專利名稱：具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架及其制備方法，屬于骨組織工程支架與藥物緩釋領域。
背景技術：
研制合適的支架材料來治療骨缺損疾病一直是骨組織工程學研究的一個熱點課題。作為骨組織工程的關鍵要素之一，理想的三維支架要求有合適的孔徑尺寸、高的孔隙率和高度貫通的孔隙結構，以利于氧分、營養物質與代謝產物的交換，為細胞的大量種植和增殖、細胞外基質的分泌、以及血管和神經的內生長提供空間和環境。將骨組織工程支架材料植入缺損部位時，首要問題就是面臨著炎癥甚至是骨髓炎、骨壞死和敗血癥等并發癥的風險。最理想的方法是能夠在患病部位進行局部給藥，這樣既能夠保證患病部位有足夠的藥物而且能持續給藥，同時又盡量避免影響其他正常的組織。因此，集骨修復與藥物緩釋二者相結合的三維多孔支架引起了越來越多科研工作者的關注。針對上述目的，目前人工合成支架材料的研究集中于生物陶瓷和聚合物兩類。生物陶瓷類支架(如羥基磷灰石(HA)、β-磷酸三鈣(β-TCP))用于局部藥物緩釋的缺陷在于:由于這類支架一般采取傳統的浸潰的方式將藥物負載于支架上，因此藥物釋放規律很難得到調控。而聚合物支架(如聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL))盡管能通過聚合物自身的降解來調控藥物的釋放，但是聚合物難以在體內與骨組織直接鍵合，且親水性較差，不利于細胞粘附；降解較慢， 且降解產物為酸性物質，這對細胞的成長不利；力學強度也較低。為克服以上缺點，主要采取將聚合物與生物陶瓷材料復合的方法。在支架制備的工藝上，快速原型技術(又稱自由成型制造，Rapid Prototyping,簡稱RP技術)與氣體發泡、相分離、粒子析出和溶液澆注等這些支架制備的傳統工藝方法相比，在骨組織工程支架的制備上RP技術表現出無法比擬的獨特優勢，它能夠對支架的孔尺寸、孔隙幾何形狀、孔的互聯性、孔的空間分布以及支架內部通道的結構進行比較精確地控制，因此將快速原型技術用來制備三維多孔骨組織工程支架得到了越來越多的研究。但是，結合快速原型技術的獨特優勢，將之用于載藥型骨組織工程支架的制備，鮮有文獻報道，并且現有文獻中主要采用的技術手段是以聚乙烯醇(PVA，Polyving akohol)為粘結劑將成形原材料制成衆料(Paste/Slurry)來成形支架,但是PVA是一種水溶性高分子聚合物，在藥物釋放的過程中會由于水的作用造成支架三維結構的坍塌，并且暴釋急劇，因此不能對骨修復部位進行較長時間地局部給藥。MAM(Motor Assisted Microsyringe,電機助推微注射器)自由成形技術是RP技術的數十種具體工藝中的一種，它是一種新型的骨組織工程支架制備工藝，其獨特優勢在于可選擇的成形原材料廣泛，可以是自行設計或選擇的由聚合物、金屬或陶瓷等構成的溶液(Solution,水溶液或溶劑溶液)、膠體(Colloid)、懸浮液(Suspension)、衆料(Slurry)或熔融體(Melt)，因此有很強的通用性和適應性。綜上所述，本領域缺乏對具有高度有序多孔結構、高度貫通性孔道并且能對骨修復部位進行較長時間局部給藥的有機/無機復合支架的研究。因此，本領域迫切需要開發借助于RP技術制備的具有藥物緩釋性能的有機/無機復合支架。

發明內容
本發明的第一目的在于獲得一種制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法。本發明的第二目的在于獲得一種具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。本發明的第三目的在于獲得一種制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的骨移植物。本發明的第四目的在于獲得一種具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的用途。在本發明的第一方面，提供了一種制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法，所述方法包括以下步驟:(I)有機/無機/藥物復合材料的制備，所述制備步驟包括:(Ia)提供具有生物可降解性的脂溶性有機聚合物材料，將所述有機聚合物材料溶解于相應的有機溶劑，得到濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液；所述有機聚合物 材料選自聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、丙醇酸(PGA)或其組合；所述有機溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲亞砜、1，4-二氧六環或其組合；(Ib)提供藥物，將所述藥物在上述(Ia)中所得到的聚合物溶液中分散均勻，得到混合溶液；所述的藥物選自布洛芬(IBU)、慶大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)、或阿侖勝 Ife納(AL)；(Ic)提供具有骨誘導性的無機粉體，將具有骨誘導性的無機粉體在上述(Ib)中所得到的混合溶液分散均勻，得到均勻分散液；所述具有骨誘導性的無機粉體選自磷酸鈣類生物材料、生物活性玻璃類生物材料或其組合；(Id)采用梯度揮發溶劑的方式去除(Ic)中所得到的混合溶液中的有機溶劑，獲得的方式有機/無機/藥物復合材料；(2)將所述步驟(I)中所獲得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備的擠料腔中，形成具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。在一個具體實施方式
中，本發明的制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法包括以下步驟:(I)有機/無機/藥物復合材料的制備，所述制備步驟包括:(a)室溫下，提供具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，將有機聚合物溶解于相應的有機溶劑，制成濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液；有機溶劑可以是二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲亞砜和1，4-二氧六環。所述的聚合物是，此類聚合物具有相對較高的力學強度，且在降解過程中不會因水分子的作用導致支架三維結構的明顯變形和坍塌，這類材料可以是聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)和聚丙醇酸(PGA)；(b)將藥物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，繼續攪拌使藥物分散均勻。所述的藥物可以是布洛芬(IBU)、慶大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)和阿侖膦酸鈉(AL)，其中優選IBU ；(C)將過篩后的無機粉體加入上述(b)中所得到的混合溶液中，繼續攪拌使無機粉體分散均勻。所述的無機粉體具有骨誘導性，可以是磷酸鈣類生物材料(如β_磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石(HA))和生物活性玻璃類生物材料(如介孔生物活性玻璃(MBG))；(d)完全去除(C)中所得到的混合溶液中的有機溶劑，采用梯度揮發溶劑的方式，具體步驟如下:①將(C)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，混合溶液粘度增大；②將①中所得到的混合溶液倒入培養皿中，置于室溫下進一步揮發溶劑；③將②中所得到的復合材料從培養皿中揭下，置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；④將③中的復 合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到有機/無機/藥物復合材料。(2)有機/無機/藥物復合支架的制備:將(I)中所制得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備(MAM-1IFreeform Fabrication System,見


I)的擠料腔中，設置好相關參數，在計算機的控制下，將擠料腔中的材料經噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成三維多孔支架。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Ia)中，所述有機聚合物材料在室溫下溶解于相應的有機溶劑，得到濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Ib)中，所提供的藥物是布洛芬(IBU)。本發明中，可以根據所需要的藥物的相關性質來選擇合適的有機聚合物，以避免在支架制備過程中藥物活性的喪失。本發明中，可以任意添加藥物量來滿足不同時期對藥物量的需求。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Ic)中，所述磷酸鈣類生物材料選自β -磷酸三鈣(β -TCP)、羥基磷灰石(HA)或其組合；和/或所述生物活性玻璃類生物材料選自介孔生物活性玻璃(MBG)。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Id)中，包括如下步驟:①將(Ic)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，直至混合溶液粘度增大；②將①中所得到的混合溶液置于室溫下進一步揮發溶劑，得到復合材料；③將②中所得到的復合材料置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；
④將③中的復合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到所述有機/無機/藥物復合材料。在一個具體實施方式
中，包括如下步驟:①將(Ic)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，直至混合溶液粘度增大；②將①中所得到的混合溶液倒入培養皿中，置于室溫下進一步揮發溶劑；③將②中所得到的復合材料從培養皿中揭下，置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；④將③中的復合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到有機/無機/藥物復合材料。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(2)中，將(Id)中所制得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備的擠料腔中，設置好相關參數，在計算機的控制下，將擠料腔中的材料經噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。在本發明的一個具體實施方式
中，所述有機/無機/藥物復合材料中的比例為:20:0 5:2 5，依序分別為具有生物可降解性的脂溶性有機聚合物材料、所述具有骨誘導性的無機粉體和藥物的重量比例。本發明的第二方面提供一種本發明所述的方法制備得到的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。在本發明的一個具體實施方式
中，所述有機/無機/藥物復合材料中的比例為:20: (O 5): (2 5)，依序分別為具有生物可降解性的脂溶性有機聚合物材料、所述具有骨誘導性的無機粉體和藥物的重量比例。更優選的，所述三維多孔支架具有高度有序的孔結構，并且90% 99.999%的大孔都是互相連通的；所制備的支架具有高度貫通性，能有利于氧分、營養物質與代謝產物的交換。本發明的第三方面提供一種移植物，所述移植物含有如本發明所述的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架和接種于所述復合三維多孔支架的干細胞，所述干細胞選自骨髓基質干細胞或脂肪干細胞，并且干細胞的接種量為2 X IO6 5 X IO7個細胞/cm3復合三維多孔支架。本發明的第四方面提供一種本發明所述的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的用途，用于制備骨移植物的支架。

圖1 MAM自由成形機及其工作原理圖:活塞桿由直線步進電機驅動，當外部計算機發出指令后，直線步進電機驅動活塞桿，在成形頭中，由于電熱棒的作用，材料呈熔融狀態，并在活塞桿的推擠下，通過噴嘴涂覆在工作臺上。與此同時，外部計算機將工件三維模型沿高度方向切片的截面層輪廓數據傳至控制系統，此系統驅動工作臺與成形頭沿X-Y方向做合成運動，從而使涂覆并凝固在工作臺上的材料形成工件相應的截面輪廓。完成一層的涂覆后，成形頭上升一個截面層的厚度，然后重復進行下一個截面輪廓的涂覆，直至完成整個工件的成形。
圖2實施例1 5中所制備的支架的光學照片。所有支架的幾何形狀均遵循計算機對模型參數的設置，具有極小的不規則性。圖3實施例1 5中所制備的支架的表面及斷面掃描電鏡圖。所有支架均具有高度貫通性，孔尺寸在260um左右，線條寬度在320um左右，很接近相關的參數設計值，體現了快速原型技術對支架工藝參數的精確可控性。圖4實施例1 5中所制備的支架的親水性比較。藥物相的含量和無機相的含量均能改變支架的親水性，并且無機相的摻入更能顯著改善支架的親水性，這對支架表面細胞的貼附有利。圖5實施例1 5中所制備的支架的力學性能比較。藥物含量的增加會導致支架抗壓模量的下降，一定量的無機相的摻入能顯著提高支架的抗壓模量，但是過多無機相的摻入反而會降低支架的力學性能。圖6實施例1 5中所制備的支架在降解過程中PH值變化情況的比較。實施例5中支架在降解過程中的PH值在前4周降解中由7.4持續降低至4.6，并繼續保持在較低水平，而實施例1、2、3和4(含有無機相β-磷酸三鈣)第I周明顯降低之后逐步上升，并保持較高的PH值。這表明支架組分間的比例對降解過程中溶液PH值變化影響很大，無機相的摻入對聚合物在降解過程中產生酸性物質導致的PH值降低有一定的補償作用。圖7實施例1 5中所制備的支架在降解過程中質量損失百分比變化情況的比較。實例I 3對比可以得出結論:由于藥物的溶解，藥物含量越大，質量損失越大；實例3 5對比可以得出結論:無機相的摻入加快了支架的降解。因此，可以通過改變組分間的相對比例可以在很大程度上來調控支架的降解行為。圖8實施例1 5中所制備的支架體外藥物釋放曲線比較。所有支架的藥物釋放分為突釋和緩釋兩個階段，并且隨著藥物含量和無機相的改變，釋放規律也隨之變化。因此，可以通過改變藥物含量以及摻入無機相等方法來調控支架中藥物的釋放行為。圖9實施例1 5中所制備的支架體外藥物釋放液的抗菌活性比較(a為對照組，b f分別對應于實施例1 5)。實施例1 5中所制備支架的3d藥物釋放液呈現出不同的殺菌效果，此結果與圖7的藥物釋放曲線的結果一致。這表明:本發明中支架的制備方法并沒有造成藥物的抗菌活性的喪失。圖10實施例6中所制備的支架的體外藥物釋放曲線。
具體實施例方式本發明涉及一種具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架及其制備方法。借助于MAM(Motor Assisted Microsyringe,電機助推微注射器)自由成形技術,在計算機的控制下，將擠料腔內具有一定流動性的無機/有機/藥物復合材料經噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成三維多孔支架。本發明制備工藝簡單易行，成本低，效率高，無需對支架進行后處理，計算機控制，所制得的含有藥物的三維多孔復合支架適宜于藥物的負載和緩釋，在骨組織工程領域具有廣闊的應用前景。本發明中，術語“含有”或“包括”表示各種成分可一起應用于本發明的混合物或組合物中。因此，術語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術語“含有”或“包括”中。

以下對本發明的各個方面進行詳述:
制備方法在本發明的第一方面，提供了一種制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法，所述方法包括以下步驟:(I)有機/無機/藥物復合材料的制備，所述制備步驟包括:(Ia)提供具有生物可降解性的脂溶性有機聚合物材料，將所述有機聚合物材料溶解于相應的有機溶劑，得到濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液；所述有機聚合物材料選自聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、丙醇酸(PGA)或其組合；所述有機溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲亞砜、1，4-二氧六環或其組合；(Ib)提供藥物，將所述藥物在上述(Ia)中所得到的聚合物溶液中分散均勻，得到混合溶液；所述的藥物選自布洛芬(IBU)、慶大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)、或阿侖勝 Ife納(AL)；(Ic)提供具有骨誘導性的無機粉體，將具有骨誘導性的無機粉體在上述(Ib)中所得到的混合溶液分散均勻，得到均勻分散液；所述具有骨誘導性的無機粉體選自`磷酸鈣類生物材料、生物活性玻璃類生物材料或其組合；(Id)采用梯度揮發溶劑的方式去除(Ic)中所得到的混合溶液中的有機溶劑，獲得的方式有機/無機/藥物復合材料；(2)將所述步驟(I)中所獲得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備的擠料腔中，形成具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。發明人經過廣泛和深入的試驗，選擇了特定的可以在相應有機溶劑中溶解的有機聚合物材料，且所述有機聚合物材料具有相對較高的力學強度，且在降解過程中不會因水分子的作用導致支架三維結構的明顯變形和坍塌。在一個具體實施方式
中，本發明的制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法包括以下步驟:(I)有機/無機/藥物復合材料的制備，所述制備步驟包括:(a)室溫下，提供具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，將有機聚合物溶解于相應的有機溶劑，制成濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液；有機溶劑可以是二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲亞砜和1，4-二氧六環。所述的聚合物是，此類聚合物具有相對較高的力學強度，且在降解過程中不會因水分子的作用導致支架三維結構的明顯變形和坍塌，這類材料可以是聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)和聚丙醇酸(PGA)；(b)將藥物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，繼續攪拌使藥物分散均勻。所述的藥物可以是布洛芬(IBU)、慶大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)和阿侖膦酸鈉(AL)，其中優選IBU ；(c)將過篩后的無機粉體加入上述(b)中所得到的混合溶液中，繼續攪拌使無機粉體分散均勻。所述的無機粉體具有骨誘導性，可以是磷酸鈣類生物材料(如β_磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石(HA))和生物活性玻璃類生物材料(如介孔生物活性玻璃(MBG))；(d)完全去除(C)中所得到的混合溶液中的有機溶劑，采用梯度揮發溶劑的方式，具體步驟如下:①將(c)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，混合溶液粘度增大；②將①中所得到的混合溶液倒入培養皿中，置于室溫下進一步揮發溶劑；③將②中所得到的復合材料從培養皿中揭下，置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；④將③中的復合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到有機/無機/藥物復合材料。(2)有機/無機/藥物復合支架的制備:將(I)中所制得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備(MAM-1IFreeform Fabrication System,見

I)的擠料腔中，設置好相關參數，在計算機的控制下，將擠料腔中的材料經 噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成三維多孔支架。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Ia)中，所述有機聚合物材料在室溫下溶解于相應的有機溶劑，得到濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液。本發明中，所述的聚合物是具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，此類聚合物具有相對較高的力學強度，且在降解過程中不會因水分子的作用導致支架三維結構的明顯變形和坍塌。與水溶性高分子聚合物相比，脂溶性高分子聚合物所制備的支架具有較高的力學強度，并且在支架降解過程中能一直較好地保持支架的三維結構。關于高分子聚合物溶液的濃度:本發明優選5% 10%(w/v)，其中w為聚合物的重量，V為溶劑的體積。若濃度過高，則溶液的粘度大，會影響原材料間混合均勻性，進而影響支架的成形；濃度過低，盡管混合均勻比較容易，但是對后面溶劑的揮發去除造成困難。關于支架原材料組分間的復合方式:本發明采用在有機溶劑介質中混合支架各組分，與一般采取的熱熔機械攪拌混合這一方式相比，優勢在于:①本發明給予了較大的混合空間，并且混合溶液的粘度比熔化時的高分子聚合物溶液小很多，這就給混合的均勻性提供了條件，并且原材料間混合的均勻性對后續支架能否順利成形具有重要影響一一只有原材料復合均勻，從MAM自由成形機的噴嘴里擠出的絲料材具有較好的粘接性，這是支架完成整個三維構件的加工以及工藝可重復必須滿足的要求；關于復合溫度，所述材料的復合在室溫下進行，這就有效的避免了加熱熔化高分子聚合物時所施加的高溫導致的藥物分解。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Ib)中，所提供的藥物是布洛芬(IBU)。本發明中，可以根據所需要的藥物的相關性質來選擇合適的有機聚合物，以避免在支架制備過程中藥物活性的喪失。本發明中，可以任意添加藥物量來滿足不同時期對藥物量的需求。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Ic)中，所述磷酸鈣類生物材料選自β -磷酸三鈣(β -TCP)、羥基磷灰石(HA)或其組合；和/或所述生物活性玻璃類生物材料選自介孔生物活性玻璃(MBG)。
在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(Id)中，包括如下步驟:①將(Ic)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，直至混合溶液粘度增大；②將①中所得到的混合溶液置于室溫下進一步揮發溶劑，得到復合材料；③將②中所得到的復合材料置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；④將③中的復合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到所述有機/無機/藥物復合材料。在一個具體實施方式
中，包括如下步驟:①將(Ic)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，直至混合溶液粘度增大；②將①中所得到的混合溶液倒入培養皿中，置于室溫下進一步揮發溶劑；③將②中所得到的復 合材料從培養皿中揭下，置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；④將③中的復合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到有機/無機/藥物復合材料。本發明采取加溶劑一完全去除溶劑一支架成形這一方式，已有文獻中是用有機溶劑將原材料配制成漿料的狀態成形支架，然后對支架進行去除溶劑的后處理，可能出現的問題包括:①溶劑去除過程中導致支架三維結構的變形和翹曲以及支架內部產生氣泡，破壞了支架構形的完整性，同時也降低了支架的力學強度；②有機溶劑很難完全從支架里直接去除，導致有機溶劑在支架內部的殘留，可能會造成細胞毒性問題。所以，本發明對這些問題做出了改進。本發明提出一種梯度揮發溶劑的方法來完全去除原材料復合過程中所使用的有機溶劑，混合溶液的粘度逐步由小到大，最后至完全去除得到干燥的復合材料。在溶劑揮發過程中，可能會出現的無機粉體沉降和團聚以及產生氣泡，從而破壞了材料混合后的均勻性，這對后續的支架成形不利，原理如前所述。也即，本發明的一種梯度揮發溶劑的方法來完全去除材料復合過程中所使用的有機溶劑，能有效地避免在溶劑揮發過程中可能會出現的無機粉體沉降、團聚等問題，為后續支架的成形奠定基礎。關于水浴溫度的選擇:水浴攪拌使有機溶劑盡快大量揮發至較高粘度的狀態，這是避免無機粉體沉降和團聚的關鍵一步，所選擇的溫度建議略高于所使用的有機溶劑的沸點為佳。在本發明的一個具體實施方式
中，所述步驟(2)中，將(Id)中所制得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備的擠料腔中，設置好相關參數，在計算機的控制下，將擠料腔中的材料經噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。本發明中，可以通過計算機改變網格寬度和填充方式等參數來對支架的形狀以及支架的孔隙率、孔大小、孔形狀進行比較精確地控制。本發明中，MAM自由成形機中支架成形時的工藝參數的優選選擇方式:支架成形時的工藝參數如擠料腔溫度、噴嘴溫度、XY平臺運動速度、擠壓頭的擠料速度等需要不斷的嘗試與摸索，特別是所選擇的溫度必須結合所使用的高分子聚合物的玻璃化轉變溫度、熔點以及所選擇的藥物的熔點及分解溫度，工藝溫度不能超過藥物的分解溫度，否則會導致藥物的分解及藥物失效。具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架本發明的第二方面提供一種本發明所述的方法制備得到的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。在本發明的一個具體實施方式
中，所述有機/無機/藥物復合材料中的比例為:20:0 5:2 5。發明人發現，藥物相的含量和無機相的含量均能改變支架的親水性，并且無機相的摻入更能顯著改善支架的親水性，這對支架表面細胞的貼附有利。藥物含量的增加會導致支架抗壓模量的下降，一定量的無機相的摻入能顯著提高支架的抗壓模量，但是過多無機相的摻入反而會降低支架的力學性能。同時發現，支架組分間的比例對降解過程中溶液PH值變化影響很大，無機相的摻入對聚合物在降解過程中產生酸性物質導致的PH值降低有一定的補償作用。為此，為了解決上述矛盾，發明人認為所述有機/無機/藥物復合材料中的優選比例為:20:(0 5):(2 5)。這樣，本發明中支架的制備方法并沒有造成藥物的抗菌活性的喪失；且同時能獲得較好的抗壓模量、親水性(影響支架表面細胞的貼附)與降解性能。
在此范圍內，可以通過改變組分間的相對比例可以在很大程度上來調控支架的降解行為。還可以通過改變藥物含量以及摻入無機相等方法來調控支架中藥物的釋放行為。綜上所述，本發明中，可以通過改變支架組分間的比例，來實現對支架力學性能、降解性、藥物釋放行為以及抗菌性能的可控。此外，在保證支架對孔尺寸、孔隙率和孔道貫通性要求的同時，通過改變支架組分間的相對比例，可以對支架的力學性能、降解性、藥物釋放以及抗菌性進行調控。

具體的，所得到三維多孔支架具有高度有序的孔結構，并且90% 99.999%的大孔都是互相連通的；所制備的支架具有高度貫通性，能有利于氧分、營養物質與代謝產物的交換。移植物與干細胞本發明的第三方面提供一種移植物，所述移植物含有如本發明所述的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架和接種于所述復合三維多孔支架的干細胞，所述干細胞選自骨髓基質干細胞或脂肪干細胞，并且干細胞的接種量為2 X IO6 5 X IO7個細胞/cm3復合三維多孔支架。本發明的第四方面提供一種本發明所述的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的用途，用于制備骨移植物的支架。本發明的干細胞的來源沒有特別限制，可以是任何來源的干細胞，通常，本發明的干細胞是自體的、或同種異體的干細胞。獲取干細胞的部位也沒有特別限制，可以是脂肪干細胞、骨髓基質干細胞或其他干細胞。此外，成骨細胞也可替代干細胞用作骨組織工程化構建的種子細胞。優選的，所述干細胞選自骨髓基質干細胞。可用于本發明的干細胞可以來自任何脊椎動物，較佳地是哺乳動物，更佳地是靈長類動物，尤其是人。盡管自體的干細胞是優選的，但異體的干細胞的來源更為常用。研究已表明，不同生長、發育階段的同種異體干細胞，可以在有組織相容性差異并且具有完全免疫功能的同種異體動物體內形成干細胞組織。分離和獲得干細胞的方法是本領域中已知的。一種優選的方法是密度梯度離心法和酶消化法。干細胞的培養方法和培養液也是本領域中熟知的。一種優選的方法是將干細胞在37°C、飽和濕度、5%C02培養箱內培養。合適的培養液包括(但并不限于):1)DMEM培養基((Gibco公司)+5 20%胎牛血清；2) DMEM培養基+5 20%小牛血清；3) DMEM培養基+5 20%自體(異體)人血清。此外，上述培養液中添加各種生長因子(例如促進干細胞生長的細胞因子等)、各種抗生素、各種誘導因子。適用于本發明的干細胞應能在體內或體外增殖。一種優選的干細胞是體外培養的骨髓基質干細胞。由于本發明的支架與骨髓基質干細胞和脂肪干細胞特別是骨髓基質干細胞的相容性非常好，因此特別適合作為骨修復的支架材料。將體外培養擴增的骨髓基質干細胞和/或脂肪干細胞接種到生物相容性優異的支架形成干細胞一生物活性玻璃復合物，將這一“干細胞一復合三維支架”復合物植入到缺損部位，隨著無機材料的逐漸降解吸收，新骨形成，達到修復骨缺損的目的。本發明的組織工程骨移植物的制備方法簡便，將一定數量的骨髓基質干細胞和/或脂肪干細胞接種于生物活性玻璃即可。本發明的組織工程化骨移植物的形狀沒有特別限制，可以按照組織缺損的形狀任意塑形。通常，移植物為長條形。本發明組織工程化骨中的骨髓基質干細胞和/或脂肪干細胞濃度通常約為
0.5 X IO6/cm3 (支架體積)至5 X IO8/cm3或更高，較佳地為I X IO6/cm3至I X IO8/cm3,更佳地為5 X IOfVcm3至5 X IOVcm3無稽材料。通常，以培養液調整骨髓基質干細胞和/或脂肪干細胞濃度，然后與可降解材料混合。混合時，培養液與可降解材料的比例沒有特別限制，但是以該材料能夠吸附的培養液最大量為宜。此外，在本發明的組織工程化骨移植物中，還可添加或復合其他各種細胞、生長因子、各種抗生素，從而保持骨髓基質干細胞和/或脂肪干細胞表型、促進骨髓基質干細胞和/或脂肪干細胞生長，以及促進組織工程化骨在體內生長。除了將組織工程化骨移植物植入體內之外，還將其置于體外生物反應器內培養，從而進行組織工程化骨的構建，在體外形成具有一定組織學結構、生化組成與生物力學強度的組織工程化骨。用本發明方法形成的組織工程化骨移植物，可直接植入體內的骨缺損處。本發明的優選實施方式本發明的目的是提出一種基于MAM自由成形技術的新型的具有藥物緩釋作用的、以脂溶性聚合物為有機相的有機/無機復合三維多孔支架及其制備方法。提出一種梯度揮發溶劑的方法來完全去 除材料復合過程中所使用的有機溶劑，能有效地避免在溶劑揮發過程中可能會出現的無機粉體沉降、團聚等問題，為后續支架的成形奠定基礎。此外，在保證支架對孔尺寸、孔隙率和孔道貫通性要求的同時，通過改變支架組分間的相對比例，可以對支架的力學性能、降解性、藥物釋放以及抗菌性進行調控。
制備本發明的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法包括以下步驟:(1)有機/無機/藥物復合材料的制備:(a)室溫下，將有機聚合物溶解于相應的有機溶劑，制成濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液。所述的有機溶劑可以是二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲亞砜和1，4_ 二氧六環。所述的聚合物是具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，，此類聚合物具有相對較高的力學強度，且在降解過程中不會因水分子的作用導致支架三維結構的明顯變形和坍塌，這類材料可以是聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)和聚丙醇酸(PGA)；(b)將藥物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，繼續攪拌使藥物分散均勻。所述的藥物可以是布洛芬(IBU)、慶大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)和阿侖膦酸鈉(AL)，其中優選IBU ；(c)將過篩后的無機粉體加入上述(b)中所得到的混合溶液中，繼續攪拌使無機粉體分散均勻。所述的無機粉體具有骨誘導性，可以是磷酸鈣類生物材料(如β_磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石(HA))和生物活性玻璃類生物材料(如介孔生物活性玻璃(MBG))；(d)完全去除(C)中所得到的混合溶液中的有機溶劑，采用梯度揮發溶劑的方法，具體步驟如下:①將(C)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，混合溶液粘度增大；②將①中所得到的混合溶液倒入培養皿中，置于室溫下進一步揮發溶劑；③將②中所得到的復合材料從培養皿中揭下，置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；④將③中的復合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到有機/無機/藥物復合材料。(2)有機/無機/藥物復合支架的制備:將⑴中所制得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備(MAM-1IFreeform Fabrication System)的擠料腔中，設置好相關參數,在計算機的控制下,將擠料腔中的材料經噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成三維多孔支架。本發明的有益效果:本發明的骨組織工程支架具有持久、高效的殺菌、抗感染能力，為骨缺損的修復提供了一種新型的支架材料。本發明中骨組織工程支架的制備方法簡單，可選材料靈活，制備的多孔支架不僅具有適合于成骨細胞生長的空間結構，而且能在患病的局部區域進行持續給藥達到藥物緩釋的效果。下面對本發明方法做進一步的說明:⑴本發明是針對脂溶性高分子聚合物為有機相的有機/無機復合支架的制備方法:與水溶性高分子聚合物相比，脂溶性高分子聚合物所制備的支架具有較高的力學強度，并且在支架降解過程中能一直較好地保持支架的三維結構。⑵支架原材料組分間的復合方式:本發明采用在有機溶劑介質中混合支架各組分，與一般采取的熱熔機械攪拌混合這一方式相比，優勢在于:①本發明給予了較大的混合空間，并且混合溶液的粘度比熔化時的高分子聚合物溶液小很多，這就給混合的均勻性提供了條件，并且原材料間混合的均勻性對后續支架能否順利成形具有重要影響——只有原材料復合均勻，從MAM自由成形機的噴嘴里擠出的絲料材具有較好的粘接性，這是支架完成整個三維構件的加工以及工藝可重復必須滿足的要求；②原材料的復合在室溫下進行，這就有效的避免了加熱熔化高分子聚合物時所施加的高溫導致的藥物分解。⑶高分子聚合物溶液的濃度:本發明推薦5% 10%(w/v)，濃度過高，則溶液的粘度大，會影響原材料間混合均勻性，進而影響支架的成形；濃度過低，盡管混合均勻比較容易，但是對后面溶劑的揮發去除造成困難。⑷水浴溫度的選擇:水浴攪拌使有機溶劑盡快大量揮發至較高粘度的狀態，這是避免無機粉體沉降和團聚的關鍵一步，所選擇的溫度建議略高于所使用的有機溶劑的沸點為佳。(5)本發明采取加溶劑一完全去除溶劑一支架成形這一方式，已有文獻中是用有機溶劑將原材料配制成漿料的狀態成形支架，然后對支架進行去除溶劑的后處理，可能出現的問題包括:①溶劑去除過程中導致支架三維結構的變形和翹曲以及支架內部產生氣泡，破壞了支架構形的完整性，同時也降低了支架的力學強度有機溶劑很難完全從支架里直接去除，導致有機溶劑在支架內部的殘留，可能會造成細胞毒性問題。所以，本發明對這些問題做出了改進。(6)梯度揮發溶劑的方法:本發明提出一種梯度揮發溶劑的方法來完全去除原材料復合過程中所使用的有機溶劑，混合溶液的粘度逐步由小到大，最后至完全去除得到干燥的復合材料。在溶劑揮發過程中，可能會出現的無機粉體沉降和團聚以及產生氣泡，從而破壞了材料混合后的均勻性，這對后續的支架成形不利，原理同⑵中所述。通過本發明實驗過程中的摸索與嘗試，發現梯度揮發溶劑的方法能有效地避免這個問題。(7) MAM自由成形機中支架成形時的工藝參數的選擇:支架成形時的工藝參數如擠料腔溫度、噴嘴溫度、XY平臺運動速度、擠壓頭的擠料速度等需要不斷的嘗試與摸索，特別是所選擇的溫度必須結合所使用的高分子聚合物的玻璃化轉變溫度、熔點以及所選擇的藥物的熔點及分解溫度，工藝溫度不能超過藥物的分解溫度，否則會導致藥物的分解及藥物失效。如無具體說明，本發明的各種原料均可以通過市售得到；或根據本領域的常規方法制備得到。除非另有定義或說明，本文中所使用的所有專業與科學用語與本領域技術熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。本發明的其他方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照國家標準測定。若沒有相應的國家標準，則按照通用的國際標準、常規條件、或按照制造廠商所建議的條件進行。除非另外說明，否則所有的份數為重量份，所有的百分比為重量百分比，所述的聚合物分子量為數均分子量。除非另有定義或說明， 本文中所使用的所有專業與科學用語與本領域技術熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。
實施例 下面以具體實施例對本發明做進一步說明。實施所用的主要原料為聚乳酸(分子量8萬)、四水合硝酸鈣、磷酸氫二銨、正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷三嵌段共聚物(P123)、鹽酸、氯仿、布洛芬；所用設備主要為快速原型設備(MAM-1I FreeformFabrication System)。實施例1:(I) β -磷酸三鈣(β -TCP)粉體的合成:(a)稱取115.42g Ca(NO3)2.4H20于2L燒杯中，加去離子水967.74ml，并氨水調節 pH 在 8.2±0.I [Ca]；(b)稱取43.03g (NH4) 2即04于31^燒杯中，加去離子水645.16mL,并氨水調節pH在8.2±0.I [P]；(C)將Ca溶液置于250mL分液漏斗中，緩慢滴加于P溶液中(可直接用滴管滴加)，并用氨水將溶液PH維持在8.2±0.1 ;(d)將混合溶液攪拌24h，得到的沉淀去離子水抽濾3次，醇洗I次；(e)100°C 干燥，除水；(f)850°C燒結，保溫 2h，升溫速率 4°C /min。得到的粉體過 200目篩備用。(2)聚乳酸/β_磷酸三鈣/布洛芬復合材料(20:5:2，w/w/w)的制備:(a)室溫下，將20g聚乳酸溶解于200ml氯仿中，得到聚乳酸溶液；(b)將2g布洛芬藥物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，繼續攪拌使藥物分散均勻；(C)將(I)中β-TCP粉體加入上述(b)中所得到的混合溶液中，繼續攪拌使無機粉體分散均勻；(d)將(C)中所得到的混合溶液在70°C水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，混合溶液粘度增大；(e)將(d)中所得到的混合溶液倒入培養皿中，置于室溫下進一步揮發溶劑；(f)將(e)中所得到的復合材料從培養皿中取出，置于60°C鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑；(g)將(f)中的復合材料置于60°C真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑。(2)聚乳酸/ β -磷酸三鈣/布洛芬復合支架(20:5: 2，w/w/w)的制備:將(2)中所制得的聚乳酸/β_磷酸三鈣/布洛芬復合材料置于快速原型設備(MAM-1I Freeform Fabrication System)的擠料腔中，設置好相關參數,在計算機的控制下，將擠料腔中的材料經噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成三維多孔支架。實施例2:制備聚乳酸/ β -磷酸三鈣/布洛芬復合支架(20:5:3.5，w/w/w)按照實施例1的步驟制備聚乳酸/β_磷酸三鈣/布洛芬復合支架，不同之處在于:20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，隨后加入3.5g布洛芬，最后加入5g β -磷酸三鈣粉體。實施例3:制備聚乳酸/ β -磷酸三鈣/布洛芬復合支架(20:5: 5，w/w/w)
按照實施例1的步驟制備聚乳酸/β_磷酸三鈣/布洛芬復合支架，不同之處在于:20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，隨后加入5g布洛芬，最后加入5gi3-磷酸三鈣粉體。實施例4:制備聚乳酸/ β -磷酸三鈣/布洛芬復合支架(18:2:4，w/w/w)按照實施例1的步驟制備聚乳酸/β_磷酸三鈣/布洛芬復合支架，不同之處在于:18g聚乳酸溶解于180ml的氯仿中，隨后加入4g布洛芬，最后加入2g β -磷酸三鈣粉體。實施例5:制備聚乳酸/ β -磷酸三鈣/布洛芬復合支架(20:0: 5，w/w/w)按照實施例1的步驟制備聚乳酸/β_磷酸三鈣/布洛芬復合支架，不同之處在于:20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，隨后加入5g布洛芬，不加入β-磷酸三鈣粉體。實施例6:制備聚乳酸/介孔生物活性玻璃/布洛芬復合支架(20:5:3，w/w/w)(I)介孔生物活性玻璃(m58S，Si/Ca/P=58:23:9，w/w/w)的合成:(a) 4.25g TE0S、0.49g TEP、2.97g 四水合硝酸鈣、1.5g P123 和 60ml2M HCl 分別溶于15ml去離子水中，35°C水浴攪拌12h ；(b) (a)中的混合液在100°C下水熱處理24h之后，在100°C下干燥；(c) (b)中 得到的粉體在650°C下燒結6h。煅燒后的粉體過400目篩備用。(2)按照實施例1的步驟制備聚乳酸/介孔生物活性玻璃/布洛芬復合支架，不同之處在于:20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，隨后加入3g布洛芬,最后加入5g本實施例中(I)得到的介孔生物活性玻璃粉體。表I示出實施例1 5所制備的支架的孔隙率(I V分別對應于實施例1 5中支架)。各組支架的孔隙率誤差較小，這表明快速原型技術的精確可控性；另外，孔隙率受組分間比例的變化較小，這表明支架孔隙率主要取決于計算機對模型的網格寬度、層高等工藝參數的設置。
權利要求
1.一種制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)有機/無機/藥物復合材料的制備，所述制備步驟包括: (Ia)提供具有生物可降解性的脂溶性有機聚合物材料，將所述有機聚合物材料溶解于相應的有機溶劑，得到濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液； 所述有機聚合物材料選自聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、丙醇酸(PGA)或其組合； 所述有機溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲亞砜、1，4-二氧六環或其組合； (Ib)提供藥物，將所述藥物在上述(Ia)中所得到的聚合物溶液中分散均勻，得到混合溶液； 所述的藥物選自布洛芬(IBU)、慶大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)、或阿侖膦酸鈉(AL)； (Ic)提供具有骨誘導性的無機粉體，將具有骨誘導性的無機粉體在上述(Ib)中所得到的混合溶液分散均勻，得到均勻分散液； 所述具有骨誘導性的無機粉體選自磷酸鈣類生物材料、生物活性玻璃類生物材料或其組合； (Id)采用梯度揮發溶劑的方式去除(Ic)中所得到的混合溶液中的有機溶劑，獲得的方式有機/無機/藥物復合材料； (2)將所述步驟(I)中所獲得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備的擠料腔中，形成具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(Ia)中，所述有機聚合物材料在室溫下溶解于相應的有機溶劑，得到濃度為5% 10%(w/v)的聚合物溶液。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(Ib)中，所提供的藥物是布洛芬(IBU)。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(Ic)中， 所述磷酸鈣類生物材料選自β -磷酸三鈣(β -TCP)、羥基磷灰石(HA)或其組合；和/或 所述生物活性玻璃類生物材料選自介孔生物活性玻璃(MBG)。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(Id)中，包括如下步驟: ①將(Ic)中所得到的混合溶液在設定溫度的水浴中繼續攪拌，使溶劑大量揮發，直至混合溶液粘度增大； ②將①中所得到的混合溶液置于室溫下進一步揮發溶劑，得到復合材料； ③將②中所得到的復合材料置于鼓風干燥箱中繼續揮發溶劑； ④將③中的復合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有機溶劑，得到所述有機/無機/藥物復合材料。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中，將(Id)中所制得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備的擠料腔中，設置好相關參數，在計算機的控制下，將擠料腔中的材料經噴嘴擠出逐層疊加在工作臺上，形成具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機/無機/藥物復合材料中的重量比例為:20:0 5:2 5，依序分別為具有生物可降解性的脂溶性有機聚合物材料、所述具有骨誘導性的無機粉體和藥物的重量比例。
8.—種如權利要求1所述的方法制備得到的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。
9.如權利要求8所述的三維多孔支架，其特征在于，所述有機/無機/藥物復合材料中的比例為:20: (O 5): (2 5)，依序分別為具有生物可降解性的脂溶性有機聚合物材料、所述具有骨誘導性的無機粉體和藥物的重量比例。
10.一種移植物，其特征在于，所述移植物含有如權利要求8所述的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架和接種于所述復合三維多孔支架的干細胞，所述干細胞選自骨髓基質干細胞或脂肪干細胞，并且干細胞的接種量為2 X IO6 5 X IO7個細胞/cm3復合三維多孔支架。
11.一種如權利要求8所述的具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的用途，其特征在于，用 于制備骨移植物的支架。
全文摘要
本發明提供一種制備具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架的方法，所述方法包括以下步驟(1)有機/無機/藥物復合材料的制備，(2)將所述步驟(1)中所獲得的有機/無機/藥物復合材料置于MAM自由成形設備的擠料腔中，形成具有藥物緩釋作用的有機/無機復合三維多孔支架。
文檔編號A61L31/02GK103191470SQ201310116098
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月3日 優先權日2013年4月3日
發明者寧聰琴, 袁萍 申請人:中國科學院上海硅酸鹽研究所