0Primer7:5，-gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3JPrimer8:5，-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，(4)構建重組質粒 pRec2.0-PreS2S_C以pRec2.0_C為模板，以Primer9與Primer8為引物，擴增獲得大小為579bp的Core基因(C)，通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得pcDNA3.1-C ；Primer9:5，-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3，Primer8:5，-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.1-C上切出Core表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的pRec2.0_preS2S中，構建獲得重組質粒pRec2.0-PreS2S_C。實施例2 重組質粒 pRec2.0-C-preS2S (pC_S2S)的構建以實施例1中構建得到的pRec2.0_PreS2S為模板，以Primerll與Primerl2為引物，擴增獲得大小為873bp的PreS2S基因，通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得pcDNA3.l_PreS2S ； Primerll: 5，-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3，Primer 12:5’ -GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3’通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.l_PreS2S上切出PreS2S表達盒，克隆入Bglll+EcoRV 雙酶切的 pRec2.0-C 中，構建獲得重組質粒 pRec2.0_C_PreS2S (pC_S2S)。實施例3重組佐劑質粒pmIL12的構建(I)將合成基因mP35通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_mP35 ；(2)通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.l_mP35中切出mP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2.0_PreS2S中，獲得重組質粒pRec2.0-PreS2S-mP35 ；(3)將合成基因mP40通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_mP40 ；(4)通過Sall+PvuII雙酶切出mP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒pRec2.0-PreS2S-mP35 中，獲得重組質粒 pRec2.0-PreS2S_mIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2.0-PreS2S_mIL12，共切出3個條帶(1870bp+3448bp+3855bp),回收1870bp片段及3855bp片段，將回收的3855bp片段進行CIP去磷酸化后，與1870bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pRec2.0_mIL12(pmIL12)。實施例4重組佐劑質粒phIL12的構建(I)將合成基因hP35通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_hP35 ；(2)通過Bglll+Pv uII雙酶切從質粒pcDNA3.l_hP35中切出hP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV雙酶切的質粒pRec2.0_PreS2S中，獲得重組質粒pRec2.0-PreS2S-hP35 ；(3)將合成基因hP40通過Hindlll+Xbal雙酶切與Hindlll+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_hP40 ；(4)通過Sall+PvuII雙酶切出hP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒pRec2.0-PreS2S-hP35 中，獲得重組質粒 pRec2.0-PreS2S-hIL12 ；(5)通過NdeI酶切質粒pRec2.0_PreS2S_hIL12，共切出3個條帶(1882bp+3446bp+3812bp),回收1882bp片段及3812bp片段，將回收的3812bp片段進行CIP去磷酸化后，與1882bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pRec2.0_hIL12。實施例5融合方式構建的重組質粒pcDNA3.1_SC與本發明設計的重組質粒pS2S_C或pC-S2S對小鼠血清特異性抗體的檢測重組質粒pcDNA3.1-SC的構建按文獻方法(周陶友，趙連三，陳敏，等.融合表達HBsAg/HBcAg的重組質粒誘導的小鼠免疫應答)構建得到。6-8周齡Balb/c雌性小鼠購自中國醫學科學院動物繁殖中心，清潔級飼養，30只小鼠隨機分為3組，每組10只，分別腓腸肌注射重組質粒pcDNA3.1-SC (100 μ g)、重組質粒PS2S-C (50μ g)、重組質粒pC-S2S (50 μ g)，于第2、4周后各加強接種I次，采集小鼠血清。小鼠血清特異性抗體檢測:分別于初次接種后第3、5、8、12周采集小鼠眶靜脈血，血清分離后置-80°C保存，將小鼠血清標本按1:5、1:10、1:25、1:50、1:100、1:250、1:500稀釋，采用乙肝病毒抗-HBs和-抗-HBc檢測試劑盒(ELISA法)，對上述標本進行統一檢測。小鼠血清特異性抗體檢查結果抗-HBs:開始接種后3、5、8、12周，pcDNA3.1-SC組小鼠血清抗-HBs陽轉率分別為60%、80%、100%和70%，血清抗-HBs滴度逐漸升高，在第8周達到峰值，而其抗-HBc值較低，僅部分小鼠可以檢測出，但其陽轉率均低于30%。而對于優化的重組質粒PS2S-C組，于開始接種3、5、8、12周后，其血清抗-HBs陽轉率分別為70%、100%、100%和80%，抗體滴度在第5周即可達到峰值，與此同時，血清抗-HBc陽轉率分別為30%、40%、70%和50%，抗體滴度在第三周可達到最高，與重組質粒pcDNA3.1-SC組相比，獲得血清抗-HBc陽轉率顯著要優，差異具有顯著性(P〈0.01);對于優化的重組質粒PC-S2S，于開始接種3、5、8、12周后，其血清抗-HBs陽轉率分別為0、20%、30%和10%，抗-HBs陽轉率較低，均低于30%，但其對于的血清抗-HBc陽轉率分別為80%、100%、100%和90%，血清抗-HBc的滴度明顯要高于pcDNA3.1-SC組。實施例6雙質粒體外細胞瞬時轉染后HBsAg、IL12目的蛋白的表達按常規方法分別培養C0S-7細胞株、293T細胞株于含10%新生小牛血清(FBS)的RPMI1640 (DMEM)培養基中，轉染前24h用胰蛋白酶消化帖壁細胞，重懸于含小牛血清RPMI1640培養液，按3X IO5細胞/孔轉種于6孔培養板中，37 °C、5%C02培養，待帖壁細胞生長達90%融合度，取重組疫苗質粒pS2S-C、pCS2S，重組佐劑質粒pmIL12、phIL12，用 Lipofectamine2000 轉染試劑進行細胞轉染(方法見 Lipofectamine2000protocol,Invitrogen公司)，質粒用量為5 μ g/孔，37°C、5%C02條件進行細胞培養，繼續培養并于轉染后48h收集上清，檢測目的基因的表達量，HBsAg和IL12的定量測定按各自試劑盒的說明書進行，結果見表I和表2。表I重組疫苗質粒體外轉染C0S_7、293T細胞后HBsAg、HBcAg的體外檢測
權利要求
1.重組白介素12佐劑質粒，其特征是所述重組白介素12佐劑質粒包含白介素12P35亞基編碼基因、白介素12P40亞基編碼基因以及兩個目的蛋白表達盒，兩個目的蛋白表達盒將P35亞基編碼基因及P40亞基編碼基因彼此分隔開。
2.根據權利要求1所述的重組白介素12佐劑質粒，其特征在于所述重組佐劑質粒還包括大腸桿菌復制起始點ColEl、卡那抗性基因序列Kan;所述兩個目的蛋白表達盒中，處于上游位置的表達盒為優化目的蛋白表達盒，其包括來源于SV40的增強子元件Enhancer、免疫調節序列CpG。
3.根據權利要求1所述的重組白介素12佐劑質粒，其特征在于所述重組白介素12佐劑質粒為重組人白介素12佐劑質粒(phIL12)或重組鼠白介素12佐劑質粒(pmhIL12)。
4.根據權利要求3所述的重組白介素12佐劑質粒，所述phIL12的核苷酸序列如SeqID N0.3所示，其包含hP35亞基編碼基因和hP40亞基編碼基因，所述hP35亞基編碼基因核苷酸序列如Seq ID N0.9所示，所述hP40亞基編碼基因核苷酸序列如Seq ID N0.10所示。
5.根據權利要求3所述的重組白介素12佐劑質粒，所述pmIL12的核苷酸序列如SeqID N0.4所示，其包含mP35亞基編碼基因和mP40亞基編碼基因，所述mP35亞基編碼基因核苷酸序列如Seq ID N0.7所示,所述mP40亞基編碼基因核苷酸序列如Seq ID N0.8所示。
6.構建權利要求4所述的重組人白介素12佐劑質粒phIL12的方法，其特征在于包括如下步驟: 將合成基因hP35通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_hP35，其中合成基因hP35的核苷酸序列如Seq IDN0.9所示； 通過Bglll+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.l_hP35中切出hP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV 雙酶切的 質粒 pRec2.0_PreS2S 中，獲得重組質粒 pRec2.0_PreS2S_hP35 ； 將合成基因hP40通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l_hP40，其中合成基因hP40的核苷酸序列如Seq IDN0.10所示； 通過Sall+PvuII雙酶切出hP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒pRec2.0-PreS2S-hP35 中，獲得重組質粒 pRec2.0-PreS2S-hIL12 ； 通過NdeI酶切質粒pRec2.0_PreS2S_hIL12，共切出3個條帶(1882bp+3446bp+3812bp),回收1882bp片段及3812bp片段，將回收的3812bp片段進行CIP去磷酸化后，與1882bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒phIL12。
7.構建權利要求5所述的重組鼠白介素12佐劑質粒pmIL12的方法，其特征在于包括如下步驟: 將合成基因mP35通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l-mP35，其中合成基因mP35的核苷酸序列如Seq IDN0.7所示； 通過BglII+PvuII雙酶切從質粒pcDNA3.l_mP35中切出mP35基因表達盒，克隆入Bglll+EcoRV 雙酶切的質粒 pRec2.0_PreS2S 中，獲得重組質粒 pRec2.0-PreS2S_mP35 ； 將合成基因mP40通過HindIII+Xbal雙酶切與HindIII+Xbal雙酶切的載體pcDNA3.1進行連接，構建獲得重組質粒pcDNA3.l-mP40，其中合成基因mP40的核苷酸序列如Seq IDN0.8所示； 通過Sall+PvuII雙酶切出mP40基因表達盒，克隆入Sall+Swal雙酶切的質粒pRec2.0-PreS2S-mP35 中，獲得重組質粒 pRec2.0-PreS2S_mIL12 ； 通過NdeI酶切質粒pRec2.0-PreS2S-mIL12，共切出3個條帶(1870bp+3448bp+3855bp),回收1870bp片段及3855bp片段，將回收的3855bp片段進行CIP去磷酸化后，與1870bp片段進行連接，篩選正向克隆的重組質粒pmIL12 (pmIL12)。
8.一株含有重組佐劑質粒phIL12的大腸埃希氏菌Esherichia coli,保藏編號為:CGMCC N0.3727。
9.一株含有重組佐劑 質粒pmIL12的大腸埃希氏菌Esherichia coli,保藏編號為:CGMCC N0.3726。
全文摘要
本發明涉及一種重組質粒DNA疫苗，本發明重組質粒DNA疫苗同時攜帶乙肝表面抗原蛋白編碼基因和乙肝核心抗原蛋白編碼基因，在所構建的重組質粒DNA疫苗上包括兩個目的蛋白表達盒，其中一個為優化的目的蛋白表達盒，兩個基因之間彼此通過一個目的蛋白表達盒隔開，本發明還涉及一種雙質粒DNA疫苗，該雙質粒DNA疫苗包括本發明所述重組質粒DNA疫苗和重組白介素12佐劑質粒。本發明構建的重組質粒DNA疫苗和及其組合物可用于制備具有預防和治療乙型肝炎的藥物。
文檔編號A61P31/20GK103143032SQ20131009102
公開日2013年6月12日 申請日期2010年4月30日 優先權日2010年4月30日
發明者李鼎峰, 劉勇, 周德勝, 張春麗 申請人:北京凱因科技股份有限公司, 北京凱因生物技術有限公司