一種蟬蛻中抗凝纖溶組分的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蟬蛻中抗凝纖溶組分，屬于中藥領域，所述蟬蛻中抗凝纖溶組分是通過分離純化方法得到，具體由以下步驟組成：A、提取：稱取蟬蛻藥材細粉，加入蒸餾水，回流提取濾過，合并提取液，濃縮，加入95%乙醇至含醇量為90%，放置過夜后后抽濾，殘渣干燥，得到蟬蛻水提醇沉物，然后加蒸餾水配制成濃度為10mg/ml溶液，離心，取上清液，得到上樣液；B、純化：稱取大孔吸附樹脂，上樣，水洗后收集水洗液，再用乙醇進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液水浴揮干，即得。本發(fā)明的方法操作簡單并且得到的目標物純度較高，用于抗凝，效果好。
【專利說明】一種蟬蛻中抗凝纖溶組分

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥領域，具體涉及中藥有效成分提取領域。

【背景技術】
[0002] 蝶脫為蝶科昆蟲黑蚱Fabricius)的若蟲羽化時脫落 的皮殼，具有疏散風熱，利咽開音，息風止痙等功效，主要含甲殼質、蛋白質、有機酸等成分。 現(xiàn)代藥理學研究表明，蟬蛻除具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解痙等作用外，還具有一定的 抗凝纖溶作用，但目前對其抗凝纖溶有效物質基礎的研究很少。
[0003] 由于大孔吸附樹脂是一種多孔性的高分子材料，具有多孔性和較大的比表面積， 可通過物理吸附等作用從溶液中有選擇性地吸附有機物質，從而達到分離純化的目的，并 在天然產物分離、純化等方面顯示出極大的優(yōu)勢。與葡聚糖凝膠純化技術相比，大孔吸附樹 脂具有成本低，簡便易行等優(yōu)點，大孔吸附樹脂有很多種類，需要研究在分離純化藥物的有 效物質基礎方面探尋更加簡便可行的工藝方法。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種蟬蛻中抗凝纖溶組分。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術方案是： 一種蟬蛻中抗凝纖溶組分，其分離純化方法由以下步驟組成： A、 提取：稱取蟬蛻藥材細粉，加入蒸餾水，回流提取3次，每次lh，濾過，合并提取液，濃 縮至藥液比為1: 1，加入95%乙醇至含醇量為90%，放置過夜后抽濾，殘渣干燥，得到蟬蛻水 提醇沉物，然后加蒸餾水配制成濃度為lOmg/ml溶液，超聲lOmin，離心，取上清液，得到上 樣液； B、 純化：稱取大孔吸附樹脂，徑高比為1:8-12,上樣流速為2BV · 1Γ1，上樣體積為 15-35ml，收集過柱液，再用5-6BV的10-50%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液水浴揮 干，即得。
[0006] 優(yōu)選的，所述步驟B中徑高比為1:12。
[0007] 優(yōu)選的，所述步驟B中上樣體積為25ml。
[0008] 優(yōu)選的，所述步驟B中乙醇為50%。
[0009] 優(yōu)選的，所述步驟B中大孔吸附樹脂為NKA-9型樹脂。
[0010] 作為優(yōu)選方式，所述方法由以下步驟組成： A、 提取：稱取蟬蛻藥材細粉，加入蒸餾水，回流提取3次，每次lh，濾過，合并提取液，濃 縮至藥液比為1:1，加入95%乙醇至含醇量為90%，放置過夜后后抽濾，殘渣干燥，得到蟬蛻 水提醇沉物，然后加蒸餾水配制成濃度為l〇mg/ml溶液，超聲lOmin，離心，取上清液，得到 上樣液； B、 純化：稱取NKA-9型樹脂，徑高比為1:12,上樣流速為2BV ?ΙΓ1，上樣體積為25ml，收 集過柱液，再用5BV的50%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液水浴揮干，即得。 toon] 為驗證該方法的可行性做了以下實驗 1儀器與試藥 1. 1儀器LG-PABER- I型血小板聚集儀（北京中勤世帝科學儀器有限公司）；υν-2000 型分光光度計（上海現(xiàn)科分光儀器有限公司）；800B型離心機（上海安亭科學儀器廠）； ES-120型電子分析天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；DZ-1BC型真空干燥箱（天津市泰 斯特儀器有限公司）；MVS-1型渦旋振蕩器（北京金北德工貿有限公司）；NKA-9型大孔吸附 樹脂（天津市海光化工有限公司）。
[0012] 試藥蟬蛻（由石家莊以嶺股份有限公司提供）；PT試劑盒（上海太陽生物試 劑公司）；ΑΡΤΤ試劑盒（上海太陽生物試劑公司）；Protein Assay Dye Reagent (Bio-red 5000006,北京澤平科技有限責任公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma A7906,北京環(huán)亞泰克 生物醫(yī)學技術有限公司）；乙醇（分析純）；烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）； 枸櫞酸鈉（西隴化工股份有限公司，分析純）；氯化鈣（西隴化工股份有限公司，分析純）； 氯化鈉（西隴化工股份有限公司，分析純）。
[0013] 動物健康家兔（雄性），購自北京海淀興隆實驗動物養(yǎng)殖場，重量約2kg，動物許 可證號：SCXK(京）2011 - 0006。
[0014] 方法與結果 2. 1供試品制備 2. I. 1對照品溶液精密稱取牛血清白蛋白10mg，加適量蒸餾水配制成濃度為Img/ ml溶液，即為對照品溶液。
[0015] 蟬蛻水提醇沉物稱取蟬蛻藥材細粉150g置于5000ml圓底燒瓶中，加入3000ml 蒸餾水，回流提取3次，每次lh，濾過，合并提取液，濃縮至藥液比1:1，加入95%乙醇至含醇 量為90%，置冰箱中放置過夜后抽濾，殘渣干燥，即得蟬蛻水提醇沉物。
[0016] 大孔吸附樹脂上樣液取蟬蛻水提醇沉物適量，加適量蒸餾水配制成濃度為 10mg/ml溶液，超聲lOmin，離心，取上清液，即為上樣溶液。
[0017] 藥效測定用樣品 取大孔吸附樹脂洗脫后所得目標物適量，加生理鹽水配制成 濃度為IOmg/ ml溶液，即為藥效測定溶液。
[0018] 含量測定方法 2. 2. 1最大吸收波長的選擇精密量取對照品溶液和上樣液各0. I mL，分別加入5ml 考馬斯亮藍染色液，混勻后靜置15 min，在20(T900 nm波長范圍內進行掃描，結果兩者均 在588nm處有最大吸收，且陰性對照無干擾。
[0019] 標準曲線繪制精密量取對照品溶液0. 02、0. 04、0. 06、0. 08、0. Iml于IOml試管 中，依次用蒸餾水補至〇. lml，即得濃度為0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. Omg/ml的BSA溶液，備用。 于各試管中分別加入5ml考馬斯亮藍染色液，混勻后靜置15 min,置588nm處測定吸光度， 以蒸餾水為空白對照。以牛血清白蛋白濃度（mg/ml)為橫坐標、吸光度（A)為縱坐標繪制 標準曲線，得回歸方程為y =1. 04x-0. 0198, r=0. 9980。
[0020] 精密度試驗 精密吸取上樣液〇.5mL，重復測定6次，吸光度平均值為0.733， RSD=O. 14%，表明儀器精密度良好。
[0021] 穩(wěn)定性試驗取同一上樣液按上述方法顯色，于0、1、2、3、6、12h共測定6次吸光 度，吸光度的RSD=2. 31%，表明供試品溶液在12h內基本穩(wěn)定。
[0022] 重復性試驗 取同一批次蟬蛻藥材細粉6份，按2. 1. 2制成上樣液測定，計算得 到生藥中蛋白質含量的平均值為9. 15mg/g，RSD=L 90%，表明本法重復性良好。
[0023] 加樣回收率試驗稱取同一批次蟬蛻藥材細粉6份，每份I. 5g，精密加入對照品 溶液10 mL，按2. 1. 2制成溶液，測得平均加樣回收率為96. 28%，RSD=L 16%，符合要求。
[0024] 抗凝纖溶藥效試驗 2. 3. 1血漿的制備取雄性健康家兔耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉，頸動脈取血，3. 8%枸 櫞酸鈉抗凝（1:9)，混勻后以lOOOr/min離心lOmin，取上清液，即得富血小板血漿（PRP) ，以3000r/min離心lOmin，取上清液，即得貧血小板血漿（PPP)。
[0025] 試驗取PPP 100 μ L于測試杯中，加藥效測定溶液10 μ L，37°C預溫3min，加入PT 試劑200μ L(預溫3min)，開始計時，至有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準確記錄凝固時間。以生理鹽 水為陰性對照（每個樣品平行測定6份）。
[0026] 試驗取？?？10(^1^于測試杯中，加藥效測定溶液1(^1^，371：預溫31^11，加入 APTT試劑100 μ L (預溫5min)，孵育5min后加入CaCl2IOO μ L (預溫15min)，開始計 時，至有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準確記錄凝固時間。以生理鹽水為陰性對照（每個樣品平行測定 6份）。
[0027] 血凝一纖溶動態(tài)圖試驗取PRP 150 μ L與藥效測定溶液IOyL混勻，37°C預溫 10min，PPP調零，同時加入0. lmol/L CaCl250 yL，平衡記錄儀記錄動態(tài)圖，直至圖形峰值 持續(xù)穩(wěn)定2min為止所得曲線即為血凝-纖溶動態(tài)圖。根據(jù)動態(tài)圖觀察以下參數(shù):①凝固 穩(wěn)定時間（CST) @凝固時間（CT) (|)最大凝固程度（MCE) ?平均凝固速度（ACR)。以生 理鹽水陰性對照（每個樣品平行測定6份）。
[0028] 結果顯示抗凝纖溶組分可以延長PT、APTT，具有抗凝效果。
[0029] 大孔吸附樹脂純化工藝研究 2.4. 1樹脂預處理大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24h，充分溶脹，用乙醇洗至流出 液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象時為止，最后用蒸餾水洗至無醇味，備用。
[0030] 上樣液濃度考察取適量處理好的NKA-9型樹脂濕法裝于I. 5cmX 30cm層析柱中 (徑高比為1:10)。稱取蟬蛻水提醇沉物150mg分別配制成濃度為5、7.5、10、12.5、15mg/ ml的樣品溶液，以2BV 的流速吸附后，收集過柱液，一定量水洗后收集水洗液，再用6BV 50%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，置588nm處測定過柱液、水洗液與洗脫液的吸光度，按下 式計算樹脂比吸附量與解吸量。將樹脂洗脫液水浴揮干后，按2. 1. 3制備樣品，測定PT與 APTT，結果見表1。結果表明，隨著上樣液濃度的增加，比吸附量逐漸增加，解吸率逐漸下降。 僅上樣液濃度為10 mg/ml的洗脫物可同時延長APTT與PT，故確定上樣液濃度為10 mg/ml。 [0031 ]比吸附量（mg/ml 樹脂）=[Μ- (M a -M 水）]/W 解吸率（％) =M 醇 / [Μ- (Μ 過-M 水）]X 100% 其中：M為上樣液中總蛋白質量（mg) ;MaS過柱液中總蛋白質量（mg) ;M#為水洗液中 總蛋白質量（mg) ;MS為乙醇洗脫液中總蛋白質量（mg) ;W為樹脂的體積（ml)。

【權利要求】
1. 一種蟬蛻中抗凝纖溶組分，其特征在于所述蟬蛻中抗凝纖溶組分分離純化方法由以 下步驟組成： A、 提取：稱取蟬蛻藥材細粉，加入蒸餾水，回流提取3次，每次lh，濾過，合并提取液，濃 縮至藥液比為1: 1，加入95%乙醇至含醇量為90%，放置過夜后抽濾，殘渣干燥，得到蟬蛻水 提醇沉物，然后加蒸餾水配制成濃度為l〇mg/ml溶液，超聲lOmin，離心，取上清液，得到上 樣液； B、 純化：稱取大孔吸附樹脂，徑高比為1:8-12,上樣流速為2BV ? 1T1，上樣體積為 15-35ml，收集過柱液，再用5-6BV的10-50%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液水浴揮 干，即得。
2. 根據(jù)權利要求1所述的蟬蛻中抗凝纖溶組分，其特征在于所述步驟B中徑高比為 1:12。
3. 根據(jù)權利要求1所述的蟬蛻中抗凝纖溶組分，其特征在于所述步驟B中上樣體積為 25ml 〇
4. 根據(jù)權利要求1所述的蟬蛻中抗凝纖溶組分，其特征在于所述步驟B中乙醇為50%。
5. 根據(jù)權利要求1所述的蟬蛻中抗凝纖溶組分，其特征在于所述步驟B中大孔吸附樹 脂為NKA-9型樹脂。
6. 根據(jù)權利要求1所述的蟬蛻中抗凝纖溶組分，其特征在于所述方法由以下步驟組 成： A、 提取：稱取蟬蛻藥材細粉，加入蒸餾水，回流提取3次，每次lh，濾過，合并提取液，濃 縮至藥液比為1:1，加入95%乙醇至含醇量為90%，放置過夜后后抽濾，殘渣干燥，得到蟬蛻 水提醇沉物，然后加蒸餾水配制成濃度為l〇mg/ml溶液，超聲lOmin，離心，取上清液，得到 上樣液； B、 純化：稱取NKA-9型樹脂，徑高比為1:12,上樣流速為2BV上樣體積為25ml，收 集過柱液，再用5BV的50%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液水浴揮干，即得。
【文檔編號】A61K35/64GK104337841SQ201310342936
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月8日 優(yōu)先權日:2013年8月8日
【發(fā)明者】趙韶華, 何亮穎, 曹唯儀, 徐文慧, 王玉蓉, 許紅輝 申請人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司