一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽及其應用，其序列的通式如下：Cn-Trp-Ile-Leu-(Ala)a-(Gly)b-X-Y，其中氨基酸全為L型氨基酸；X為陽離子寡肽部分；Y為蛋白轉導結構域；Cn為碳原子個數為10～20的脂肪酸鏈；a和b代表氨基酸的數目。本發明多肽序列N端修飾加上的脂肪酸長鏈可以增強自組裝過程的疏水相互作用，促進自組裝。發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用，可用于研制新型納米抗菌藥物。本發明所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽制備工藝簡單可行、成本相對較低，其應用能豐富現有的抗菌藥物種類。
【專利說明】一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于自組裝納米多肽領域，具體涉及一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽及其作為抑制金黃色葡萄球菌納米抗菌藥物的應用。
【背景技術】
[0002]自張曙光博士(S.Zhang)第一條自組裝多肽EAK16的發現后，多肽自組裝被廣泛研究，成為生物醫學和材料學等領域的研究熱點，應用包括在載藥、止血、生物支架、抗菌等多個方面。由天然氨基酸(L-型)組成的自組裝多肽的細胞毒性低，降解性可控，運載效率及細胞攝取率高，同時還具有降低藥物毒副作用等優點。在多肽自組裝研究中，新型自組裝納米抗菌肽通過自組裝形成的納米材料由于具有廣譜的抗菌活性、不易導致細菌耐藥性，有望替代傳統抗生素作為一種新型的抗菌劑，因此，它在抗菌藥物開發方面有著巨大的發展前景。
[0003]目前，已知抗菌肽作用機制主要是通過與細菌的細胞膜相互作用、破壞其細胞膜而達到殺菌效果的。在這個過程中，陽離子電荷與疏水性扮演著極其重要的角色。如中國專利CN101054409A和CN102766196A公開了不同序列的陽離子兩親性短肽，并篩選出具有較好抗菌活性的短肽。本發明進一步研究陽離子電荷與兩親性在抗菌肽設計中的重要性，設計出了一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，不僅具有抗菌作用，而且還可以通過不同的脂肪酸修飾來調節其抗菌活性。本發明的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽對于金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌效果。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，以增加自組裝多肽的類型，促進自組裝多肽的應用。
[0005]本發明的目的通過以下技術方案實現:
[0006]一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，其序列的通式如下:Cn-Trp-1le-Leu-(Ala)a-(Gly)b-X-Y,其中氨基酸全為L型氨基酸；X為陽離子寡肽部分；Y為蛋白轉導結構域；Cn為碳原子個數為10~20的脂肪酸鏈；a和b代表氨基酸的數目。
[0007]所述(；為花生酸(C2Q)、硬脂酸(C18)、棕櫚酸(C16)、肉豆蘧酸(C14)或月桂酸(C12)。
[0008]所述(Ala)a-(Gly)b作為疏水部分與親水部分的間隔區，其中a和b的取值范圍為2~12。所述a優選為2、4、6，b優選為3、6、9。
[0009]所述的陽離子寡肽X為4~12個賴氨酸、精氨酸或組氨酸。
[0010]所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述的陽離子寡肽X為9個賴氨酸或9個組氨酸。
[0011]所述Y為TAT (人類免疫缺陷病毒I型反式轉錄激活因子氨基酸序列47~57)、VP22(單純皰疹病毒轉錄調節蛋白)、ANTP43-58 (黑腹果蠅觸足肽)或富含精氨酸的細胞穿膜肽。[0012]所述蛋白轉導結構域Y優選為TAT(YGRKKRRQRRR)，是一種來自人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的轉錄激活物Tat蛋白的蛋白轉導結構域。
[0013]所述陽離子自組裝納米多肽序列為①C16-W-1-L-A2-G3-K9-TAT-NH2,② C16-W-1-L-A2-G6-K9-TAT-NH2,③ C 16_ ff -1 - L - A 4_ G 3_ K 9_ T A T - NH 2、
④C ! 6_ W _ I _ L _ A 2_ G 6_ H 9_ T A T _ N H 2、⑤ C 16_ W _ I _ L _ A 4_ G 3_H 9_ T A T _ N H 2、⑥ C18-W-1-L-A4-G3-H9-TAT-NH2,⑦ C 18_ ff -1 - L - A 2_ G 3_ K 9_ T A T - NH 2、
⑧C18-W-1-L-A2-G6-K9-TAT-NH2,⑨ C18-W-1-L-A4-G3-K9-TAT-NH2 或
⑩C18~W_I_L_A2_G6_H9_TAT_NH2。
[0014]所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽在制備抑制金黃色葡萄球菌的納米抗菌藥物中的應用。
[0015]本多肽自組裝原理是其分子間通過非共價鍵相互作用自發組合形成一種結構明確、構造穩定、具有某種理化性能的分子聚集體或超分子結構。設計合成和構建納米生物醫藥材料如納米自組裝肽通常是以一種“自下而上”的方式完成。分子自組裝的關鍵因素是分子間通過非共價鍵相互作用的化學互補性和結構兼容性。在適當條件下，肽分子間依靠非共價鍵力作用自發地形成具有特定結構、復雜有序且具有某種功能的穩定結構。只要肽分子之間或其中某一片段與另一片段之間存在非共價鍵相互協同作用力，而且肽分子能夠在空間尺寸和方向上實現重排和堆積的導向作用，就能產生肽分子的自組裝。親疏水作用、氫鍵和范德華力等分子間作用力雖然較弱，但其相互協同仍能形成穩定的高級結構。調節親疏水氨基酸的種類、數量和位置等可以得到不同形貌的自組裝體。多肽序列N端修飾加上的脂肪酸長鏈可以增強自組裝過程的疏水相互作用，促進自組裝。
[0016]相對于現有技術，本發明具有如下優點和有益效果:
[0017]( I)本發明所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性細菌)具有較好的抑菌作用，因此，可以用于研制適于臨床上使用的新型納米抗菌藥物，有利于細菌感染疾病的預防和治療。
[0018](2)本發明所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽中帶有疏水性氨基酸W、1、L，其中疏水性W > I > L，疏水性的漸變使得肽鏈相鄰氨基酸之間相互作用力減弱，在形成空間結構時穩定性更好。
[0019](3)本發明所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽加入蛋白質轉導結構域，可以增加細胞膜的通透性，有助于多肽穿過血腦屏障。因此，可以增強該類多肽應用在治療腦部細菌感染疾病的可能性。
[0020](4)本發明所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽的N端以脂肪酸修飾，可以提高肽的疏水性，相比單用疏水性氨基酸修飾效果會更好。用脂肪酸修飾多肽的N端可以使多肽能夠在水性基質中形成膠團，無需實質上的機械作用(例如無需劇烈攪拌，超聲處理等等)，膠團或納米顆粒可以在水性基質中自發形成。
[0021](5)本發明提供了一類新型結構的自組裝納米多肽，增加了自組裝納米多肽的類型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽的三維分子結構示意圖。[0023]圖2是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽的高效液相色譜圖，結果顯示它的純度是95.27%。
[0024]圖3是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽的質譜圖，結果顯示它的分子量為 3677.71。
[0025]圖4是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽在超純水溶液中的原子力顯微鏡納米形貌圖，其中陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①樣品的濃度是0.4mg/ml。
[0026]圖5是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽在超純水溶液中的原子力顯微鏡納米形貌圖，其中陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①樣品的濃度是0.5mg/ml。
[0027]圖6是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽在超純水溶液中的原子力顯微鏡納米形貌圖，其中陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①樣品的濃度是1.0mg/ml。
[0028]圖7是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽圓二色譜圖，該圖表明不同肽濃度對陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①的二級結構的影響。
[0029]圖8是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽圓二色譜圖，該圖表明溫度對陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①的二級結構的影響。
[0030]圖9是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽的圓二色譜圖，該圖表明不同NaCl濃度對陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①的二級結構的影響。
[0031]圖10是本發明所述陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①針對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗的酶標儀數據使用Origins.5軟件作的圖，該圖表明陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①針對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為17 μ M。 【具體實施方式】
[0032]為了更好的理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。
[0033]實施例1
[0034]當X為K9, Y為TAT, Cn為棕櫚酸長鏈，a為2, b為3時，序列如下:C16_W_I_L_A2_G3_K9_TAT_NH2
[0035]陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽①的合成:
[0036]1、材料
[0037]Fmoc-Arg(pbf)_OH(N-荷甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃_5_磺酰-精氨酸)、Fmoc-Leu-OH (N-荷甲氧羰酰基-亮氨酸)、Fmoc-1le-OH (N-荷甲氧羰酰基-異亮氨酸)、Fmoc-Ala-OH (N-荷甲氧羰酰基-丙氨酸)、Fmoc-Gly-OH (N-荷甲氧羰酰基-甘氨酸)、Fmoc-Tyr-OHC N-荷甲氧羰酰基-酪氨酸)、Fmoc-Gln-OHC N-荷甲氧羰酰基-谷氨酰胺)、Fmoc-Lys (Boc) -OH (N-荷甲氧羰酰基-N’ -叔丁氧羰酰基-賴氨酸)>Fmoc-Trp-OH(N-荷甲氧羰酰基-色氨酸)、棕櫚酸、Fomc-Arg (pbf ) Wang-Resin (樹脂)、DBLK (六氫批啶 +DMF)、
[0038]HBTU (O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1-羥基苯并三氮唑)購自上海吉爾生化有限公司；哌啶、醋酸酐、DMF (N、N-二甲基甲酰胺)、TFA (三氟乙酸)、NMM (N-甲基嗎啉)、乙醚、甲醇、DCM (二氯甲烷)購自天津市富宇精細化工有限公司。[0039]2、制備方法
[0040]采用Fmoc (芴甲氧羰酰基)保護的固相合成法，其工藝步驟如下:
[0041](I)稱取 20g0.5mmol/g 的 Fomc-Arg (pbf) Wang-Resin 于妝合成器皿中，取200mlDCM溶漲樹脂30min，然后抽濾，再取用300mlDMF洗滌樹脂，分三次進行，每次的洗滌時間為2min，抽濾干洗滌液后向肽合成器中加入IOOml哌啶/DBLK (體積比1:5)震蕩反應30min，反應結束后，再抽濾出反應液，再用400mlDMF分四次洗滌樹脂，洗畢后取少量樹脂做茚三酮檢測試驗，樹脂呈陽性，向肽合成器皿中加入以下原料:
[0042]

Fmoc-Arg(pbf)-OH 25.95g
HBTU15.16g
HOBT5.40g
NMM4.39ml
DMF160ml
[0043]上述原料加完后，震蕩反應30min，反應結束后，用300ml DMF分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間2分鐘，取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，樹脂呈陰性。
[0044](2)向肽合成器皿中加入5ml哌啶/DBLK (體積比1:5)震蕩反應30min，反應結束后抽濾出反應液，再用40ml DMF分四次洗滌樹脂，洗畢取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，結果樹脂呈陽性，向反應器皿中加入以下原料:
[0045]
(a)Fmoc- Arg -OH25.95g
(b)HBTU15,16g
(c)HOBT5.40g
(d)NMM4 39ml
(e)DMF160ml
[0046]上述原料加完后，震蕩反應40min，反應結束后，用40ml DMF分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間為2min，取少許樹脂做茚三酮檢測，樹脂呈陰性。
[0047](3)變換步驟(2)中的(a)原料，(b) (c) (d) (e)原料及加入量不變，重復步驟(2)的操作；(a)原料依次替換為 Fmoc-Arg-OH (25.95g)>Fmoc-Gln-OH (18.65g)、Fmoc-Arg-OH(25.95g)> Fmoc-Arg-OH (25.95g)> Fmoc-Lys-OH (18.74g)> Fmoc-Lys-OH (18.74g)>Fmoc-Arg-OH (25.95g)> Fmoc-Gly-OH (9.37g)> Fmoc-Tyr-OH (27.92g)> Fmoc-Lys-OH(18.74g)> Fmoc-Lys-OH (18.74g)> Fmoc-Lys-OH (18.74g)> Fmoc-Lys-OH (18.74g)>Fmoc-Lys-OH (18.74g)> Fmoc-Lys-OH (18.74g)> Fmoc-Lys-OH (18.74g)> Fmoc-Lys-OH(18.74g)、Fmoc-Lys-OH (18.74g)、Fmoc-Gly-OH (9.37g)、Fmoc-Gly-OH (9.37g)、Fmoc-Gly-OH (9.37g)、Fmoc-Ala-OH (12.54g), Fmoc-Ala-OH (12.54g), Fmoc-Leu-OH(14.14g)、Fmoc-1le-OH (14.14g)、Fmoc-Trp-OH (29.17g)。即每重復一次步驟(2)的操作，變換一種(a)原料，直至將上述原料都使用一次為止，接著加入棕櫚酸(51.23g)，完成N端修飾；
[0048](4)再重復一次(I) (2) (3)步驟的操作，各步驟的原料及所用原料的量均不變；最后加入5ml哌啶/DBLK (體積比1:5)反應30min，洗凈樹脂，加入160ml醋酸酐/DMF (體積比1:2)反應30min，用40ml DMF洗凈樹脂，再用甲醇洗滌樹脂8次，除去DMF。氮氣吹干后，用TFA (三氟乙酸)/DCM強酸裂解液(體積比1:1 )，裂解3小時，將合成多肽從樹脂上裂解下來，同時脫去所有保護基團，收集溶有合成肽的裂解液，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在濾液中的多肽，再抽濾得到白色固體，即得合成肽的粗品。合成肽粗品經高效液相色譜純化，收集主峰，經過冷凍干燥后，即得到目標合成肽①。
[0049]3、本發明所述其他的脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝納米多肽可以通過替換上述I中的氨基酸及脂肪酸，按照上述2所述制備方法合成純化得到。在此過程中不同的合成實驗參數如下表1所示:
[0050]表1本發明所述部分陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽的不同合成實驗參數
[0051]
【權利要求】
1.一類陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，其序列的通式如下:Cn-Trp-1le-Leu-(Ala)a-(Gly)b-X-Y,其中氨基酸全為L型氨基酸；X為陽離子寡肽部分；Y為蛋白轉導結構域；Cn為碳原子個數為10~20的脂肪酸鏈；a和b代表氨基酸的數目。
2.根據權利要求1所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述Cn為花生酸、硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蘧酸或月桂酸。
3.根據權利要求1所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述a和b的取值范圍為2~12。
4.根據權利要求3所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述a為2、4、6, b 為 3、6、9。
5.根據權利要求1所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述的陽離子寡肽X為4~12個賴氨酸、精氨酸或組氨酸。
6.根據權利要求5所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述的陽離子寡肽X為9個賴氨酸或9個 組氨酸。
7.根據權利要求1~6任意一項所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述Y為TAT、VP22、ANTP43-58或富含精氨酸的細胞穿膜肽。
8.根據權利要求7所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述TAT的序列為 YGRKKRRQRRR。
9.根據權利要求1所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，其特征在于，所述陽離子自組裝納米多妝序列為① C16-W-1-L-A2-G3-K9-TAT-NH2、② C16-W-1-L-A2-G6-K9-TAT_NH2、③C16-W-1-L-A4-G3-K9-TAT-NH2,④ C 16_ ff -1 - L - A 2_ G 6_ H9-T A T - NH 2、⑤ C16-W-1-L-A4-G3-H9-TAT-NH2,⑥ C 18_ ff -1 - L - A 4_ G 3_ H9-T A T - NH 2、⑦C18-W-1-L-A2-G3-K9-TAT-NH2,⑧ C18-W-1-L-A2-G6-K9-TAT-NH2,⑨C18_W_I_L_A4_G3_K9_TAT_NH2 或⑩ C18_W_I_L_A2_G6_H9_TAT_NH2。
10.權利要求1~9任意一項所述的陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽在制備抑制金黃色葡萄球菌的納米抗菌藥物中的應用。
【文檔編號】A61K38/16GK103467579SQ201310376439
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月26日 優先權日:2013年8月26日
【發明者】何道航, 馬詩怡 申請人:華南理工大學